赤松茸(Stropharia rugosoannulata Farl.)又称大球盖菇,作为一种食用菌在全球范围内广泛栽培[1]。赤松茸产量较高,口感清香,肉质滑嫩,菌柄爽脆,经济价值很高,由此跻身国际菇类交易市场十大品种行列,并获得联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)青睐,被特别推荐给发展中国家栽培[2]。现代药理研究表明,多糖是赤松茸主要的生物活性物质,具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗疲劳[5]、缓解非酒精性脂肪肝疾病[6]和调节免疫力[7]等生理功能。研究表明,多糖的生物活性,如抗氧化、免疫调节、抗炎等,与其分子质量分布、单糖组成、糖苷键类型、空间构象等理化性质密切相关[8]。然而,赤松茸多糖的构成是十分复杂的,不同组分间生物活性有巨大的差异。传统的均一多糖研究虽然重要,但需要昂贵的一次性用品、设备和较长的分离时间阻碍了它们在工业生产中的应用[9]。
分级醇沉作为分离多糖组分的一种常用且相对简便的方法,利用不同浓度的乙醇沉淀获得具有不同化学成分、分子质量和生物活性的多糖组分[10],这种提取方法为深入研究多糖的构效关系提供了有效途径。在生物体内,自由基的过度产生会导致细胞损伤和功能障碍,进而引发一系列疾病[11]。而抗氧化剂可以有效清除自由基,保护机体免受氧化损伤。在此过程中,免疫调节能力对机体的恢复也十分重要。因此,人们对筛选和开发具有抗氧化和免疫调节作用的天然化合物越来越感兴趣。
本研究通过分级醇沉获得不同赤松茸醇沉组分,测定各醇沉组分的成分组成、分子质量和单糖组成等理化性质,研究其体外抗氧化活性和免疫调节活性,并对其理化性质和生物活性进行相关性分析,旨在阐明赤松茸多糖组成与活性的构效关系。通过建立理化性质参数与生物活性指标之间的关联性,为深入理解赤松茸多糖的构效关系提供重要实验依据,并为后续高活性赤松茸多糖组分的精准筛选、功能食品开发及药用价值挖掘奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤松茸,河南鲜达农业发展有限公司;葡萄糖(纯度≥98%),天津市博迪化工有限公司;苯酚,天津市恒兴化学试剂制造有限公司;考马斯亮蓝G250、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),上海源叶生物技术有限公司;半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、DPPH、ABTS、总抗氧化能力检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;NaOH、NaCl、K2S2O8、正丁醇、三氯甲烷,天津市大茂化学试剂厂;苯酚、四硼酸钠、三氟乙酸、透析袋、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;RAW264.7细胞,中国科学院上海细胞库;DMEM培养基、CCK8试剂,江苏凯基生物技术股份有限公司;一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-6试剂盒,南京建成生物技术研究所;浓硫酸、无水乙醇、抗坏血酸(分析纯),北京化工厂。
1.2 仪器与设备
TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;RE100-S数显旋转蒸发仪,大龙兴创实验仪器(北京)股份公司;DZKW-D-2电热恒温水浴锅,北京市永光明医疗仪器厂;ME-204电子天平,美国Mettler公司;Bio-rad iMarkTM酶标仪,美国bio-rad公司;KQ-250DB数控超声波破碎仪,昆山市超声仪器有限公司;DGX-9143B鼓风干燥机,上海福玛实验设备有限公司;KH23A冷冻离心机,湖南凯达科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 提取赤松茸多糖
采用本实验室前期优化的超声波辅助热水浸提工艺提取赤松茸多糖[12],超声波温度设定为62 ℃、液料比设定为30∶1(mL∶g)、超声波时间设定为62 min,经过首次抽滤后,将所得的滤渣依照既定工艺再次进行提取,随后将2次提取过程中产生的滤液加以合并。接着,利用旋转蒸发仪,在45 ℃的条件下实施减压浓缩操作,直至滤液体积缩减至原始体积的20%,以便进行后续的实验步骤。
1.3.2 不同体积分数乙醇沉淀赤松茸多糖
