正常与劣变六堡茶挥发性成分与菌群差异及关联分析

六堡茶属黑茶,源于广西梧州六堡,其历史可溯至千年以前,康熙时期《苍梧县志》称其“味醇隔宿而不变,茶色香味俱佳”,嘉庆年间更因独特槟榔香韵跻身全国名茶之列[1]。因其“红、浓、陈、醇”的品质特点,以及具有调节肠道微生态、抗菌抗病毒、调控血糖及血脂水平和降脂减肥[2-4]等多元功效,广受消费者青睐。

香气作为茶叶风味品质的核心指标,其本质是脂肪族、芳香族及萜类挥发性化合物的协同作用体系[5]。挥发性化合物种类及含量的差异导致六堡茶表现出不同的香气。先前已经有关于不同香型的六堡茶挥发性成分及特征香气的关键呈香物质的研究,“陈香”的核心呈香物质为α-雪松醇、β-芳樟醇、二氢猕猴桃内酯、α-萜品醇以及β-紫罗酮[6]。“槟榔香”香型构建以雪松醇为主导,包括α-雪松醇、β-芳樟醇、萘衍生物等8种关键呈香物质[7]。“菌香”特征则受1-辛烯-3-醇等18种组分调控[8]。

六堡茶作为微生物参与发酵的黑茶,其品质的转化与微生物群落结构以及贮藏环境紧密相关[9-10]。六堡茶具有“越陈越香”的香气特征品质,研究表明,适宜的贮藏条件能够促进六堡茶品质优化:贮藏十年以上的六堡茶木香主导,药香渐显[11];辛辣味化合物减少,同时伴随着甜香类风味化合物数量增加[9]。然而,在实际贮藏过程中,若环境等条件控制不当,极易引发品质劣变,具体表现为霉菌滋生、异味(如风霉味)积聚、滋味变差等现象[12]。尤其以温湿度对六堡茶品质影响最显著,一定范围内,贮藏过程温度升高加速化学反应,超阈值含水量将导致茶叶品质发生不可逆劣变。晏玲玲等[13]通过人工促霉实验发现,六堡茶需贮藏在温度<25 ℃、湿度≤70%的环境下,以维持其品质稳定。

六堡茶品质劣变严重影响产品的市场接受度与经济价值。更重要的是,六堡茶品质劣变过程中可能滋生有害微生物及其代谢产物,潜在威胁消费者健康。近年来,与黑茶品质劣变相关的微生物研究越来越受到研究人员的关注,胥伟等[12]证实霉变黑毛茶以曲霉属为优势菌,马婷婷等[14]发现劣变六堡茶中曲霉属、节担菌属丰度较高。黑茶香气品质的形成与微生物密切相关,但不同于普洱茶、茯砖茶,六堡茶风格多变,香气类型复杂多样,又因其生产工艺复杂度程度较大,周期较长,导致系统性跟踪研究更为困难,相关研究进展明显滞后[10],目前关于正常与品质劣变六堡茶之间的微生物群落以及挥发物质的差异以及相关性研究仍显不足。因此本研究以正常与品质劣变的六堡茶为研究对象,利用高通量测序技术和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS),对正常与品质劣变六堡茶的细菌与真菌群落结构和挥发性化合物进行了比较分析,并通过联合分析探讨其潜在关联性,以解析正常与劣变六堡茶中微生物群落差异以及挥发性物质的差异,同时通过关联性分析解析微生物对六堡茶品质劣变的影响和作用机制,以期为六堡茶的品质风险预警与品质稳定性控制提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用六堡茶样品由课题组在某六堡茶生产企业特制而成,原料均为企业标准毛茶原料,符合GB/T 32719.4—2016《黑茶第4部分:六堡茶》的要求。为获取研究所需的品质劣变样品,研究团队在企业产品上市前,从多个生产批次特别收集严格质检过程中认为品质不达标的极少数样品,以供本试验所用。样品统一收集时间:2023年10月。所有样品均按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》进行感官审评,由5位(3女2男)具有丰富审评经验的茶叶专家从外形、汤色、香气与滋味等多个维度对样品进行综合评定。最终,选定同一批次4个感官表现优异、品质特征稳定的正常六堡茶样品(编号C1～C4),以及4个感官特征表现出明显劣变的样品(根据异味强度由高到低依次编号为M1～M4)作为研究对象。

