高内相乳液(high internal phase emulsions,HIPEs)是内相体积分数超过74%的乳液体系,凭借其液滴紧密堆积、独特的凝胶网络结构及自支撑能力、特殊质地等区别于传统乳液的特性,在营养递送系统、脂肪替代品等领域应用广泛[1]。肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)作为肉类中的主要结构蛋白,具有优异的两亲性和凝胶特性,是制备Pickering乳液的理想原料[2]。没食子酸(gallic acid,GA)作为天然多酚,可通过与蛋白质氨基结合增强其功能特性[3]。黄原胶(xanthan gum,XG)作为常用食品增稠剂,能提升体系稳定性[4]。将三者协同构建高内相Pickering乳液,契合天然健康食品发展趋势,同时满足3D打印墨水对稳定性和流变学的要求,具有重要理论与实践价值。
然而,单一蛋白质稳定的HIPEs常存在环境适应性差、长期储存易团聚等问题,限制了其在3D打印中的应用[5]。研究表明,蛋白质与多糖复合作为共稳定剂可协同改善HIPEs的结构与性能,目前已有多项研究证实蛋白质-多糖复合物稳定HIPEs的可行性:WANG等[6]发现低剂量魔芋葡甘聚糖可显著增强MP基HIPEs的稳定性,其作用机制与多糖分子对蛋白质界面膜的强化作用相关;HUANG等[7]利用山核桃蛋白/XG复合物构建了高稳定HIPEs体系,证实多糖通过调控乳液zeta-电位绝对值增强胶体稳定性;此外鼠李糖脂[8]等多糖也被证实可与蛋白质协同优化HIPEs性能,为天然复合稳定剂的选择提供了多元思路。
XG作为具有双螺旋结构的非凝胶型多糖,在调控乳液流变特性方面具有独特优势[9]。但目前关于单一XG质量分数梯度对MP基Pickering HIPEs性能的调控研究尚不系统,且XG与能通过酚羟基与蛋白质结合的天然多酚GA协同影响乳液3D打印适配性的机制尚未明确。
已有研究表明,食品墨水的弹性模量(G′)需大于黏性模量(G″)才能实现稳定成型,以便平衡挤出性能与保形[10]。基于此,本研究以MP为基底,引入GA优化蛋白质界面活性,通过设置0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%(质量分数,下同)的XG质量分数梯度,构建高稳定的MP-GA-XG复合Pickering高内相乳液。通过系统分析乳液的zeta-电位、荧光特性、流变行为(剪切变稀、G′与G″变化)及微观结构[粒径分布、激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)图像],探究XG质量分数对乳液性能的调控机制,并结合3D打印建模与成型实验,筛选适宜食品3D打印的乳液配方。旨在为天然组分协同稳定HIPEs的开发提供理论支撑,同时为3D打印功能性食品墨水的设计提供新的技术路径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡胸肉(新鲜度1级,屠宰后24 h内)、大豆油,当地生鲜超市;GA(纯度≥98%)、XG(黏度≥1 200 mPa·s),上海源叶生物科技有限公司;Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、MgCl2、EDTA(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;尼罗红(纯度≥95%)、尼罗蓝(纯度≥95%),美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
XKH-F5201绞肉机,佛山市聚亿轩电器有限公司;XHF-DY高速分散器,宁波新芝生物科技股份有限公司;H2050R大容量高速台式冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;DF-101S集热式恒温磁力搅拌器,武汉科尔仪器设备有限公司;贝克曼库尔特DelsaTM Nano zeta-电位分析仪及纳米粒径分析仪,美国Beckman Coulter公司;F-2700荧光分光光度计,日本日立高新技术有限公司;Discovery HR-10旋转流变仪,美国TA Instruments公司;蔡司LSM900 CLSM,德国Carl Zeiss公司;PQ001低场核磁共振波谱仪(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR),上海纽迈电子科技有限公司;Nicolet iS20傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR),英国Thermo Fisher Scientific公司;JNS-MS-3D-100DZ微流控静电3D打印喷头,南京捷诺思智能科技有限公司;LGJ-12H真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MP的制备