从1.3.1节中取50 mL浓缩液,随后逐步加入无水乙醇,直至乙醇的体积占比达到30%。将此混合物在4 ℃静置12 h。之后,通过离心操作分离出沉淀物,并将沉淀用水重新溶解,进行4次sevage法除蛋白,然后蒸馏水透析48 h(透析袋截留分子质量为3 500 Da),最后进行冻干处理,得到30%醇沉组分(SRP30)。继续向上清液中增添无水乙醇,直至乙醇的体积占比提升至40%,其余步骤同上,得到40%醇沉组分(SRP40),依次获得50%醇沉组分(SRP50)、60%醇沉组分(SRP60)、70%醇沉组分(SRP70)、80%醇沉组分(SRP80)。然后按公式(1)计算各溶液中多糖得率。
(1)
式中:Y,多糖得率,%;m0,醇沉组分冻干样品质量,g;m,赤松茸粉末质量,g。
1.3.3 化学组成的测定
1.3.3.1 总糖含量的测定
采用苯酚硫酸法[13]测定总糖含量。配制不同质量浓度的标准溶液和样品溶液1 mL,依次加入5%(质量分数)苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL,室温下静置25 min后测其处的吸光度,多糖标准曲线为Y=0.011 8X+0.039 2,R2=0.999 8。
1.3.3.2 蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝法[14]对蛋白含量进行测定。实验过程中配制一系列质量浓度梯度的牛血清白蛋白标准溶液,向每一种溶液中分别添加5 mL考马斯亮蓝G-250染色液,保证完全混合均匀后,令其静置反应5 min,以促进颜色反应的完成。利用分光光度计在595 nm波长下精确测量各溶液的吸光度值。蛋白标准曲线为Y=0.007 3X+0.863 8,R2=0.992 1。
1.3.3.3 黄酮和总酚含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝法对黄酮含量进行测定,用福林酚法测定多酚含量[15]。黄酮标准曲线为Y=0.005 4X+0.0319,R2=0.999 8。总酚标准曲线为Y=0.013 4X+0.093 8,R2=0.999 9。
1.3.4 分子质量的测定
采用HPLC对多糖分子质量进行测定[16]。实验选用示差折光检测器(RID),色谱柱为TSK G4000 PWXL型凝胶柱(7.8 mm×300 mm),流动相采用超纯水,流速0.5 mL/min,色谱柱温度控制在35 ℃,检测器RID温度保持在40 ℃,样品进样量20 μL,时间30 min。分子质量的标准曲线为log Mw=-0.257x+8.863,R2=0.965。
1.3.5 单糖组成的测定
单糖组成参照文献方法稍作修改[17]。5 mg多糖样品与1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液混合,在120 ℃条件下进行6 h酸水解。反应终止后,将水解产物与等体积混合液(含500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液和500 μL PMP甲醇溶液)反应,其中PMP溶液为871.0 mg PMP溶解在10.0 mL甲醇中。该衍生化反应在避光条件下于70 ℃水浴中持续1 h,随后用0.3 mol/L HCl溶液调节pH至中性。中和后的混合液经氯仿萃取3次(每次使用等体积氯仿),萃取完成后过膜处理。分析采用反相高效液相色谱系统,色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm),以0.1 mol/L乙酸铵-乙腈(82∶18,体积比)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃。
1.3.6 体外抗氧化活性的测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除能力
根据李欣坪等[18]的方法稍作调整来评估上述6个不同体积分数乙醇沉淀的多糖溶液。实验采用96孔板进行反应,每孔依次加入100 μL不同浓度的多糖样品,随后再加入等体积的DPPH溶液(浓度为0.125 mmol/L)。将混合物均匀搅拌后,37 ℃水浴加热30 min。之后,在酶标仪上于517 nm波长处测定各孔的吸光度值,记为A1。同时,按照相同的方法,以无水乙醇作为空白对照,分别替换DPPH溶液和待测样品溶液,测定其吸光度值 A2和A0。DPPH自由基清除率按公式(2)计算。
(2)