色谱级乙醇,国药集团化学试剂有限公司;癸酸乙酯(99.9%),安谱实验科技股份有限公司;C7～C25正烷烃(99%),上海J&K科学有限公司。所有色谱溶剂均为色谱级,所有化学试剂均为分析级。

1.2 仪器与设备

GR-DA立式高压蒸汽灭菌锅,厦门致微仪器有限公司;ROTINA 380R冷冻离心机,德国Hettich公司;JXFSTPRP-48全自动样品快速研磨仪,上海净信实业发展有限公司;MS204TS/00电子分析天平,美国Mettler Toledo公司;CTC自动进样器、DVB/CAR/PDMS萃取头,广州英骏实验室技术有限公司;8890型GC×GC全二维气相色谱系、HP-5MS型(30 m×250 μm,0.25 μm)一维色谱柱、DB-17MS型(89 m×180 μm,0.18 μm)二维色谱柱、7250型Q-TOFMS四极杆飞行时间质谱,美国Agilent公司;HV系列(1.3 m×0.25 mm)调制柱,上海J&K科技有限公司;20 mL样品瓶,上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 挥发性物质检测方法

1.3.1 HS-SPME 方法

参考之前研究的方法[15],首先,准确称取0.5 g研磨后的茶样置于20 mL顶空瓶中。随后,通过CTC自动进样器向顶空瓶中注入5 mL沸水以及10 μL癸酸乙酯(10 μg/mL)。接着,将活化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头置于密封顶空样品瓶中,在(65±0.5)℃恒温吸附平台持续暴露30 min,完成挥发性组分动态吸附平衡。热脱附阶段将吸附饱和的纤维头精准插入GC进样口(250 ℃),通过高纯He载流进行10 min程序化脱附,确保目标化合物完全转移至色谱柱。实验进行3次技术重复,同步设置空白对照以消除背景干扰。

色谱条件:色谱柱接口处安装HV系列调制器,设定4 s调制周期。气路系统参数设定:进样口维持250 ℃恒温,色谱-质谱传输线控温280 ℃[16]。载气系统采用超纯He(纯度≥99.999%),分流模式10∶1。程序升温步骤如下:初始40 ℃平衡1 min,以3 ℃/min梯度升至180 ℃(保持1 min),随后以20 ℃/min急升至250 ℃(维持1 min),全过程总耗时40.5 min。

质谱检测系统参数:采用电子电离源(EI)工作温度230 ℃,电离能量70 eV。质量分析器选用四极杆装置,控温150 ℃确保稳定性。信号采集系统设置:检测器电压优化至2 409 V,质量扫描窗口设定为m/z 50～550,采用全扫描模式进行动态信号采集。特别设置零溶剂延迟模式以捕获全时段挥发性组分。

1.3.3 定性定量分析

定性分析:质谱数据处理采用三重验证机制:首先通过Canvas软件对全二维质谱数据进行解析,设定信噪比阈值为10∶1进行自动峰识别;其次构建谱图匹配双因子筛选模型,将质谱数据与NIST20数据库进行双向匹配,要求正向匹配系数≥700且反向匹配系数≥800;最后引入保留指数验证体系,基于C7～C25正构烷烃标准品建立保留时间校正曲线,计算各组分线性保留指数,并设置保留指数偏差容许阈值≤30,有效排除异构体与假阳性干扰,最终鉴定到可信度较高结果。

定量分析:主要运用内标法,即以10 μL癸酸乙酯做内标,通过计算挥发性物质与癸酸乙酯的峰面积的比值,对鉴定得到的挥发性化合物的相对含量进行计算,如公式(1)所示。

式中:Ci,挥发性成分的相对含量,μg/kg;R,挥发性成分与内标(癸酸乙酯)峰面积比值;V,内标体积,10 μL;C,内标质量浓度,10 μg/mL;m,茶样添加质量,0.5 g。

1.4 微生物检测方法

1.4.1 六堡茶表面微生物收集

称取15 g六堡茶样品,放入装有135 mL磷酸钾缓冲液的250 mL宽口锥形瓶(提前灭菌,冷却)中,于摇床以200 r/min的转速,振荡混匀30 min,悬浮液经两层灭菌后的无菌纱布过滤,将过滤液收集至50 mL离心管中;随后放入离心机12 000×g(约为9 400 r/min)离心10 min,弃上清液;用pH 8.0磷酸盐缓冲液重悬沉淀,重复上述操作,直至上清液变澄清,最后收集得到的沉淀即为所需的茶表面微生物。