采用改良磷酸盐缓冲液提取法[11],去除鸡胸肉筋膜和脂肪并制糜后,经均质、离心、洗涤纯化,将MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液(pH 7.0)中,使用BCA法测定MP的质量分数,调整质量分数至4.0%,4 ℃冷藏保存备用。
1.3.2 MP-GA-XG复合溶液的制备
参考文献[12]的方法,将20 mL 4.0% MP溶液、5 mL 4.0% GA储备液、15 mL 0%、0.8%、1.6%、2.4%、3.2%的XG储备液混合,4 ℃下300 r/min磁力搅拌24 h,制备MP-GA-XG复合分散液,按XG质量分数标记为F0～F4(图1)。
图1 MP-GA-XG复合物溶液的制备
Fig.1 Preparation of the MP-GA-XG complex solution
1.3.3 高内相Pickering乳液的制备
按油水体积比1∶3(水相为MP-GA-XG复合分散液,油相为大豆油),经高速分散器均质乳化后,4 ℃冷藏备用,乳液按配方对应标记为H0～H4(表1)。
表1 H0～H4的质量分数占比
Table 1 The mass fraction ratio of H0 to H4
指标质量分数/%H0H1H2H3H4MP22222GA0.50.50.50.50.5XG00.30.60.91.2
1.3.4 复合物与乳液的表征
1.3.4.1 Zeta-电位测定
复合分散液稀释10倍后,于25 ℃下测定zeta-电位,每个样品平行测定3次。
1.3.4.2 内源荧光光谱测定
复合分散液稀释至质量浓度0.2 g/L后,在激发波长280 nm、发射波长300～500 nm下测定荧光光谱。
1.3.4.3 流变特性测定
采用旋转流变仪,选用40 mm直径、2°锥角的锥板转子,设置间隙为52 μm。设置剪切速率范围为0.1～10 s-1,采用线性递增模式,每个剪切速率下平衡10 s后记录对应的表观黏度值,每个样品平行测定3次。进行应变扫描(频率1 Hz,温度25 ℃,应变范围0.01%～100%),确定线性黏弹区;随后在线性黏弹区内(应变0.5%)进行频率扫描,频率范围0.1～10 Hz,温度25 ℃,记录储能模量(G′)和损耗模量(G″),平行测定3次。
1.3.4.4 粒径分布分析
用激光粒度分析仪测定乳液粒径分布,检测范围0.01～1 000 μm,平行测定3次。
1.3.4.5 CLSM观察
油相尼罗红溶液(质量浓度1 g/L)染色,激发波长488 nm,发射波长500～640 nm;水相经尼罗蓝溶液(质量浓度1 g/L)染色,激发波长640 nm,发射波长650～700 nm。在20 μm标尺下观察油滴的大小、分布及颗粒吸附情况。
1.3.4.6 LF-NMR分析
采用CPMG脉冲序列测定,设置回波时间0.1 ms、扫描次数8次,测乳液横向弛豫时间(T2),每个样品平行测定3次。
1.3.4.7 FTIR分析
乳液冷冻干燥后,在400～4 000 cm-1测定红外光谱,分辨率4 cm-1,扫描次数32次。
1.3.5 稳定性评价
1.3.5.1 冻融循环
-18 ℃冰箱冷冻24 h,取出后在25 ℃室温下解冻至完全融化,重复该冻融循环3次,观察乳液相分离情况,放置5 min时拍照记录。
1.3.5.2 叉压试验
将不锈钢叉垂直对准样品中心,施加垂直压力直至样品出现断裂、形变,放置5 min时拍照记录。
1.3.5.3 勺滴试验
以恒定角度倾倒液体,使液滴滴落,观察样品,放置5 min时拍照记录。
1.3.6 3D打印实验
设计领结形平面模型(30 mm×20 mm×0.6 mm)和圆柱形立体模型(直径20 mm×高15 mm);喷嘴直径0.85 mm,打印速度5 mm/s,层厚0.2 mm,填充密度100%,平台温度25 ℃,挤出压力0.3 MPa。打印完成后在25 ℃放置2 h,评估成型效果。
1.4 实验方法