式中:RSA,自由基清除率,%;A1,被测样品吸光度;A2,溶剂与样品混合物的吸光度;A0,溶剂与自由基溶液混合物的吸光度。
1.3.6.2 ABTS阳离子自由基清除能力
按照RE等[19]的方法测定。ABTS阳离子自由基工作液的配制过程如下:首先取等体积的7 mmol/L ABTS母液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液充分混匀,随后将混合溶液置于避光环境中室温静置12～16 h。待反应完全后,使用适当溶剂调节溶液浓度,使其在734 nm波长处的吸光度稳定在0.7左右。取不同质量浓度多糖溶液样品100 μL,加入100 μL稀释好的ABTS阳离子自由基溶液充分混匀,室温静置6 min后测定吸光度值(A1)。分别以无水乙醇代替ABTS和样品按照上述方法测定吸光度值得到A2和A0。清除率按照公式(2)计算。
1.3.6.3 总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)
按照总抗氧化能力检测试剂盒说明书准备所需工作液,先根据Fe2+终浓度和吸光度建立标准曲线,然后空白管加入180 μL检测液和24 μL蒸馏水,检测管加入180 μL检测液、6 μL待测样品液和18 μL蒸馏水,充分混匀,室温准确反应10 min,吸取200 μL 于96孔板中,于593 nm波长处测量吸光度值。检测管与空白管吸光度值之差代入标准曲线公式计算样本浓度(X),按照公式(3)计算总抗氧化能力。
(3)
式中:T,总抗氧化能力,μmol/mL;X,样本浓度,μmol/mL;V,反应总体积,0.204 mL,V1,反应中样本体积,0.006 mL。
1.3.7 体外免疫活性的测定
1.3.7.1 细胞培养
将RAW264.7巨噬细胞悬液调整至2×105 cells/mL,取100 μL接种于96孔培养板。置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育24 h,待细胞贴壁生长后开展后续实验操作。
1.3.7.2 多糖对RAW264.7细胞活性的影响
参考XIONG等[20]的方法略作修改,多糖质量浓度设定25、50、100、200、400、800 μg/mL,去除废液后向各孔加入100 μL相应浓度的多糖溶液,LPS(0.1 μg/mL)为阳性对照组,PBS为空白组。完成24 h处理后,先去除孔板中的旧培养基,再向每孔补充100 μL 含10%(体积分数)CCK-8的完全培养基反应0.5～4 h,随后于450 nm波长处测定吸光值。
1.3.7.3 多糖刺激RAW264.7细胞NO释放量的测定
经CCK-8实验确定多糖的高中低剂量,用不同质量浓度(50、100、200 μg/mL)的分级醇沉多糖样品处理细胞并孵育24 h,然后收集培养基上清液,并使用Griess试剂测量NO浓度。LPS(0.1 μg/mL)为阳性对照组,空白组加入PBS。
1.3.7.4 多糖刺激RAW264.7细胞产生TNF-α和IL-6质量浓度的测定
细胞培养24 h后弃去培养基,实验组分别加入50、100、200 μg/mL的多糖溶液(100 μL/孔)。空白对照组使用PBS处理,阳性对照组则给予0.1 μg/mL LPS刺激。37 ℃孵育48 h后收集细胞培养上清液,采用ELISA法检测上清液中TNF-α和IL-6含量,具体操作按试剂盒说明书进行。
1.4 数据处理
每组实验平行3次,采用SPSS 22.0软件分析差异是否具有显著性,P<0.05表示差异具有统计学意义。相关性分析采用Pearson相关系数。采用Origin 2022软件进行图表的绘制。
2 结果与分析
2.1 分级醇沉赤松茸多糖的化学组成
向多糖水溶液中加入乙醇,能有效降低其介电常数,削弱多糖与水分子之间的相互作用力,进而促进多糖分子在水中的聚合而产生沉淀现象,且有研究表明不同体积分数的乙醇会导致沉淀出的多糖种类存在差异[21]。表1列出了不同体积分数乙醇沉淀的赤松茸多糖的化学组成,可知赤松茸多糖用不同体积分数乙醇进行分级沉淀时,各组分多糖得率具有显著性差异(P<0.05)。SPR30的多糖得率最高,为4.56%,占各组分醇沉多糖总量的42.82%;其次是SPR50和SPR80醇沉组分,且两者间无显著性差异;SPR40的多糖得率最低,为0.83%。与此同时,SPR30的蛋白质含量也最高,为3.11%,占各组分醇沉蛋白质总量的35.46%,而SPR30的糖醛酸含量较低。随着乙醇体积分数的增加,蛋白含量呈现下降的趋势。有研究表明分级醇沉木奶果皮多糖在低乙醇体积分数下的蛋白含量最高[22]。SRP70和SRP80的总糖含量较高。采用分级醇沉法获得的各多糖组分在化学组成上展现出明显差异,这反映了该方法在多糖分离方面的良好效能。