1.4.2 总DNA提取及高通量测序

提取DNA所用试剂盒为土壤基因组提取试剂盒(FastDNATM Spin Kit for Soil)。具体提取方法根据说明书进行如下调整:称取15 g六堡茶样品,放入装有135 mL磷酸钾缓冲液的250 mL宽口锥形瓶(提前灭菌,冷却)中,随后将锥形瓶置于摇床,以200 r/min混匀30 min,悬浮液经两层灭菌后的无菌纱布过滤,去除茶渣,将过滤液收集至50 mL离心管中;随后放入离心机12 000×g(约为9 400 r/min)离心10 min,弃上清液;用pH 8.0磷酸盐缓冲液重悬沉淀,重复上述操作,直至上清液变澄清,最后收集得到的沉淀即为所需的茶表面微生物。

引物设计严格遵循分类学标记原则:真菌ITS区扩增采用ITS1F与ITS2引物对;细菌16S基因V3～V4区选用338F和806R通用引物。经过纯化和定量,构建双末端测序文库(PE250),通过Illumina MiSeq高通量测序技术进行扩增子深度测序,委托上海美吉生物制药科技有限公司完成。

1.5 数据分析

采用Excel对数据进行整理;多元统计建模使用SIMCA 14.1执行监督式正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA);差异显著性评估使用SPSS 25.0;可视化方案基于Graphpad Prism10.1.2,Origin 2022构建;微生物聚类分析及多样性分析在美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com);相关性分析在联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool.)上进行。

2 结果与分析

2.1 挥发性成分组成及差异分析

2.1.1 挥发性成分组成分析

为系统揭示六堡茶在正常与品质劣变状态下的挥发性物质差异,本研究基于GC-MS对8个样品(正常组4个、劣变组4个)进行挥发性成分的定性与相对定量分析,共鉴定出400种化合物。结果显示,两组样品共有物质225种,其中正常样特有61种,而劣变样中新出现114种成分,表明六堡茶品质的劣变伴随着新物质的形成与部分原有物质的丢失。

为明确分布特征,所有挥发性物质根据结构式被归为碳氢类、酮类、醇类、醛类、醚类、酚类、羧酸衍生物、含氧杂环、含氮杂环及其他共10大类(图1-a)。在正常样中,烃类物质最丰富(110 种),其次为酮类和醇类;而在劣变样中,烃类增至 129 种,且醚类与酮类显著增加,反映劣变样品中脂质氧化及次级代谢活性的增强。类似的结构组成差异也在其他后发酵茶中观察到,可能与微生物对脂肪酸及芳香前体的酶促转化有关[11, 17]。相比之下,醇类与羧酸衍生物的种类减少,可能由于发酵过程中这些物质被氧化或转化速率加快。在定量分析方面,劣变六堡茶的总挥发性物质相对含量显著高于正常样,整体增加1 589.11 μg/kg,增幅达62%。如图1-b所示,醚类和烃类是含量升幅最大的类别,这可能与某些微生物对芳香族或脂肪族前体的醚化、热解及还原反应增强有关[18-19]。与此同时,在清香与果香上起关键作用的醇、酮、醛在劣变样中明显下降,可能导致六堡茶口感沉闷、异味增强。

2.1.2 挥发性物质差异分析

为了进一步探究正常与品质劣变六堡茶挥发性成分间的异同,寻找造成劣变的关键挥发性物质,揭示六堡茶品质劣变对香气结构的影响,本研究构建了以正常与品质劣变六堡茶为自变量,因挥发性物质为变量的OPLS-DA判别模型,其模型拟合度参数R2X=0.637,R2Y=0.972,Q2=0.953,证明模型具备良好的解释力与预测稳定性[20],并通过200次置换检验排除了过拟合风险(图2)。得分图中,正常样聚于第二、三象限,而劣变样显著分布于第一、四象限,说明正常与品质劣变六堡茶的挥发性成分之间具有显著差异。