所有实验数据以“平均值±标准差”表示。用Origin 2024软件绘制图表和Excel 2019统计数据,所有实验重复3次,采用SPSS 22.0进行单因素方差分析和Duncan检验分析样本之间的差异,当P<0.05时表示样品之间在统计学意义上具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 MP-GA-XG复合溶液的特性
2.1.1 Zeta-电位分析
由图2-a可知,随着XG从0%(F0)增加至1.2%(F4),MP-GA-XG复合物的zeta-电位绝对值呈持续上升趋势,从(17.52±0.85) mV增至(42.02±1.23) mV。这一现象归因于XG的阴离子特性,其分子结构中含有大量羧基,可通过静电吸附等非共价相互作用在复合物表面引入额外负电荷,进而调控颗粒的表面电荷分布,增强复合物内部的静电排斥力,有效抑制颗粒团聚[13]。Zeta-电位绝对值越大,体系的胶体稳定性越好,这为后续乳液的稳定形成提供了电荷基础。
a-zeta-电位;b-荧光强度;c-弹性模量;d-表观黏度
图2 MP-GA-XG复合物的zeta-电位,荧光强度,弹性模量和表观黏度
Fig.2 The zeta potential, fluorescence intensity, modulus, and viscosity of the MP-GA-XG complex
注:图中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 荧光光谱分析
如图2-b所示,随着XG质量分数增加,复合物的荧光强度呈先升后降趋势。低XG质量分数(0%～0.6%)时,荧光强度随XG含量增加逐渐升高,F2组(0.6% XG)荧光强度达到最大值;当XG质量分数超过0.6%后,荧光强度开始下降。低质量分数XG时,适量的XG分子通过氢键和疏水作用与MP、GA发生相互作用,稳定了复合物的空间结构,减少了荧光团(如色氨酸、酪氨酸)的非辐射能量转移,同时使更多隐藏在蛋白质内部的荧光团基团暴露于溶剂环境中,从而提高了荧光发射效率[14];高质量分数XG时,过量的XG分子可能导致分子间过度聚集,破坏荧光团的微环境,或引发蛋白质构象的过度变化,导致荧光强度下降。
2.1.3 流变学分析
2.1.3.1 稳态流变学(黏度)分析
复合物的稳态黏度测试结果表明,所有样品均表现出显著的剪切变稀行为(图2-c),即表观黏度随剪切速率增加而快速下降。在低剪切速率范围(0.1～1 s-1)内,复合物黏度随XG质量分数增加显著升高,F4组(1.2% XG)的表观黏度远高于F0组。这是由于XG分子与MP-GA复合物通过氢键和范德华力形成了致密的三维网络结构,增加了体系内部阻力,导致黏度升高[15];当剪切速率超过10 s-1时,不同XG质量分数组的黏度差异逐渐缩小并趋于一致,此时高剪切力破坏了分子间的三维网络结构,影响黏度的主导因素从XG质量分数转变为剪切速率,这一特性有利于3D打印过程中墨水的顺畅挤出。
2.1.3.2 动态流变学(黏弹性)分析
动态流变学频率扫描表征了复合物的黏弹性(图2-d),其中储能模量(G′)反映弹性特性,损耗模量(G″)反映黏性特性。在0.1～10 Hz时,所有复合样品的G′值均大于G″值,表明复合物呈弹性主导行为,这种特性有利于维持3D打印产品的形状[16]。随着XG质量分数增加,G′和G″值均呈持续上升趋势。这是因为具有双螺旋结构的XG通过分子间相互作用与MP、GA形成了更稳定的交联网络,进而增强了体系的弹性恢复能力和黏性阻力[17]。此外,G′和G″均随频率升高而增加,表明复合物具有频率依赖性,在高频振荡下表现出更显著的黏弹性响应,符合聚合物胶体的结构特征[18]。
2.2 乳液的表征结果
2.2.1 稳定性评价
冻融稳定性测试表明(图3-a),XG显著增强了HIPEs的抗相分离能力。经过3次冻融循环后,H0组(0% XG)出现明显相分离,表面漂浮大量游离油;而H3组(0.9% XG)和H4组(1.2% XG)仍保持均匀乳液状态,仅出现轻微分离。这是因为XG形成的三维网络结构抑制了冻融过程中油水迁移和团聚,减少了乳液结构的破坏[19]。
a-冻融稳定性;b-叉压实验;c-勺滴实验
图3 MP-GA-XG乳液的冻融稳定性、叉压实验和勺滴实验
Fig.3 The freeze-thaw stability of MP-GA-XG emulsion,the fork and spoon drop tests
注:图中H0～H4为不同XG质量分数组(下同);图b(叉压实验)列1～3分别为:样品停留不锈钢叉上状态、不锈钢叉垂直对准样品中心施压状态、取出不锈钢叉后样品状态;图c(勺滴实验)列1～3分别为:样品停留钢勺状态、恒定角度倾倒样品滴落状态、滴落完成后样品停留钢勺状态。
