软枣猕猴桃[Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.et Miq.]为猕猴桃科猕猴桃属落叶藤本植物,是长白山区著名的经济浆果之一[1]。长白山野生软枣猕猴桃不仅果汁鲜美,而且含有多酚、多糖、生物碱、三萜、维生素、蒽醌、挥发油等多种化合物[2-4];具有降血糖、改善肠道菌群、抑菌、防便秘等多种生理活性[5-8]。软枣猕猴桃收获期主要集中在8～9月,果实采摘期短,不易贮藏,产品形式比较单一,精深加工产品几乎空白,因此对软枣猕猴桃的活性研究显得尤为重要。目前对软枣猕猴桃的研究主要集中在栽植技术[9]、组织培养[10]、贮藏保鲜[11-12]等方面。软枣猕猴桃水提物(water extract from Actinidia arguta,WEA)是以水为溶剂进行提取,成分包含多种水溶性成分,如多糖、蛋白质、多肽、黄酮类、酚酸类、有机酸、色素、矿物质等,其生理活性是这些成分协同或拮抗作用的综合体现;研究WEA可简化提取流程,降低能耗与设备投入,便于实现工业化生产。软枣猕猴桃多糖(polysaccharide from Actinidia arguta,PA)是经过分离纯化得到的相对单一、结构明确的生物大分子,其活性主要受多糖本身的结构特性影响。目前对软枣猕猴桃的研究主要关注其特定成分(如多糖、黄酮、果胶等),但未见水提物和特定成分进行系统对比的研究报道。本文以WEA和PA为研究对象,分别对其抗疲劳、抗氧化和降糖活性作用进行研究,以期为后续软枣猕猴桃精深产品的开发和应用推广提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
软枣猕猴桃(品种为富康),采于吉林省集安市;20～22 g清洁级健康雄性ICR小鼠,无特定病原体级,购于长春亿斯实验动物技术有限公司[许可证编号:SCXK(吉)-2020-0002]。
生化指标检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 材料与试剂
722N可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;JJ-2组织捣碎机,金坛区华城润华实验仪器厂;JY92-2D超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;FDU-1100L冷冻干燥机,东京理化器械株式会社;XSC小鼠恒温游泳池,淮北正华生物仪器设备有限公司;Epoch 2全波长酶标仪,美国BIOTEX公司;THZ-C恒温振荡箱,上海培英实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 WEA的制备
以蒸馏水作为溶剂,按照m果∶m水=1∶25称取一定质量的软枣猕猴桃鲜果,清洗、去皮,用组织捣碎机进行打浆。将打好的果浆在超声波功率90 W下提取25 min,过滤,将滤液在4 500 r/min离心15 min,得到上清液,真空冷冻干燥,即为WEA。
1.3.2 PA的制备
将提取的水提物在55 ℃下蒸发浓缩,加入浓缩液5倍体积的无水乙醇,醇沉8 h,Sevag法与酶法联合除蛋白,H2O2法脱色[13],真空冷冻干燥,制得PA。
1.3.3 WEA成分含量的测定
根据SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定》苯酚-硫酸法测定多糖含量,并按照公式(1)计算;GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》荧光法测定维生素C含量,并按照公式(2)计算;按照吴瞳瞳[14]的方法测定多酚含量,并按照公式(3)计算。蛋白质含量按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》测定;可溶性固形物采用GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》方法测定。
多糖含量
(1)
式中:ρ1,多糖质量浓度,mg/mL;V1,待测样品体积,mL;N,稀释倍数;V,溶液总体积,mL。
维生素C含量
(2)
式中:V2,样品所消耗的体积,mL;V0,空白所消耗体积,mL;T,2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,mg/mL;N,稀释倍数;V3,溶液总体积,mL。
多酚含量
(3)
式中:ρ2,多酚质量浓度,mg/mL;V4,样品体积,mL;V3,溶液总体积,mL。
1.3.4 动物运动耐力试验
1.3.4.1 动物分组及给药方法
将小鼠置于实验环境(温度20～24 ℃,相对湿度40%～60%)下,适应7 d后按体重随机均分为7组,每组20只,分别为PA低(20 mg/kg·BW)、中(40 mg/kg·BW)、高(80 mg/kg·BW)剂量组和WEA(以多糖含量为基准)低(10 mg/kg·BW)、中(20 mg/kg·BW)、高(40 mg/kg·BW)剂量组、以生理盐水空白对照组;灌胃量按0.1 mL/(10 g·BW),每日1次,连续30 d,灌胃期间自由取食和饮水。