由于不同六堡茶样品中挥发性化合物存在差异,且各化合物对区分正常与品质劣变样的贡献度不同,本研究引入变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)概念来筛选关键差异化合物(VIP值越大,贡献越大,VIP>1即视为重要贡献因子[20])。据此筛选出65个对差异贡献较大的挥发性成分。为聚焦在正常与劣变样品间含量显著变化的差异物质,进一步结合P值(P<0.05)对这65种成分进行筛选,最终鉴定出43个差异挥发性成分(VIP>1且P<0.05),其中有28种挥发性成分在劣变样中含量显著高于正常样,主要10种烃类物质、8种醚类、4种酮类、3种醇类、2种含氧杂环以及1种羧酸衍生物。

2.1.3 正常与劣变六堡茶特征挥发性物质分析

尽管劣变样中部分物质种类和含量有所增加,但并不代表其对整体香气品质具有正向贡献。挥发性成分对风味的影响不仅取决于其含量,更与气味活度值(odor activity value,OAV)密切相关。为此,本研究基于文献及网页整理的阈值信息,计算了每种物质在各样品中的相对气味活度值(relative odor activity value,rOAV),结合所得rOAV对显著差异挥发性成分进行进一步筛选,最终得到16个关键挥发性物质(VIP>1, P<0.05, OAV>1),如表1所示,其中有9个化合物在正常六堡茶种含量高于品质劣变样,包括(3E,5E)-辛-3,5-二烯-2-酮、α-松油醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、2-十一酮、甲基庚烯酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛以及(E)-2-壬烯醛,表现为花果香和脂香;以及呈木香的藏红花醛在正常样中的含量也稍大于劣变样。而在劣变六堡茶样中优势更为明显的主要为被认为具有木香属性的3,4-二甲氧基甲苯、1,7-二甲基萘、β-二氢紫罗兰酮;药香属性的正己醇;化学气味的间苯二甲醚;以及展现出霉味的二甲萘烷醇。

通过比较 rOAV 变化,发现部分物质在劣变样中表现明显高于正常样,主要有呈现霉味的二甲萘烷醇,因其阈值较小,rOAV较高,为品质劣变六堡茶贡献霉气味,导致品质不佳。此外,木香属性的β-二氢紫罗兰酮和1,7-二甲基萘对于劣变茶样气味的不良转变也有影响。

与此同时,花果香以及脂香物质(E,E)-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、(E)-2-壬烯醛和芳樟醇氧化物Ⅱ的rOAV 在正常样中显著高于劣变样,劣变样中花果香的缺少,进一步导致劣变茶样香气失衡,加剧最终不良气味的呈现。

2.2 微生物群落结构组成及差异分析

2.2.1 α-多样性分析

综合Shannon指数、Simpson指数、Ace指数以及Chao1指数,对正常和品质劣变六堡茶的微生物群落进行α-多样性分析。如表2所示,六堡茶的细菌群落的Chao1指数和Ace指数正常样整体高于劣变样,表明品质劣变样中细菌的丰富度低于正常样,然而Shannon指数和Simpson指数在正常和劣变六堡茶之间并无明显差异,表明在正常和劣变六堡茶中的细菌种类的多样性无明显差异。分析造成这种差异的原因可能是劣变导致低丰度细菌物种丢失,但优势物种分布更均匀,二者抵消使整体多样性不变。虽然品质劣变未对细菌群落的表层多样性造成影响,但深层物种库已发生不可逆简化,群落生态功能衰退。正常和劣变六堡茶中真菌种类的相对丰度无明显差异。然而品质劣变样中真菌的多样性整体高于正常样。说明六堡茶品质劣变伴随着微生物群落的变化,为了进一步明确此差异,对正常与品质劣变六堡茶微生物群落组成结构进行检测。

2.2.2 微生物群落组成

利用扩增子测序技术,对正常六堡茶样品和劣变六堡茶样品中的细菌、真菌进行高通量测序分析。由图3可得出相对丰度占比前十的属在微生物群落中的相对丰度。优势菌属糖多孢菌属(Saccharopolyspora)的相对丰度占比在正常样中为88.43%,而在劣变样中则为77.12%,在品质劣变样中相对丰度占比较正常样低的细菌属还有葡萄球菌属(Staphylococcus),低0.48%,埃希氏菌属(Escherichia-Shigella),低1.41%。除此之外,一些占比较大的微生物在品质劣变样中相对丰度较高,比如短杆菌属(Brevebacterium),比正常样高10.41%,南海海洋所菌属(Sciscionella),比正常样高1.58%,未分类链球菌科(unclassified_f__Streptococcaceae)相对丰度占比也高了2.13%,未分类假诺卡氏菌科(unclassified_f__Pseudonocardiaceae)占比高了1.33%,糖单孢菌属(Saccharomonospora)占比也高了0.69%。

