在食品、医药、化妆品等诸多领域,天然植物提取物的应用日益广泛。肉桂精油作为一种天然植物精油,含有丁香酚、肉桂醛等多种活性成分,具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种功能,但由于其易挥发、水溶性差和不稳定的特性,实际应用的效果和范围均受到限制[1]。Pickering乳液作为一种特殊的乳状液稳定体系,使用固体颗粒代替传统乳化剂来稳定油水界面,在食品领域Pickering乳液主要使用多糖、蛋白质等作为乳化剂。与表面活性剂稳定的传统乳液相比,固体颗粒吸附在油水界面后,能够有效抑制Pickering乳液的液滴聚结、分层等不良现象,乳液稳定性相对更好且乳液结构更易调控[2]。大量研究表明,以Pickering乳液作为载体封装肉桂精油,能够有效改善其稳定性及适用性,从而拓宽其在食品、医药等多领域的应用前景[3-4]。
我国是柑橘种植大国水果,在加工生产中可产生约占柑橘全果重30%~50%的副产物。其中,柑橘皮渣(citrus peel,CP)的主要成分是膳食纤维(如果胶、纤维素、木质素、半纤维素等),约占皮渣干重的40%~60%[5]。柑橘纤维具备良好的水合能力和持油性,含有天然多酚、黄酮,具备一定抗菌和抗氧化能力,已被广泛应用于食品体系中。纳米技术的发展为果蔬副产物的增值化利用开辟了新方向,常见的技术路线是将果蔬副产物中的水不溶性残渣(主要是纤维素)转化为纳米纤维素,实现废弃物的资源化利用,但缺乏果蔬皮渣全组分利用相关研究[6]。
目前,柑橘果皮来源的膳食纤维成分作为天然乳化剂的潜力已得到广泛关注。CEN等[7]使用β-环糊精改性柑橘果胶,有效提高了颗粒的双润湿性,并成功制备出可用于3D打印的Pickering乳液。ZHANG等[8]系统比较了柑橘皮提取出的纤维素、半纤维素和果胶对Pickering乳液的稳定作用及机制,研究发现,与单个组分相比,3种膳食纤维的组合具有更好的乳化效果。考虑到纤维素、果胶以及半纤维素稳定Pickering乳液的协同作用以及CP中多酚等物质的天然生物活性,基于清洁标签配料的简易制备理念和绿色属性,本研究利用高能机械湿法球磨技术实现柑橘皮渣基纳米颗粒(citrus peel residue-based nanoparticles, CPN)的绿色制备,进一步利用高速剪切乳化法制备葵花籽油/肉桂精油Pickering乳液,考察肉桂精油占比对乳液的微观结构、流变学特性和抗氧化性等性质的影响,并评估乳液在不同环境下的适应性,以期为果蔬皮渣高值化利用和食品乳液加工应用提供参考。
CP,当地水果超市免费提供;葵花籽油,重庆市北碚区永辉超市;肉桂精油,南京草木源生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
200T多功能粉碎机,永康市铂欧五金制品有限公司;XQM-0.4行星式球磨仪,长沙天创粉末技术有限公司;JY92-IIN超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Spectrum100傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR),美国珀金埃尔默股份有限公司;T18高速分散器,美国IKA公司;Nano ZS马尔文激光粒度仪,英国Malvern公司;BX53荧光正置光学显微镜,日本Olympus公司;Dimension Edge原子力显微镜(atomic force microscope, AFM),德国Bruker公司;UV-2450紫外分光光度计,日本岛津公司;MultifugeX3R通用台式离心机,美国赛默飞世尔科技有限公司;MCR302模块化旋转与界面流变仪,奥地利Anton Paar公司。