表1 赤松茸多糖的化学组成 单位:%
Table 1 Chemical composition of polysaccharides from S.rugosoannulata
组分多糖得率总糖含量蛋白质含量黄酮含量总酚含量SRP304.56±0.01a49.25±1.05c3.11±0.11a0.224±0.005f1.044±0.027dSRP400.83±0.03d48.74±0.13c1.88±0.02b0.284±0.002e0.629±0.006fSRP501.43±0.10b34.76±0.05d1.51±0.01c0.387±0.005c0.977±0.001eSRP601.22±0.08c21.11±0.05e1.16±0.02d0.785±0.000b1.727±0.017bSRP701.19±0.02c69.50±0.60b0.64±0.06e0.811±0.012a1.907±0.017aSRP801.42±0.19b75.29±0.13a0.47±0.04f0.305±0.006d1.293±0.012c
注：同列数字上标不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。
2.2 分级醇沉赤松茸多糖的分子质量分布
如表2所示,分子质量>200 kDa的比例随着乙醇体积分数的增加逐渐降低,在乙醇体积分数从30%上升到80%过程中,由73.18%降低到45.88%。分子质量在10～200 kDa的分布范围内无明显变化规律。分子质量<10 kDa的比例逐渐增加,SRP30的分子质量比例为5.58%,SRP80的分子质量比例增加到42.58%。各组分的平均分子质量随着乙醇体积分数的增加逐渐降低,由940.79 kDa降低到156.21 kDa,SRP80的分子质量最低。表明分子质量小的多糖在大的乙醇体积分数下较多溶出,由于乙醇在每个浓度梯度下对多糖的溶解能力有限,导致即便在高体积分数的乙醇中,也会有少量高分子质量的多糖发生沉淀[23]。
表2 赤松茸醇沉多糖的分子质量分布
Table 2 Molecular weight distribution of alcohol precipitated polysaccharides from S.rugosoannulata
组分分子质量分布/%>200 kDa10～200 kDa<10 kDa平均分子质量/kDaSRP3073.1821.245.58940.79SRP4064.4417.2218.34797.97SRP5068.909.6321.47630.67SRP6059.3828.8639.60575.29SRP7054.5120.2440.56529.45SRP8045.8811.5442.58156.21
2.3 分级醇沉赤松茸多糖的单糖组成
由图1-a可看出,SRP40、SRP50、SRP60、SRP70都是由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖构成,SRP30由甘露糖、葡萄糖和半乳糖构成,SRP80由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖构成。由图1-b可看出,单糖组成随着乙醇浓度的改变而发生变化。随着乙醇体积分数的增加,甘露糖和葡萄糖醛酸的相对含量呈上升趋势。乙醇体积分数从30%上升到80%时,甘露糖的相对含量从2.63%上升到了25.50%,这可能是由于甘露糖在乙醇浓度较高时容易较多地沉淀下来[24]。葡萄糖的相对含量在乙醇体积分数为30%时最高,即SRP30的葡萄糖相对含量最高,为87.48%。在乙醇体积分数从30%上升到80%的过程中,半乳糖的相对含量出现先升高后降低的趋势,在乙醇体积分数为50%时相对含量达到最高值42.34%,可能由于乙醇浓度适中时半乳糖的沉淀能力最强,这与NIU等[25]的研究结果一致。
a-色谱图;b-相对含量堆叠图
图1 赤松茸醇沉多糖的单糖组成分析
Fig.1 Analysis of monosaccharide composition of alcohol precipitated polysaccharides from S.rugosoannulata
注:Man-甘露糖;Rha-鼠李糖;GluA-葡萄糖醛酸;GalA-半乳糖醛酸;Glu-葡萄糖;Gal-半乳糖;Xyl-木糖;Ara-阿拉伯糖。
2.4 分级醇沉赤松茸多糖的抗氧化活性