1.3.4.2 小鼠运动耐力试验
运动耐力是反映身体疲劳程度最直接和客观的指标。测定运动耐力常用的实验方法包括小鼠负重游泳试验和爬杆试验。参考朱国萍等[15]的方法测定小鼠力竭游泳时间,参考王嘉佳等[16]的方法测定小鼠滑落时间。
1.3.4.3 抗疲劳生化指标的测定
参考张卓睿等[17]的方法,按照试剂盒提供的方法测定肝糖原(liver glycogen,LG)、肌糖原(muscle glycogen,MG)、血乳酸(blood lactic acid,BLA)、降低血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活力。
1.3.4.4 体内抗氧化生化指标的测定
参考BRUCE等[18]的方法,按照试剂盒提供的方法测定总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物歧化酶(glutathione superoxide dismutase,GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(total peroxide dismutase,T-SOD)活力。
1.3.5 组织形态学观察
参考王玲玲[19]的方法,末次给样30 min后,小鼠在不负重的情况下游泳60 min,取小鼠腓肠肌肌肉组织,用光学显微镜进行观察。
1.3.6 体外抗氧化试验
以多糖含量为基准,配制不同浓度梯度的WEA和PA溶液,并以相同浓度的维生素C作对照。总还原能力的测定参考唐思颉等[20]的方法;DPPH自由基清除能力测定参照黄越等[21]的方法;·OH清除能力的测定参考漆莹等[22]的方法。
1.3.7 体外降糖试验
根据王俊龙等[23]的方法,以多糖含量为基准,配制不同浓度梯度的WEA和PA溶液,并以相同浓度的维生素C作对照,分别在540 nm和405 nm处测定吸光度,比较WEA和PA抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,以阿卡波糖作为阳性对照,并计算各样品的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值。
1.4 数据处理方法
实验结果均用“平均值±标准差”表示,采用SPSS 24进行数据统计分析,Graph Pad Prism 8和Origin 2025绘图。组间数据采用t检验分析差异显著性,和对照组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
2 结果与分析
2.1 WEA和PA样品中各成分含量
如表1所示,WEA冻干样品得率为12.04%,其中多糖含量为32.56%,蛋白质含量12.964%,多酚含量8.125%,维生素C含量0.523%。PA样品冻干后得率相对较低,为5.37%,但因PA样品纯化去除了蛋白和胶体物质,因此可溶性固形物含量高于WEA样品,样品中以多糖为主,经过脱蛋白处理,蛋白质含量与WEA样品相比降低80%,多酚含量降低75%,维生素C不稳定,在醇沉过程中被氧化,因此在PA样品未检测出维生素C。
表1 WEA和PA样品中各成分含量 单位:%
Table 1 Content of each component in WEA and PA samples
样品得率可溶性固形物含量多糖含量蛋白质含量多酚含量维生素C含量PA 5.37±0.2398.81±2.1370.74±0.982.856±0.052.129±0.11-WEA 12.04±0.3293.62±2.3332.56±1.0112.964±0.678.125±0.570.523±0.03
2.2 小鼠运动耐力结果分析
小鼠负重游泳实验时,肌肉消耗糖原,血糖水平降低,从而引起中枢神经系统供能不足,导致全身性疲劳的发生[19]。由图1可知,各实验组与空白对照组相比,力竭游泳时间均普遍提高。PA低、中、高剂量组与空白对照组相比均呈极显著差异(P<0.01),小鼠力竭游泳时间分别延长38.36%、50.00%、85.62%;WEA低、中、高剂量组小鼠力竭游泳时间分别延长4.11%、17.12%、28.08%。在爬杆实验中,各组小鼠滑落的时间与空白对照组相比均有所延长,PA延长率分别为28.70%、111.30%、152.17%,PA中、高剂量组均呈极显著差异(P<0.01);WEA延长率分别为8.69%、46.96%、55.65%,WEA低剂量组没有显著性差异,WEA中剂量组具有显著差异,WEA高剂量组具有极显著差异。实验结果表明,WEA和PA均能提高小鼠运动耐力,延长小鼠运动时间,两者均具有缓解疲劳的作用,PA效果总体优于WEA。
图1 WEA和PA对小鼠运动耐力的影响
Fig.1 Effects of WEA and PA on exercise tolerance in mice