1.3.1 CPN的制备
将收集到的CP在60 ℃下烘干,用多功能粉碎机粉碎。取50 g CP与1 L蒸馏水混合,于80 ℃水浴2 h以除去部分水溶性物质,纱布过滤、洗涤至滤出液呈无色,将过滤残渣烘干、粉碎、80目过筛,得到以膳食纤维为主要成分的柑橘皮粉,进一步利用湿法球磨制备CPN[9]。选取直径分别为7、3、1 mm的氧化锆球,按照5∶4∶3的质量比例进行搭配,同时确保氧化锆球与CP质量比为12∶1。在室温条件下取1 g CP与20 mL蒸馏水一起放入球磨仪,设置转速为400 r/min,运行模式为每工作20 min暂停10 min,累计球磨时长2 h。球磨后获得的悬浮液用超声波处理(300 W,40 min)获得最终样品CPN。部分样品进行冷冻干燥,用于后续结构表征。
1.3.2 结构表征
1.3.2.1 FTIR表征
采用KBr压片法,将5 mg CPN与500 mg KBr充分混合后压片成型,将制备好的样品放入傅里叶变换红外光谱仪,在4 000~400 cm-1范围内,以4 cm-1的分辨率进行扫描分析。
1.3.2.2 AFM表征
CPN悬浮液(0.01%)经超声波均匀分散后滴几滴在云母片基底上并室温干燥5 h,利用AFM在轻敲模式下观察样品的微观形貌。
1.3.3 制备Pickering乳液
以颗粒质量分数2.5%的CPN悬浮液为水相,油相体积分数为50%,以葵花籽油和肉桂精油作为混合油相制备水包油型(O/W)Pickering乳液。葵花籽油∶肉桂精油(S∶C)体积比分别设置为5∶0、4∶1、3∶2、2∶3和1∶4(体积比),利用高速分散器12 000 r/min均质2 min完成乳化,乳液贮藏在4 ℃冰箱中备用。
1.3.4 乳液液滴尺寸分布
利用马尔文激光粒度分析仪测定乳液的粒径大小并记录粒径分布曲线。测试参数设置:25 ℃,相对折射率1.108,搅拌速度2 400 r/min,选取体积平均粒径D(4,3)表征乳液液滴的粒径,按公式(1)计算:
(1)
式中:ni,第i个粒径区间的颗粒数量;di,第i个粒径区间的平均粒径。
1.3.5 乳液微观结构表征
采用光学显微镜来获取其微观图像。取出40 μL的乳液样品滴加在洁净的显微镜载玻片上,放大20倍,仔细观察乳液的微观结构。
1.3.6 乳液流变性能
选用直径为25 mm的PP25锥板,量取新鲜乳液放置在平板上,锥板间隙调整到1.0 mm,维持0.5%的稳定压力。在0.1~100 rad/s范围内对乳液进行剪切黏度的测试,在0.1~100 rad/s内开展频率扫描,测定乳液的储能模量(G′)和损耗模量(G″),测试温度为25 ℃。
1.3.7 乳液稳定性测试
1.3.7.1 贮藏稳定性
取10 mL乳液于密封样品瓶中,在4 ℃下放置1、7、14 d,观察乳液外观、光学显微镜和粒径分布评估乳液贮藏稳定性。
1.3.7.2 热稳定性
将新鲜乳液在4 ℃下静置2 h,然后分别在20、40、60、80 ℃的下水浴放置30 min后冷却至室温,利用乳液外观和光学显微镜评估其热稳定性。
1.3.7.3 pH稳定性
用1 mol/L HCl或NaOH溶液调节新鲜乳液至不同pH值(3、5、7、9),利用乳液外观和光学显微镜评估其pH稳定性。
1.3.7.4 离心稳定性
对新鲜乳液进行离心处理(2 000 r/min),离心时间为2、4、6、8 min,观察乳液离心前后的外观变化。
1.3.8 乳液抗氧化活性研究
1.3.8.1 DPPH自由基清除率测定
配制浓度为0.5 mmol/L的DPPH溶液。空白对照为0.5 mL去离子水和4 mL DPPH溶液;实验组由0.5 mL样品与4 mL DPPH混合而成。在常温下避光反应30 min后,使用无水乙醇作为空白校准,测定反应溶液在517 nm处的吸光值。DPPH自由基清除率的计算如公式(2)所示:
