当严重食物过敏、急性胃肠道疾病或消化功能障碍使患者无法通过普通饮食或膳食调整获得足够营养时,便需采取额外的营养干预手段[1]。相比于其他药物,特殊医学用途食品(特医食品)能够提供足够的能量和宏量营养素,包括不同浓度的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质,来暂时或长期补充营养摄入不足,从而有效地治疗疾病和缓解病症[2]。自20世纪70年代开始,特医食品在欧洲、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、日本等国家及地区的临床辅助治疗中相继使用。因其无需进行静脉穿刺或留置导管,大幅降低了感染及术后并发症的发生风险,从而在缩短住院时长、节约医疗开支、提高患者生活质量等方面起到了积极的推动作用。在我国,特医食品被分为3类:全营养配方食品、特定全营养配方食品和非全营养配方食品。其中,全营养配方食品是指可作为单一营养来源满足目标人群营养需求的特医食品,特定全营养配方食品是指可作为单一营养来源能够满足目标人群在特定疾病或医学状况下营养需求的特医食品,而非全营养配方食品指的是可满足目标人群部分营养需求的特医食品,但不适用于作为单一营养来源。随着人口老龄化的加剧,慢性疾病患者的不断增加,特医食品行业也迎来了巨大的发展机遇。iMedia Research数据显示,中国特医食品行业市场规模从2016年的25.9亿元增至2022年的119.3亿元,预计2027年中国特医食品市场规模将达234.2亿元。
虽然特医食品市场前景广阔,但其配方中的某些营养成分在加工时的不稳定性,限制了其后续的工业生产应用。维生素A在维持人体正常代谢与功能上不可或缺,对视觉、生殖、生长发育均起关键作用[3]。长时间缺乏维生素A可导致失明、机体协调失调、生殖障碍和生长性能下降等生理问题[4]。狭义维生素A即视黄醇,广义维生素A还包括视黄醛、视黄酸、醋酸视黄酯和棕榈酸视黄酯等在内的视黄醇衍生物[5]。目前市售的维生素A主要为醋酸视黄酯和棕榈酸视黄酯。由于维生素A酯类衍生物结构中往往含有共轭双键、羟基和酯基,化学性质极不稳定,易发生加成、氧化、聚合、裂解和脱水等反应[6]。因此,有必要考察特医食品加工生产中维生素A的稳定性。
此外,光、氧气、热和自由基等均能引发以上维生素A类衍生物的反应或使这些反应加速进行[7]。其中温度越高,所引起的氧化效应越强,维生素A损失也就越大。因此,有必要研究灭菌条件对特医食品加工过程中维生素A稳定性的影响。超高温瞬时灭菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT)是一种在极短时间内,用高温给食物灭菌的方法,加热后产品能够达到商业无菌要求。温度越高,灭菌和破坏营养分子的速度差距则会越大,UHT技术可以在足够杀菌的情况下避免破坏营养,使产品在很长一段时间(数年)内保持微生物稳定性[8]。目前,UHT技术最常见的应用产品是奶制品,其他产品还包括果汁、红酒和蜂蜜等[9],但有关特医食品体系的研究报道较少。针对以上问题,本文通过计算F0值选取了2种不同UHT条件以研究2种不同来源的维生素A在全营养特医食品生产中的稳定性,期望对维生素A在特医食品工业生产、贮存和使用过程中工艺条件的优化及保留率控制提供理论参考与时间基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
浓缩乳清蛋白OptiSol® 1007、矿物质预混料、维生素预混料(含醋酸视黄酯 NutraShieldTM Vitamin A Acetate 325/棕榈酸视黄酯NutraShieldTM Vitamin A Palmitate 250),哥兰比亚营养品(苏州)有限公司;蔗糖,市售;食用油,嘉吉粮油(南通)有限公司;乳化剂,日本理研维他命株式会社;麦芽糊精,罗盖特(中国)营养食品有限公司。