由图2-a可知,在实验质量浓度范围内,不同体积分数乙醇沉淀出的赤松茸多糖均展现出对DPPH自由基的清除能力,且随着多糖质量浓度的升高而逐渐增强,在1.8 mg/mL时达到最大值,为91.99%。从不同组分来看,SRP80清除DPPH自由基能力显著高于其他组分(P<0.05);其次是SRP30和SRP40;相比之下,SRP50和SRP60醇沉组分的DPPH自由基清除能力最低。由图2-b可知,不同体积分数乙醇沉淀得到的赤松茸多糖清除ABTS阳离子自由基能力也呈现质量浓度依赖性,质量浓度越高,清除能力越强。SRP80的ABTS阳离子自由基清除能力显著高于其他组分(P<0.05),在6 mg/mL时达到了83.56%。如图2-c所示,多糖质量浓度在1～5 mg/mL范围内,各醇沉组分多糖均展现出较好的抗氧化活性,且随着多糖质量浓度的增大而增强。SRP80的总抗氧化能力最强,显著高于其他组分(P<0.05),在3 mg/mL时,总抗氧化能力就已经是其他组分的两倍还多,在5 mg/mL时达到了0.84 μmol/mL。因此SRP80具有较强的抗氧化活性,可为抗氧化剂的开发提供参考,这与YANG等[26]发现80%乙醇沉淀多糖(CP80)具有较强抗氧化活性的结果一致。综上所述,以赤松茸多糖抗氧化活性强弱为衡量标准,最佳醇沉体积分数为80%的乙醇溶液。
a-多糖的DPPH自由基清除率;b-多糖的ABTS阳离子自由基清除率;c-多糖的总抗氧化能力
图2 分级醇沉各组分赤松茸多糖的抗氧化能力
Fig.2 Antioxidant capacity of S.rugosoannulata polysaccharides precipitated by ethanol with different volume fractions
注:不同大写字母表示不同组分同质量浓度差异显著(P<0.05),不同小写字母表示同组分不同质量浓度差异显著(P<0.05)。
2.5 免疫调节活性
2.5.1 多糖对RAW264.7细胞增殖活性的影响
用CCK-8法检测细胞增殖活性,通过测定不同浓度多糖作用下巨噬细胞的存活率变化,建立剂量-效应关系,从而筛选出对细胞生长无显著抑制作用的适宜浓度区间,用于后续免疫调节的研究。赤松茸醇沉多糖对RAW264.7细胞活力的影响如图3所示,各组分多糖呈现低浓度促细胞增殖特性,RAW264.7细胞存活率在各组分多糖为400 μg/mL时出现下降趋势,当多糖质量浓度升至800 μg/mL时,RAW264.7细胞平均存活率降至100%以下,但此浓度作用下存活率与空白无显著性差异(P>0.05),可能因渗透压改变产生轻微毒性。综合分析,确定50、100、200 μg/mL 为SRP30、SRP40、SRP50、SRP60、SRP70和SRP80的安全作用浓度,用于后续免疫研究。
图3 赤松茸醇沉多糖对RAW264.7细胞活力的影响
Fig.3 Effect of alcohol precipitated polysaccharide from S.rugosoannulata on the viability of RAW264.7 cells
注:不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。
2.5.2 免疫活性
NO是活化巨噬细胞的产物,通过诱导型一氧化氮合酶的酶活性从氨基酸L-精氨酸衍生而来,并作为重要的信使分子介导炎症反应[20]。赤松茸醇沉组分对RAW264.7细胞的NO释放量的影响如图4-a所示,醇沉多糖显著刺激RAW264.7细胞的增殖(P<0.01),表明其对这些细胞具有明显的刺激作用。用不同浓度的醇沉多糖处理24 h后,NO产生以剂量依赖性方式显着增加。值得注意的是,在200 μg/mL时醇沉组分观察到的刺激效果较高,其中SRP80的NO释放量达到了10.93 μmol/L。赤松茸醇沉组分对RAW264.7细胞的TNF-α和IL-6质量浓度的影响如图4-b、4-c所示,LPS处理诱导RAW264.7细胞分泌大量TNF-α和IL-6。不同浓度的醇沉组分以剂量依赖性方式显著增加了RAW264.7细胞分泌TNF-α,对IL-6分泌量的影响随着乙醇体积分数的增加呈上升趋势,在200 μg/mL剂量下,SRP80显著刺激RAW264.7细胞产生TNF-α(379.81 pg/mL)和IL-6(63.94 pg/mL)。与其他乙醇沉淀多糖相比,SRP80表现出更强的细胞因子分泌能力,表明SRP80具有更优异的免疫调节活性。
a-NO释放量;b-TNF-α质量浓度;c-IL-6质量浓度