注:*表示组间差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)(下同)。
2.3 抗疲劳生化指标结果分析
2.3.1 BUN含量和BLA含量的变化
小鼠在运动过程中,体内处于无氧环境,能量需要通过糖酵解途径供给,并产生代谢产物BLA,同时肝脏也会消耗部分氨基酸与蛋白质,产生代谢产物BUN,BLA和BUN均会通过血液进入循环系统中,因此BLA和BUN的含量可以有效评判小鼠的疲劳程度。由表2可知,同空白对照组相比,各剂量组小鼠的BUN和BLA含量均有所下降,PA低、中、高剂量组和WEA高剂量组降低BUN含量呈极显著差异(P<0.01);PA组效果优于WEA组;PA高剂量组BLA含量有明显下降趋势,具有极显著差异(P<0.01)。实验结果表明,WEA和PA均可以不同程度抑制小鼠运动后BUN和BLA含量的升高,减少了机体内代谢产物的积累,使小鼠的疲劳程度有所缓解。
表2 WEA和PA对小鼠抗疲劳生化指标的影响
Table 2 Effects of WEA and PA on biochemical indices of anti-fatigue in mice
组别BUN含量/(mmol/L)BLA含量/(mmol/L)LG含量/(mg/g)MG含量/(mg/g)LDH活力/(U/L)空白对照组6.45±0.115.24±0.302.00±0.380.30±0.02177.55±33.15PA低剂量组6.07±0.04∗∗5.17±0.172.56±0.480.32±0.03244.52±17.26∗PA中剂量组6.05±0.02∗∗4.87±0.302.90±0.310.50±0.01309.72±19.93∗∗PA高剂量组6.01±0.09∗∗3.99±0.55∗∗3.02±0.260.63±0.05316.12±24.53∗∗WEA低剂量组6.28±0.104.98±0.393.89±0.440.65±0.10334.84±29.20∗∗WEA中剂量组6.25±0.05∗4.88±0.385.51±0.360.84±0.05407.89±29.04∗∗WEA高剂量组6.05±0.08∗∗4.86±0.4914.75±0.49∗∗1.10±0.11∗∗426.84±10.31∗∗
2.3.2 LG、MG含量和LDH活力的变化
小鼠长时间的运动会消耗大量碳水化合物,直接影响脑细胞的能量供应,导致大脑活动的减少,引发身体疲劳。LG是贮存于肝脏中的葡萄糖聚合物,当饥饿或运动时,其分解的葡萄糖可维持血糖水平,避免低血糖导致的中枢疲劳。MG储备下降时,肌肉无法维持原有的运动强度或功率输出,骨骼肌收缩时能量不足,导致肌肉疲劳。因此MG和LG含量可以较好地反映疲劳程度。LDH可以将肌肉中过多乳酸转变为丙酮酸,从而减少乳酸的积累。LDH活力越强,乳酸的转变就多,抗疲劳效果就越好。由表2可知,与空白对照组相比,WEA高剂量组可极显著增加LG和MG含量(P<0.01);WEA各剂量组较PA各剂量组增加LG和MG含量分别提高51.95%～388.41%和68.00%～103.12%,WEA效果更显著;WEA组中除多糖外,含有的多酚可以与多糖形成“酚类-多糖”复合物,有助于增加小鼠LG和MG的含量,因此WEA效果较好。同空白对照组相比,WEA和PA各剂量组LDH活力均有提高,并且LDH活力随样品剂量的增加而提高,其中WEA各组和PA中、高剂量组呈极显著差异(P<0.01),PA低剂量组呈显著差异(P<0.05)。实验结果表明,WEA和PA均可以提高小鼠体内LG和MG的储备能力,提高LDH活力,延缓疲劳的发生。
2.4 体内抗氧化生化指标结果分析
当机体细胞受到自由基攻击后,会发生脂质的过氧化作用,MDA就是氧化产物之一,因此MDA含量的变化可以反映机体内脂质过氧化的程度[24]。如图2-a所示,PA中、高剂量组和WEA高剂量组均能极显著降低小鼠肝脏中MDA含量(P<0.01);PA低剂量组和WEA中剂量组与空白组相比具有显著差异(P<0.05)。WEA各组随浓度的增加,差异显著性增强;高浓度时PA降低MDA含量效果优于WEA组。
a-MDA含量;b-T-AOC含量;c-GSH-Px活力;d-T-SOD活力
图2 WEA和PA对体内抗氧化生化指标的影响
Fig.2 Effects of WEA and PA on antioxidant biochemical indices in vivo
T-AOC是测定抗氧化效果的代表性指标,依据T-AOC能力的变化可以判断机体抗氧化性的强弱。如图2-b所示,除PA低剂量组,其他各组与空白对照组相比,均极显著提高小鼠肝脏中T-AOC(P<0.01)。WEA中含有一定量的多酚和维生素C,维生素C可以还原酚类自由基中间体,使被氧化后的酚类物质恢复清除自由基的能力;同时多酚羟基可能通过共价键或非共价键修饰多糖,暴露更多活性位点,提高多糖抗氧化能力,因此同一剂量WEA组T-AOC能力均高于PA组。