DPPH自由基清除率![]()
(2)
式中:A0,空白对照组吸光度值;AX,实验组的吸光度值。
1.3.8.2 ABTS阳离子自由基清除率测定
将浓度为7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液小心混合,然后将溶液放于常温且避光的环境下静置12 h,使用超纯水对该母液进行浓度稀释,直到溶液在734 nm处吸光度值达到(0.70±0.02),即可得到ABTS工作液。量取0.5 mL样品作为实验组,相同体积超纯水作为空白对照组,分别与6.0 mL ABTS稀释液充分搅拌混合均匀,在30 ℃下反应15 min,在734 nm处测量吸光值。ABTS阳离子自由基清除率的计算如公式(3)所示:
ABTS阳离子自由基清除率![]()
(3)
式中:A0,空白对照组吸光度值;AX,实验组的吸光度值。
所有试验和测量至少进行3次,数据以“平均值±标准偏差”表示;使用Origin 2021和SPSS Statistics 27等软件进行数据分析。
如图1所示,球磨处理前后(即CP和CPN)特征峰的位置和峰型基本相同,说明处理前后样品基团结构未发生明显变化。在3 400 cm-1处的吸收峰主要来源于纤维素骨架上—OH基团中氢键拉伸振动;经过球磨处理后,该吸收峰形态由宽广平滑转变得更为尖锐,主要是部分糖苷键在球磨过程中断裂,氢键结合强度提升[10]。2 925.3 cm-1处的吸收峰对应于C—H的伸缩振动[11];1 629.8 cm-1处的吸收峰来源于糖醛酸中C
O的非对称伸缩振动;1 402.5 cm-1处的吸收峰是由木质素中苯环骨架的伸展振动所产生的[12];1 100.3 cm-1处的吸收峰表明存在纤维素及半纤维素中糖苷键C—O—C的拉伸振动;765.7 cm-1处的特征峰是由纤维素β-糖苷键振动形成的。
图1 CP和CPN的FTIR图谱
Fig.1 FTIR spectra of CP and CPN
如图2所示,CPN呈现典型的细丝状纤维结构,同时有一些球形或不规则的细微纳米颗粒分布在纤维表面和整个体系中,主要是CP中的果胶、半纤维素和木质素成分。其中表面平均粗糙度(Ra)为1.55 nm,均方根粗糙度(Rq)为2.25 nm,这是球磨处理过程中纤维素机械断裂导致其表面发生显著起伏造成的,同时一些表面结合的木质素、半纤维素等也会造成颗粒粗糙度增加[13]。表面积(25.06 μm2)与投影面积(25.00 μm2)比值接近1,说明该纤维素材料结构较为致密,孔隙率较低,但仍然存在局部纳米级突起的三维结构,这可能是球磨导致的纤维素微纤维断裂或颗粒团聚所致[14]。
a-二维图像;b-三维图像
图2 CPN的AFM图
Fig.2 AFM diagram of CPN
图3是不同油相体积比乳液的外观、微观和粒径分布结果。所有乳液的外观在贮藏期内保持稳定,没有出现明显分层现象(图3-a)。结合光学显微镜图片(图3-b)和乳液粒径分布图(图3-c)可知,和对照组相比(S∶C=5∶0),油相添加肉桂精油后,乳液液滴的粒径显著减小,乳液液滴的D(4,3)值从113 μm减小到45~50 μm左右。贮藏14 d后,乳液粒径有所增加,变化范围在2~20 μm之间,说明乳液出现了轻微的絮凝和聚结现象[15],但总体贮藏稳定性较好。鉴于单位质量固体颗粒覆盖的界面面积相对固定,乳液液滴尺寸的减小可能与肉桂精油密度相对较低有关[16]。对照组的粒径分布曲线呈双峰特征,添加肉桂精油后,乳液呈现出多峰型分布特征,在1~10 μm范围内有2个弱峰,主峰位置向小尺寸方向移动,这可能是肉桂精油中的两亲性成分(如肉桂醛)能够吸附在油水界面,与CPN协同作用,降低界面张力,使得乳液液滴尺寸减小[17-18]。有研究表明,当肉桂精油浓度提升时,其丁香酚和肉桂酸分子中的—OH、—COOH含量随之升高,液滴间静电排斥作用增强。在电荷稳定机制作用下,液滴聚结现象受到有效抑制,最终形成粒径更细密的乳液体系[19]。