图4 赤松茸醇沉组分对RAW264.7细胞的NO释放量、TNF-α和IL-6质量浓度的影响
Fig.4 Effects of alcohol precipitation components of S.rugosoannulata on NO release, TNF-α and IL-6 concentration in RAW264.7 cells
注:不同小写字母表示不同组分同质量浓度差异显著(P<0.05);与PBS相比,**P<0.01表示差异极显著。
2.6 相关性分析
不同体积分数乙醇沉淀赤松茸多糖获得6个醇沉组分,对醇沉组分的化学组成、分子质量、单糖组成、抗氧化能力和免疫活性进行测定,发现每个组分之间差异显著,其相关性分析如图5所示。结果表明,赤松茸多糖醇沉组分的ABTS阳离子自由基、DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力与总糖含量均呈正相关关系,相关系数分别为0.9、0.75和0.74。从分子质量分析来看,ABTS阳离子自由基清除能力和总抗氧化能力与平均分子质量呈负相关关系。HUI等[24]的研究表明,80%乙醇体积分数下醇沉的多糖抗氧化活性比其他醇沉组分较强与其分子质量较低有关,与本实验结果一致。从单糖分析来看,ABTS阳离子自由基清除能力与葡萄糖醛酸含量呈显著正相关(P<0.01),相关系数为0.93,与半乳糖含量呈负相关关系(P<0.05),相关系数为-0.81。免疫活性检测结果显示,NO、TNF-α和IL-6的分泌水平与蛋白含量、平均分子质量及半乳糖组分呈负相关(P<0.05),而与总酚、甘露糖和葡萄糖醛酸含量呈正相关。值得注意的是,TNF-α与半乳糖的相关性很强(r=-0.97,P<0.01),同时与葡萄糖组分存在显著正相关关系。NO释放量和IL-6质量浓度与甘露糖呈显著正相关,相关系数分别为0.98和0.90,与葡萄糖醛酸也呈显著正相关,相关系数都为0.91。实验结果表明,多糖的生物活性与其理化特性存在明确关联。总糖含量较高且分子质量较小的多糖不仅抗氧化效果突出,免疫调节功能也相对较强。从单糖组成角度观察,免疫活性较好的多糖通常含有较高比例的甘露糖和葡萄糖醛酸。
图5 赤松茸醇沉多糖的相关性热图分析
Fig.5 Correlation heatmap analysis of alcohol precipitated polysaccharides from S.rugosoannulata
注:*P≤0.05表示有显著性差异,**P≤0.01表示有非常显著的差异,***P≤0.001表示极其显著的差异。
赤松茸多糖的相关性关系分析表明,分子链结构是影响其生物活性的关键因素。多项研究显示多糖的分子质量主要与其抗氧化活性有关,通常小分子质量的多糖往往表现出更好的自由基清除活性,无论小分子多糖是通过辐照还是不同的提取方法获得的[27]。这进一步证实了本研究得出分子质量小的多糖抗氧化活性好的结论。单糖组成一定程度上影响着多糖的生物活性,相关性分析表明了生物活性与甘露糖和葡萄糖醛酸的比例存在正相关关系。本研究在一定程度上明确了较低分子质量的赤松茸多糖具有较强的抗氧化活性,高比例的甘露糖和葡萄糖醛酸含量具有较强的免疫调节活性。单糖组成中葡萄糖作为主要组成部分,其含量与活性的相关性并不明显,有可能其糖苷键连接方式影响着赤松茸多糖的生物活性,因此,下一步应对多糖的糖苷键连接方式进行研究,进一步阐明赤松茸多糖生物活性的构效关系。
3 结论
本研究分别采用不同体积分数乙醇溶液沉淀赤松茸多糖,对醇沉得到的不同组分的多糖得率、化学成分、抗氧化能力和免疫活性进行比较分析,综合评价分级醇沉对赤松茸多糖理化性质和体外活性的影响,并对各醇沉多糖的数据进行相关性分析。结果表明,不同醇沉组分的化学组成和活性特征差异较大。80%醇沉多糖的总糖含量较高。醇沉多糖的平均分子质量随着醇沉浓度的增加而降低,80%醇沉多糖的平均分子质量最低。单糖组成的结果表明,80%醇沉多糖中甘露糖和葡萄糖醛酸的含量最高,30%醇沉多糖中葡萄糖含量最高,半乳糖含量最高的是50%醇沉多糖。相关性分析结果表明,总糖含量越高的醇沉组分抗氧化能力越高,分子质量较低的醇沉组分抗氧化能力越高;6个醇沉多糖均能激活RAW264.7细胞释放NO,TNF-α和IL-6等免疫调节因子与甘露糖正相关关系。综上所述,总糖含量高和分子质量小多糖其抗氧化活性较好,免疫活性也较好;甘露糖和葡萄糖醛酸含量较高的多糖组分具有更好的免疫活性。本研究为赤松茸多糖类功效成分的研究及开发利用提供了参考。
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