六堡茶真菌属中曲霉属(Aspergillus)占绝对优势,在正常与劣变样中相对丰度占比分别为82.47%和50.64%,品质劣变样较正常样低了31.83%,此外节担菌(Wallemia)相对丰度较正常样低了5.15%,芽生葡萄菌属(Blastobotrys)相对丰度也低了2.47%。与此相反,未分类真菌属(unclassified_k__Fungi)相对丰度占比从正常样中的5.94%到劣变样中为18.16%,未分类肉座菌目(unclassified_o__Hypocreales)占比在劣变样中较在正常样中高了22.00%;青霉属(Penicillium)和耐干霉菌属(Xeromyces)相对丰度分别高出4.40%和0.51%。

2.2.3 线性判别分析效应量(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)

为了进一步探明在正常与劣变六堡茶之间呈现显著性差异的微生物类群,对六堡茶的细菌进行LEfSe多级物种差异判别分析。如图4所示,当线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)阈值为3.0时,共有14 个细菌微生物分支具有统计学意义。包括 4个细菌属,可作为微生物指示菌属,其中,埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)和考克氏菌属(Kocuria)是正常茶样的生物标记物,而南海海洋所菌属(Sciscionella),糖单孢菌属(Saccharomonospora)则在品质劣变的茶样中显著富集。

设定LDA>3.0时,共有27个真菌分支可作为指示物用于分析正常与劣变六堡茶真菌群落的差异,其中包括11个真菌属。结合LDA得分图(图4-d),正常茶样中的曲霉属(Aspergillus)真菌在正常与劣变六堡茶茶样中差异效应最大,此外在正常样中优势比在劣变样中优势大的真菌属还有芽生葡萄孢酵母属(Blastobotrys),德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和一株产香酵母(Trichomonascus)。与此相对应,青霉菌属(Penicillium),顶孢霉属(Acremonium),汉斯霉属(Hansfordia),克努菲亚属(Knufia)以及小囊菌目下未分类科(Microascales), 真菌界下未分类属(unclassified_k_Fungi),肉座菌目下一个未分类属(unclassified_o_Hypocreales)均在品质劣变六堡茶茶样中富集。

2.3 挥发性成分与微生物相关性分析

为了进一步探究正常与劣变六堡茶中差异挥发性物质与差异微生物群落之间的相关性,将前述微生物群落相对丰度数据与挥发性成分定量数据进行Spearman相关性分析,如图5所示,细菌中短杆菌属与木香属性的3,4-二甲氧基甲苯和1,7-二甲基萘显著正相关,与正己醇显著负相关;埃希氏菌属与二甲萘烷醇显著负相关,与2-十一酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛显著正相关;糖多孢菌属与呈木香的3,4-二甲氧基甲苯、藏红花醛显著负相关;未分类假诺卡氏菌与3,4-二甲氧基甲苯显著正相关;未分类链球菌科与间苯二甲醚正相关,与2-辛酮负相关。真菌中未分类肉座菌目与间苯二甲醚正相关与2-辛酮、2-十一酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛负相关;青霉属与间苯二甲醚、β-二氢紫罗兰酮正相关,与(E,E)-2,4-庚二烯醛、(3E,5E)-辛-3,5-二烯-2-酮负相关;芽生葡萄孢酵母属与藏红花醛、2-十一酮正相关;曲霉属与芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、α-松油醇显著正相关。

3 讨论与结论

六堡茶贮藏不当导致品质发生劣变,微生物群落结构变化,不良气味产生,六堡茶挥发性成分的变化又与微生物代谢密切相关[21]。为了研究品质劣变六堡茶的微生物群落组成及挥发性成分与正常样之间的差异,对正常与品质劣变六堡茶挥发性成分和微生物群落进行差异分析及相关性分析。