抗坏血酸、2,6-二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytoluene, BHT)、无水乙醇、石油醚、甲醇(色谱纯)、正己烷、Na2SO4、KOH,广西西陇科学股份有限公司;维生素A标准品(纯度>98%),上海麦克林生化科技有限公司;CuSO4、K2SO4、NaOH、醋酸钠,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Zetasizer Nano S90激光粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;FiveEasy plus型pH仪,梅特勒托利多科技有限公司;SPY-60高压均质机,上海励途超高压设备有限公司;UltiMate 3000高效液相色谱仪,赛默飞世尔科技有限公司;CT-20无菌灌装室、ST-20UHT管式超高温杀菌机、TK-50高速剪切机、FB-110S20-PLUS低压均质机、TP-20混合罐,上海顺仪科技;一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱,上海蚁霖科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 特医食品的生产线
特医食品生产流程:
灌料→剪切→高压前均质→UHT灭菌→低压后均质→无菌室罐装
首先将表1配方中的蛋白质、麦芽糊精和蔗糖混合均匀,并在高速剪切机中加入一定纯净水,接着将混合物慢慢加入到剪切机中,以20 Hz的速度剪切20～30 min,直至没有粉末和凝块出现。通过取样口取样测量乳液的pH值,记为P1。随后将矿物质预混料提前用纯净水溶解,加入到剪切机的乳液中,剪切5 min,测量乳液的pH值,记为P2。接着将食用油和乳化剂在50～60 ℃的水浴中提前混合均匀后,加入到乳液中,剪切5 min。最后将含有醋酸视黄酯的维生素预混料提前用水溶解,加入到乳液中,剪切5 min,测量乳液的pH值,记为P3。随后,乳液经管道进入前均质机高压均质;后由离心泵送入UHT装置,按设定条件灭菌;灭菌后冷却至60～70 ℃,进入后均质机低压均质;最后输送至无菌灌装室灌封,得终产品C1,测定其pH,记为P4。
表1 特医食品配方
Table 1 Formulation of FSMP
成分含量/%浓缩乳清蛋白OptiSol® 10076.81蔗糖5麦芽糊精7.4食用油2乳化剂0.2矿物质预混料1.2维生素预混料(含醋酸视黄酯/棕榈酸视黄酯)0.15纯净水77.24
注：配方中蛋白质含量为5%,乳液的能量密度为100 kcal/100 mL。
控制UHT灭菌温度143 ℃,时间5 s,重复以上操作得乳液C2。将棕榈酸视黄酯代替维醋酸视黄酯重复以上操作得乳液Z1和Z2。
1.3.2 F0值计算
对于热压灭菌法,参比温度定为121 ℃,参比微生物选择嗜热脂肪芽胞杆菌,其Z值为10 ℃,此时得到的F值称为F0值。具体来说就是将被灭菌物品在灭菌过程中不同的受热温度与时间折算到与热压121 ℃灭菌时热效力相当的灭菌时间。当F0值大于8 min,即可确认达到可靠的灭菌效果,但为了保证灭菌效果,一般增加50%。本研究选定了2种灭菌条件,分别为D1,灭菌温度为135 ℃,时间为30 s,F0值为12.24,以及D2灭菌温度为143 ℃,灭菌时间为5 s,F0值为12.87。F0值计算如公式(1)所示:
(1)
式中:Δt,测量被灭菌物料温度的时间间隔,min;T,每个时间间隔Δt所测得被灭菌物料的温度,℃。
1.3.3 维生素A含量的测量
参考GB 5009.82—2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》,采用反向高效色谱法对样品中的维生素A进行检测。
实验选取干净的150 mL锥形瓶,电子天平称50 g(精确至0.01 g)液体试样放置于内,再加入1 g抗坏血酸和0.1 g BHT摇晃混合均匀,然后加入30 mL无水乙醇和20 mL KOH溶液,置于恒温水浴中边加边振摇,混匀后于80 ℃恒温水浴中振荡皂化30 min,皂化后立即用冷水避光冷却至室温。冷却结束后,将皂化液转移到分液漏斗中并用适量石油醚进行萃取,萃取3次后合并醚层,并用三级水水洗,达到中性为止,然后将水洗后的醚层用Na2SO4过滤,再用石油醚反复冲洗分液漏斗,接着将水洗后的醚层合并于蒸发瓶中进行减压蒸馏,再用N2吹干,最后在10 mL容量瓶用甲醇定容,有机系滤膜(0.22 μm)过滤后,对维生素A含量进行检测。