叉压试验显示(图3-b),乳液的结构强度随XG质量分数增加而提高:H0组质地松散,受压易变形;H4组质地致密,抗变形能力强,表明XG增强了乳液的结构完整性。
勺滴试验表明(图3-c),乳液的流动性随XG质量分数增加而降低:H0组流动性强,易滴落;H4组凝聚力良好,滴落时形成稳定液滴形态。
2.2.2 粒径分布分析
激光粒度分析结果进一步量化了XG质量分数对乳液粒径分布的影响(图4)。随着XG质量分数从0%增加至1.2%,乳液的体积平均粒径减小,从78.11 μm减小至12.42 μm,乳液粒径分布呈现“范围收窄、分布集中”的趋势。这种优化的粒径分布直接提升了乳液的胶体稳定性:一方面,更小的油滴具有更大的比表面积,有利于MP和XG在界面吸附形成更致密的界面膜;另一方面,均匀的粒径分布减少了液滴间的沉降速率差异,避免了因尺寸异质性导致的分层,进而提高了乳液整体稳定性[20]。
a-H0;b-H1;c-H2;d-H3;e-H4
图4 MP-GA-XG乳液的粒径分布图
Fig.4 The particle size distribution graph of MP-GA-XG emulsion
2.2.3 CLSM图像分析
如图5所示,随着XG质量分数增加,HIPEs的粒径逐渐减小且分布愈发均匀。无XG的H0组粒径分布范围宽,油滴大小不均,部分油滴发生聚结;而含1.2% XG的H4组粒径显著减小,油滴呈球形,分布均匀,无明显聚结现象。这是因为XG吸附在油水界面,与MP、GA共同形成了强化的界面膜,有效抑制了液滴聚结和奥氏熟化,从而调控了乳液的微观结构[21]。CLSM图像直观地证实了XG对乳液液滴的细化作用,与粒径分布分析结果一致。
图5 MP-GA-XG乳液的CLSM图
Fig.5 CLSM image of MP-GA-XG emulsion
注:油相荧光通道显示油滴分布,蛋白相荧光通道显示蛋白分布,明场图像显示样品整体形貌,多通道叠加图综合展示油滴与蛋白的分布关系;标尺:20 μm。
2.2.4 流变学表征
图6包含弹性模量谱图与表观黏度谱图,系统揭示了不同XG质量分数(H0～H4)对乳液流变特性的调控规律。
a-弹性模量;b-表观黏度
图6 MP-GA-XG乳液的弹性模量和表观黏度
Fig.6 The modulus and viscosity of the MP-GA-XG emulsion
图6-a弹性模量谱图显示:所有乳液样品的储能模量(G′)均持续高于损耗模量(G″),表现出典型的弹性主导类固体行为,满足3D打印墨水保形性的核心要求。XG质量分数对黏弹性呈持续增强趋势:H0组(0% XG)G′和G″最低,随XG质量分数升高,H1～H3组模量逐步上升,H4组(1.2% XG)模量达到峰值。此外,所有样品的G′、G″在测试角频率范围内基本保持稳定,表明乳液黏弹性对剪切频率不敏感,具备良好的结构稳定性。
图6-b表观黏度谱图显示:所有乳液均呈现典型剪切变稀行为,契合3D打印“低剪易成型、高剪易挤出”的需求[22]。低剪切速率下,黏度随XG质量分数升高显著增大,H4组表观黏度最高;高剪切速率下,各配方黏度趋于一致,确保打印时乳液能顺畅通过喷头。其中H3组在10 s-1剪切速率下表观黏度为684.43 mPa·s,实现了挤出性与保形性的最优平衡。
2.2.5 LF-NMR分析
图7由弛豫时间(T2)谱图与水分分布图组成,从氢质子弛豫特性与水分赋存状态角度揭示了XG对乳液稳定性的影响机制。
a-弛豫时间(T2)谱图;b-水分分布图
图7 MP-GA-XG乳液的弛豫时间(T2)谱图和水分分布图
Fig.7 T2 Relaxation time spectrum and moisture distribution map of MP-GA-XG emulsion
T2谱图显示:随XG质量分数增加,谱图信号强度和峰面积逐渐增大,峰宽呈收窄趋势。从H0到H4,谱图的整体形态发生显著变化:H0:主峰位置靠右(T2值较大),表明其中水分主要以自由水或流动性较强的弱结合水为主;H1～H4:随着样品变化,主峰逐渐向左移动(T2值减小),并且出现或增强了更短T2值的峰。这个趋势说明,从H0～H4,乳液中水分的整体流动性在下降,越来越多的自由水转变成了流动性受限的结合水。表明XG与MP-GA复合物相互作用增强,改变了体系中氢质子的弛豫环境,增加了参与弛豫过程的氢质子数量;体系中氢质子弛豫特性的均一性提升,进一步证实XG的加入优化了乳液体系的均匀性。