3.1 挥发性成分差异

采用HS-SPME/GC-MS对正常与劣变六堡茶的挥发性成分进行定性与定量分析,碳氢类、醇类、酮类化合物种类较多,是构成六堡茶挥发性化合物的主要成分。比较正常与劣变六堡茶发现劣变样本中检出挥发性物质总数较正常样本多出53种,主要为烃类、酮类和醚类化合物,整体总量高了1 589.11 μg/kg。其中,醚类物高出2倍,烃类高了约6.6%。差异分析显示,具有花果香的芳樟醇、α-松油醇以及芳樟醇氧化物Ⅱ含量明显少于正常样,而木香属性的3,4-二甲氧基甲苯、1,7-二甲基萘、β-二氢紫罗兰酮以及霉味的二甲萘烷醇则在品质劣变样中积累。有研究表明,芳樟醇及其氧化物以及α-松油醇为六堡茶主要醇类化合物[22],来源于微生物糖苷酶作用,赋予六堡茶花果香,特别是在槟榔香六堡茶中含量高于普通六堡茶[7],含量的减少可能与劣变过程中一系列酶促氧化反应相关。1,2,3-三甲氧基苯、3,4-二甲氧基甲苯、1,2-二甲氧基苯、3,4,5-三甲氧基甲苯等甲氧基苯类化合物在品质劣变六堡茶中含量高于正常样。研究表明,甲氧基苯类化合物作为黑茶特征香气化合物,来源于微生物作用下儿茶素降解及甲基化反应,常与霉味、泥土气味以及陈香相关[23]。推测六堡茶品质劣变过程与微生物活动相关,伴随着儿茶素含量的变化,同时甲氧基苯类化合物在品质劣变六堡茶中积累以及芳樟醇类物质含量的降低进一步加剧了品质劣变六堡茶中不良气味的产生。

3.2 微生物群落差异

本研究通过Illumina MiSeq高通量测序平台,结合α-多样性指数及LEfSe分析,全面揭示了正常及劣变六堡茶样品的微生物群落多样性与结构组成差异及关键指示菌属。品质劣变六堡茶细菌群落丰度小于正常样,优势细菌属糖多孢菌属(Saccharopolyspora)在劣变样中相对丰度占比比正常样低11.31%。指示菌属分析显示,埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)和考克氏菌属(Kocuria)在正常样本中富集,南海海洋所菌属(Sciscionella),糖单孢菌属(Saccharomonospora)则在品质劣变的茶样中显著富集。在真菌群落结构方面,劣变样多样性高于正常样,优势属曲霉属(Aspergillus)在劣变六堡茶中相对丰度显著低于正常样(低约31.83%)。曲霉属(Aspergillus)、芽生葡萄孢酵母属(Blastobotrys)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和1株产香酵母(Trichomonascus)为正常样本指示菌;在劣变状态下显著富集青霉属(Penicillium),顶孢霉属(Acremonium),汉斯霉属(Hansfordia),Knufia以及小囊菌目下未分类科(Microascales),真菌界下未分类属(unclassified_k_Fungi)及未分类肉座菌目(unclassified_o__Hypocreales)。

其中正常样指示细菌埃希氏菌属参与了茶样中纤维素的分解,有利于成品茶风味形成,据研究,其在普洱茶发酵中可用于标志发酵进程未受到杂菌污染[24]。考克氏菌可以通过水解蛋白质,从而改变茶中氨基酸的含量,进一步影响茶汤的滋味[25];参与普洱茶发酵,与芽孢杆菌属、葡萄球菌属共同构成优势菌群,能有效抑制有害菌生长,维持发酵菌群平衡[26]。作为正常六堡茶优势细菌,抑制杂菌生长,有益于品质稳定。