GSH-Px可以清除自由基和衍生物,GSH-Px活力的变化可以反映其还原能力[25]。如图2-c所示,与空白对照组相比,WEA中、高剂量组和PA高剂量组均能极显著提高小鼠肝脏中GSH-Px的活力(P<0.01)。WEA低、中剂量组GSH-Px活力高于PA低、中剂量组,高剂量组WEA与PA无显著差异,表明WEA组提高GSH-Px活力的能力优于PA组。
T-SOD能清除体内多余的自由基,提高人体的抗氧化性。如图2-d所示,与空白对照组相比,WEA和PA高剂量组均能极显著提高小鼠肝脏中T-SOD的活力(P<0.01)。随着浓度增大,PA与WEA各组提高T-SOD活力增强。
2.5 组织形态学观察结果分析
图3结果显示,空白对照组运动后出现肌纤维断裂并开始变形,组织间血管发生破裂明显。而WEA和PA各剂量组肌细胞呈长柱型排列紧密,组织间血管正常,肌横纹整齐、清晰,未见肌纤维变形。从组织形态学上观察,WEA和PA可以有效减轻运动后小鼠骨骼肌纤维的细微损伤情况,提高小鼠的运动能力,增强小鼠的运动耐力和抗疲劳能力。
a-WEA低剂量组;b-WEA中剂量组;c-WEA高剂量组;d-PA低剂量组;e-PA中剂量组;f-PA高剂量组;g-空白对照组
图3 小鼠腓肠肌组织学观察结果(×200)
Fig.3 Results of histological observation of gastrocnemius muscle of mice (×200)
a-还原能力;b-·OH清除率;c-DPPH自由基清除率
图4 WEA和PA体外抗氧化结果
Fig.4 WEA and PA in vitro antioxidant results
2.6 体外抗氧化结果分析
由图4可知,WEA和PA均具有体外抗氧化作用。随样品浓度增大,WEA和PA的体外抗氧化能力均呈现上升趋势。WEA和PA对DPPH自由基、·OH均具有较强的清除能力,WEA清除能力均大于PA。WEA和PA对DPPH自由基的IC50值分别为0.731、0.884 mg/mL;·OH的IC50值分别为0.836、0.937 mg/mL。WEA和PA样品多糖浓度相同时,WEA中含有一定量的多酚和维生素C,多酚类物质可以提供氢原子或电子,协同多糖清除DPPH自由基和·OH的能力。
2.7 体外降糖结果分析
2.7.1 抑制α-淀粉酶活性结果分析
α-淀粉酶能够有效水解淀粉,将淀粉分解为可被生物体吸收的单糖、二糖和乳糖,因此抑制α-淀粉酶活性可以延缓血糖水平的升高。WEA对α-淀粉酶活性表现出明显的抑制作用,在质量浓度为5.0 mg/mL 时WEA的抑制率高达63.87%,而PA的抑制率仅为41.35%(图5-a)。WEA和PA对α-淀粉酶抑制IC50值分别为3.477、6.022 mg/mL。分析原因可能是WEA中的多糖可以与果胶、蛋白质等物质形成高黏度溶液,延缓淀粉与酶的接触,同时WEA中多酚还可以保护多糖结果,实现较强的抑制能力,因此WEA可以作为α-淀粉酶活性抑制剂使用,且易于提取制备。
a-α-淀粉酶抑制率;b-α-葡萄糖苷酶抑制率
图5 体外降糖实验结果
Fig.5 Results of in vitro hypoglycemic experiments
2.7.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性结果分析
通过抑制α-葡萄糖苷酶,使淀粉分解为葡萄糖的速度减缓,减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收,以降低血糖对餐后高血糖的作用,因此抑制α-葡萄糖苷酶是预防血糖升高的重要措施。如图5-b所示,随着浓度的升高,WEA和PA对α-葡萄糖苷酶的抑制作用不断增强,浓度较低时PA的效果优于WEA。WEA和PA对α-葡萄糖苷酶抑制IC50值分别为1.699、1.652 mg/mL。高浓度时WEA对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于PA,抑制效果接近阿卡波糖,主要是WEA中的黄酮、生物碱等小分子可直接结合酶活性位点,阻断底物水解。
3 结论
疲劳是机体不能维持其在特定水平上运动强度的一种生理现象,可以通过补充具有抗氧化作用的物质,提高体内抗氧化酶的活性,清除自由基,从而延缓疲劳的产生。运动耐力实验结果说明,WEA和PA均能延长小鼠运动时间,提高运动耐力;体内生化指标结果说明,WEA和PA均具有显著的抗疲劳作用。WEA和PA均可以提高小鼠肝脏中T-SOD和GSH-Px活力及T-AOC含量,降低MDA含量,两者均具有显著的体内抗氧化作用。WEA对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果优于PA,WEA的降糖效果更为显著。本研究首次对比软枣猕猴桃单一成分和混合成分的生物活性,明确软枣猕猴桃主要活性物质;但缺乏不同提取条件对WEA生理活性影响的研究;且WEA活性成分未明确,难以标准化生产;后续将重点探讨反映整体活性的生物评价方法或多指标成分控制。
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