a-外观;b-微观结构;c-粒径分布
图3 不同油相体积比乳液的贮藏稳定性
Fig.3 Storage stability of emulsion with different oil volume ratios
如图4所示,当处于较低的剪切速率时,所有乳液均呈现出相对较高的黏度,随着剪切速率增加表现出明显的剪切稀化现象。这是由于高剪切力会破坏乳液的缠结网络结构,导致其黏度降低[20]。其中,与葵花籽油为油相的乳液(S∶C=5∶0)相比,添加了肉桂精油的乳液黏度相对提高;且随着肉桂精油浓度的增加,乳液黏度越高,这可能是乳液液滴粒径相对较小且数量更多造成的,此时乳液网络结构也更紧密稳定[21]。
图4 不同油相体积比乳液的剪切速率-黏度曲线
Fig.4 Shear rate-viscosity curves of emulsions with different oil volume ratios
如图5所示,在测试频率范围内(0.1~100 Hz),肉桂精油占比相对较低的乳液(S∶C=5∶0~3∶2)的G′值>G″值,表明乳液体系内部凝胶网络结构的形成,使乳液具有一定的黏弹性和类固体性质。随着肉桂精油占比逐渐增加,乳液G′和G″值也随之增加,这表明乳液液滴之间的交联网络变得更为紧密。然而,在相对较高频率下,S∶C为2∶3和1∶4的乳液的G′值下降,而且G″低于G′,出现了G′和G″交叉的情况,可能是肉桂精油占比过高会削弱乳液的凝胶网络结构,这与乳液相对分散的液滴网络结构有关(图3)。
图5 不同油相体积比乳液的频率扫描曲线
Fig.5 Frequency scanning curves of emulsions with different oil volume ratios
如图6所示,不同油相体积比的乳液液滴尺寸经20~60 ℃处理后相对稳定,80 ℃处理30 min后液滴尺寸相对增加,其中,对照组(S∶C=5∶0)乳液液滴尺寸变化更为显著。高温加剧了分子间热运动,乳液液滴之间碰撞增加,颗粒之间的氢键网络和乳液的凝胶网络结构被破坏,液滴发生聚并,乳液稳定性下降[22]。相比而言,添加了肉桂精油的乳液组液滴变化相对较小,说明肉桂精油增强了乳液的网络结构,限制了液滴运动和颗粒解吸重排[23]。此外,经热处理后,所有乳液均未出现分层析水或析油的情况,说明CPN稳定的Pickering乳液具有良好的热稳定性。
图6 不同油相体积比乳液的热稳定性
Fig.6 Thermal stability of emulsions with different oil volume ratios
如图7所示,所有乳液在pH 3~9下均表现出良好的稳定性,外观上没有明显变化。随着pH值从3升高到9,乳液液滴尺寸呈现逐渐增大的趋势,其中肉桂精油占比相对较低(S∶C=5∶0~3∶2)的乳液变化更为明显。pH的变化会改变纤维素在水相中的构象和带电情况,进而影响颗粒在油水界面的吸附行为和乳液的稳定状态。酸性条件下,CPN表面负电荷减少,水-油界面相互作用主要由氢键和疏水作用主导,长纤丝状纳米纤维素及果胶等成分吸附于界产生的空间位阻使得乳液保持良好的稳定性[24]。但液滴间的静电斥力较弱更易絮凝,因此显微镜观察视野中可见的独立液滴较少。pH增加到7,CPN中部分质子化羧基发生去质子化,液滴间的静电斥力增大阻碍其紧密堆砌,更易聚并形成较大的油滴[25]。碱性条件下,柑橘纤维更易吸水溶胀而变得疏松,削弱了液滴间空间位阻作用,同时颗粒表面带大量负电荷,强静电斥力会阻碍颗粒在界面的吸附并影响界面膜的稳定,因此出现乳液液滴增大且不均匀的现象[26-27]。