真菌中曲霉属为优势菌,在正常样中富集。尽管马婷婷等[14]的研究表明曲霉属在霉变样品中相对丰度较高(93.59%),但其在正常样品中仍为优势菌属(92.88%)。值得注意的是,该研究发现赤曲霉(Aspergillus ruber)在霉变样中丰度显著低于正常样。这一矛盾现象的产生可能是由于工艺不同,导致菌种存在差异。后续可通过统一菌种分类层次,并结合环境参数构建整合研究框架,精准解析曲霉属真菌对六堡茶霉变的真实作用机制。但不能否认的是曲霉属对于黑茶品质形成具有重要意义,前人已通过大量实验证实这一点。LI等[27]通过对茯砖茶微生物和关键香气成分的鉴定,认为曲霉属的代谢作用,有助于茯砖茶特征香气的形成。曲霉属在普洱茶发酵中能促进芳樟醇类香气成分的合成[20]。作为六堡茶优势微生物,曲霉属真菌促进六堡茶中茶多酚物质转化为非脂型儿茶素及茶褐素,改善汤色和滋味[28]。芽生葡萄孢酵母属通过分泌多酚氧化酶,促进茶多酚类向茶黄素、茶红素等色素物质转变,赋予茶汤红褐色泽;分泌纤维素酶和果胶酶,降解纤维素和果胶,释放可溶性糖类,增加茶汤甜度[29]。德巴利氏酵母属在黑茶发酵过程中与醇类、酮类挥发性成分形成相关[30]。Trichomonascus用于发酵豆豉,显著增加酯类、酮类,降解黄酮类[31]。以上正常样指示菌均有益于六堡茶品质的形成,其丰度的下降,将导致六堡茶茶汤颜色变浅,滋味醇和感不足,变得寡淡,进一步解释六堡茶品质劣变与微生物变化相关。

同时,通过比较在正常与品质劣变样中指示菌属的生物特性,发现在品质劣变六堡茶中富集的微生物菌属更适应高温高湿的环境,如:青霉属真菌对于温湿度具有较好的适应性且偏好高湿度环境[32]。南海海洋所菌属与放线菌门的其他菌属相似,都喜温暖、潮湿的环境。高湿环境更有利于顶孢霉属菌的生长[33]。汉斯霉属和Knufia能适应高温高湿高盐等极端环境[34]。由此也可推出,六堡茶品质的劣变与贮藏过程中温湿度的不正常变化相关。

3.3 相关性分析

在微生物-风味关联方面,相关性分析结果表明,在细菌层面,短杆菌属与木香成分呈显著正相关,糖多孢菌属与木香成分呈负相关,埃希氏菌属与霉味物质(二甲萘烷醇)呈显著负相关,与果香物质正相关。曲霉属真菌与花果香物质(α-松油醇、芳樟醇及其氧化物)呈显著正相关。研究发现,小冠曲霉发酵对表现为花果香的挥发性化合物的形成具有促进作用,有利于改善夏秋茶品质[35],曲霉属中的黑曲霉促进芳樟醇及其氧化物的生物合成与转化[20],这与本研究结果相似。青霉属与花果香物质显著负相关,与木香的β-二氢紫罗兰酮和化学气味的间苯二甲醚呈显著正相关。

六堡茶贮藏过程中挥发性成分的变化不仅体现在成分种类和含量的波动上,更与微生物群落结构密切相关。不同微生物可能通过其代谢活性主导特定香气物质的合成或降解,进而影响六堡茶的品质改变。研究结果为六堡茶科学贮藏、品质调控与劣变机制解析提供了理论依据和数据支撑。未来可进一步结合对与六堡茶滋味品质相关的非挥发性成分分析,解析六堡茶品质劣变机制。

3.4 总结与展望

本研究综合运用了微生物高通量测序技术、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术,对正常与劣变六堡茶在微生物群落结构、挥发性化合物方面进行了系统性比较分析。通过差异性筛选与多组学联合分析,识别出与六堡茶品质劣变密切相关的特征微生物及关键差异代谢物,并进一步探讨其潜在关联机制。研究结果为六堡茶品质监测与把控提供了理论依据和数据支撑。劣变六堡茶挥发性物质中醚类、酮类和烃类较正常样多,但是芳香醇类含量低于正常样;具体表现为具有霉味特征的物质富集,而花果香与脂香物质则少于正常样。在微生物群落结构方面埃希氏菌属、考克氏菌属、曲霉属、芽生葡萄孢酵母属等在品质正常六堡茶中富集,劣变样指示菌包括青霉属、南海海洋所菌属、顶孢霉属、汉斯霉属和Knufia更能适应高温高湿等环境。相关性分析揭示,曲霉属与芳香类物质显著正相关,青霉属则与花果香类物质呈显著负相关。本研究提出的关键劣变标志物和指示菌属,可为后续开发品质在线监测、生物调控与干预策略提供基础。

然而六堡茶贮藏过程中微生物主导的代谢机制有待进一步挖掘,关键代谢通路与功能菌群的验证仍需依赖代谢流、宏转录组等高维组学补充。后续研究可进一步探索控制性干预手段,如优化仓储环境、构建优势微生物菌群,以实现六堡茶风味品质的精准调控与标准化提升。

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