水分分布分析表明,H0样品:自由水的含量极高,占99.68%,而结合水(前3种)的总和仅为0.32%。这表明H0的内部结构对水分的束缚能力非常弱。H1到H4样品:随着XG质量分数增加,水分分布发生剧烈变化:自由水含量急剧下降(从H0的99.68%降至H4的98.82%)。结合水(强结合水、不流动水、弱结合水)的总含量显著上升(从0.32%增加至约1.18%)这表明XG通过与蛋白质、水分子形成更多氢键网络,增强了乳液的持水能力,减少了自由水迁移,从而提高了体系稳定性[23],与稳定性评价结果一致。
2.2.6 FTIR分析
FTIR图显示(图8),3 500 cm-1附近的宽峰对应分子间氢键或羟基(—OH)的振动:H0在此处的吸收峰(3 381 cm-1)最强且最宽,随着XG质量分数增加,吸收峰向高波数(3 404、3 413、3 422 cm-1)移动,同时峰宽变窄,说明XG的加入减弱了体系内的分子间氢键相互作用[24];3 000～2 800 cm-1区域对应C—H伸缩振动:H0在2 971 cm-1处有1个较强的吸收峰,随着XG质量分数增加,该峰向低波数(2 968 cm-1)移动并逐渐减弱,可能与XG与GA、MP之间的相互作用有关;1 700～1 600 cm-1区域对应羰基(C
O)或酰胺基团的振动:H0在1 696 cm-1 和1 652 cm-1处有明显吸收峰,随着XG质量分数增加,峰位置逐渐向高波数(1 697、1 699、1 697、1 697 cm-1)移动,且峰强逐渐减弱,表明XG与体系中的其他成分发生相互作用,改变分子构象[25];1 598 cm-1附近的峰可能与芳香环的振动有关。随着XG质量分数增加,该峰的位置和强度也发生了变化,这进一步说明XG与体系中的其他成分发生了相互作用。
图8 MP-GA-XG乳液的FTIR光谱图
Fig.8 FTIR spectrogram of MP-GA-XG emulsion
2.3 3D打印性能分析
3D打印实验表明(图9),XG质量分数对乳液的3D打印适配性影响显著。H0组(0% XG)打印性能差,领结形平面模型边缘不规则、线条不连续,圆柱形立体模型因乳液黏度低、结构稳定性差,打印高度(图10)仅为设计高度的29.60%,且出现明显坍塌;随着XG质量分数增加,打印性能显著提升,H3组(0.9% XG)领结形平面模型边缘轮廓清晰,线条连续光滑,圆柱形立体模型层间黏结性优异,打印高度达到设计高度的99.99%,无坍塌、变形现象;H4组(1.2% XG)打印样品虽结构稳定,但由于黏度较高,硬度增大,线条粗细不均,打印高度达到设计高度的108.89%,尺寸误差高于H3组。
图9 MP-GA-XG乳液的3D打印图
Fig.9 3D Printing diagram of MP-GA-XG emulsion
注:领结形与圆柱形俯视图展示打印样品的平面形状,圆柱形侧视图展示打印样品的高度和侧面形态。
图10 MP-GA-XG乳液的3D打印圆柱形高度
Fig.10 Cylindrical height of MP-GA-XG emulsion in 3D printing
综合分析表明,0.9% XG质量分数使乳液的储能模量和损耗模量达到最优平衡,既避免了低质量分数组(H0～H2)因黏弹性不足导致的坍塌,又克服了高质量分数组(H4)因过度交联引发的挤出困难,其打印样品的成型精度、结构稳定性和层间黏结性均最优,是理想的食品3D打印墨水配方。
3 结论
本研究以MP、GA和XG构建高内相Pickering乳液,系统探究了XG质量分数对复合物和乳液性能及3D打印适配性的调控机制,得出XG显著增强MP-GA复合物的稳定性,其质量分数对复合物的荧光特性和流变行为具有显著影响,所有复合物均表现出剪切变稀和弹性主导的黏弹性,XG的加入使乳液液滴粒径从78.11 μm减小至12.42 μm,粒径分布均一性显著提升;冻融稳定性显著增强;XG通过氢键网络增强水分束缚能力,提升乳液稳定性。所有乳液均表现出剪切变稀特性,0.9% XG组乳液,粒径13.39 μm、打印高度达设计值99.99%,稳定性及3D打印适配性最佳,打印样品成型精度高、结构稳定、层间黏结性好,是理想的食品3D打印墨水配方。
本研究通过XG质量分数梯度实现了高内相Pickering乳液性能的精准调控,阐明了“复合物特性-乳液结构-打印性能”的关联机制,为天然组分协同稳定的食品3D打印墨水开发提供了理论支撑和实践方案,契合天然健康食品的发展趋势。
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