图7 不同油相体积比乳液的pH稳定性
Fig.7 pH stability of emulsion with different oil volume ratios
在离心力作用下,乳液中液滴碰撞频率增加,聚结速率加快,表现为离心后乳液分层明显,乳液体系失稳[28]。较大液滴的乳液在相同离心条件下更易发生分层。如图8所示,CPN稳定乳液在2 000 r/min下离心2、4、6、8 min。所有乳液在离心2 min时均出现一定程度的脱油现象,但随肉桂精油占比逐渐增加,乳液的析水、析油现象逐渐减弱。S∶C比例为5∶0、4∶1、3∶2时有水相析出,S∶C比例为2∶3、1∶4时无水相析出且油相析出较少。随着离心时间的延长,乳液析出的油相也逐渐增加,但肉桂精油占比增加会减弱油析现象。此外,乳液析水现象在S∶C比例为2∶3、1∶4时仍未出现,说明当前乳液具有很好的持水性。这可能是肉桂精油的加入增强了颗粒间的界面相互作用,使乳液具有更强的界面膜和网络结构,从而进一步增强了乳液的稳定性。
图8 不同油相体积比乳液的离心稳定性
Fig.8 Centrifugation stability of emulsion with different oil volume ratios
由图9-a可看出,所有乳液均具备较高的DPPH自由基清除活性,其中仅添加了葵花籽油(S∶C=5∶0)的乳液的DPPH自由基清除率为74.6%,这是CPN中含有橘皮中的天然抗氧化活性成分(如橙皮苷、多酚等)造成的。而添加了肉桂精油的乳液的DPPH自由基清除率高达96.8%,更强的自由基清除能力依赖于肉桂精油所含的丰富抗氧化活性物质。乳液中肉桂精油占比越高,对DPPH自由基的清除能力越强,具备良好的抗氧化性能。此外,所有乳液对ABTS阳离子自由基也有一定的清除能力(图9-b)。随肉桂精油浓度增加,乳液的ABTS阳离子自由基清除活性也逐渐增加,从14.6%上升到87.0%,但所有乳液的ABTS阳离子自由基清除率均小于DPPH自由基清除率,这可能是因为肉桂精油和CPN里的抗氧化活成分对不同自由基的亲和力不一样造成的。
a-DPPH自由基清除率;b-ABTS阳离子自由基清除率
图9 乳液的抗氧化活性
Fig.9 Antioxidant activity of emulsion
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
以CP为原料利用机械球磨法制备得到CPN,通过一步均质法制备CPN稳定的Pickering乳液,考察乳液中不同葵花籽油/肉桂精油比例对乳液微观结构、流变学、稳定性和抗氧化活性的影响。CPN呈现明显的纤维细丝状且表面附着一些球形或不规则的纳米颗粒,属于典型的天然复合纳米胶体颗粒。以其稳定Pickering乳液,油相中添加肉桂精油后,乳液液滴尺寸大幅度减小,乳液稳定性保持较好。与仅含有葵花籽油的乳液相比,添加肉桂精油组的乳液的温度、pH和离心稳定性均有所提高,乳液环境稳定性较好,同时乳液流变学特性得到改善。此外,直接来源于CP的CPN的天然抗氧化活性导致其稳定乳液具有一定的抗氧化活性,添加肉桂精油后乳液的抗氧化活性明显增强。当前研究开发了一种可用于稳定乳液的CP基清洁标签功能性乳化配料CPN,能够有效包埋负载精油,在功能性食品领域具有重要应用前景。后续研究可进一步分析CPN稳定Pickering乳液的机制和实际应用。
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