1.3.4 Zeta电位与粒径的测量
取适量样品于粒径测试皿,设置检测角度为175°,12.8°,采用APD检测器,在室温条件下,用激光粒径仪对样品粒径测量;取适量样品于电位杯中,用激光粒径仪,采用PALS相位分析技术对样品进行zeta电位的测量。
1.3.5 加速试验方法
参考《特殊医学用途配方食品稳定性研究要求》中的方法,将灭菌后的产品放在恒温恒湿培养箱中进行加速,培养条件为温度(30±2) ℃,相对湿度(60±5)%。在0、1、2、3、6个月时取样测定产品中的维生素A含量、平均粒径和zeta电位,并以0个月时的维生素A含量作为基准,计算不同时间节点中维生素A的保留率。
1.3.6 数据处理
采用Excel 2021软件进行数据整理、统计与分析,采用Origin Pro 2024软件制图。数据以“平均数±标准差”表示,用SPSS Statistic 26将实验数据进行正态分布检验,对符合正态分布的数据进行单因素ANOVA检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 生产过程中维生素A的稳定性
如图1所示,在相同灭菌条件下,不同来源的维生素A的保留率差异显著。在D1条件下,棕榈酸视黄酯的保留率达到了91.84%,醋酸视黄酯的保留率为84.91%。在D2条件下棕榈酸视黄酯的保留率达到了92.06%,而醋酸视黄酯的保留率只有69.86%。这可能是因为醋酸视黄酯由视黄醇与乙酸酯化形成,结构中酯键连接的是短小的乙酰基。因此,其每个共轭双键每个位置都容易氧化。而棕榈酸视黄酯由视黄醇与棕榈酸(长链脂肪酸)酯化形成,酯键连接的是长链的棕榈酰基。长链脂肪酸能够带来更好疏水性、大空间位阻及更强的分子间作用力,对核心的共轭多烯链形成了更有效的保护,从而降低了氧化、水解、光降解等反应的发生[10]。因此棕榈酸视黄酯在配方中更加稳定一些,在灭菌的过程中损失较小。
图1 四批特医产品的维生素A保留率
Fig.1 Vitamin A retention rate of four batches of FSMP
注:C1-配方中维生素A来源为醋酸视黄酯且灭菌条件为D1;C2-配方中维生素A来源为醋酸视黄酯且灭菌条件为D2;Z1-配方中维生素A来源为棕榈酸视黄酯且灭菌条件为D1;Z2-配方中维生素A来源为棕榈酸视黄酯且灭菌条件为D2;不同字母表示组间具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 乳液制备工艺中pH的变化
酸碱度对预混料中维生素A的稳定性有着显著影响。偏酸或偏碱都会影响维生素A的稳定性,偏酸会使其脱氢或将双键重新排列,从而破坏其稳定性结构并加快氧化反应,导致维生素A的损失[11]。
如图2所示,4批特医食品在加入矿物质预混料后,乳液的pH都有明显升高,普遍由6.5～7.3增加到7.5～8.0左右,这是由于矿物质预混料中含有一些用于缓冲pH的碱性化合物。加入维生素预混料后,乳液的pH较稳定。灭菌和均质过后,4种乳液的pH有所降低,维持在7.3左右。此外,在D1条件下,乳液的pH下降较多,Z1的pH值从8.02降至7.28。Z2的pH值从7.31降至7.29。这可能是由于乳液中的糖类在高温条件产生了有机酸,灭菌时间越长,产生的有机酸可能就越多,pH下降也就越多[12]。
图2 四批特医食品在生产过程中pH的变化
Fig.2 Changes in pH during the production process of four batches of FSMP
2.3 不同UHT条件下最终产品稳定性的变化
产品最终的稳定状态会受其主要营养成分稳定性的影响,这种影响会导致乳液呈现出不同的理化性质。维生素A具有共轭多烯醇的侧链结构,这使其对氧、酸和紫外线较敏感,化学性质不稳定。因此,以维生素A保留率作为控制其质量的指标之一。矿物质中的Fe2+、Cu2+等微量金属元素在不稳定的情况下会生成Cu+、Fe3+和维生素A发生结合反应,同时它们本身还会催化脂质氧化释放自由基,加剧维生素A的降解。此外,灭菌过程高温高压也可能使得乳液中的物质生成过氧化物和自由基,催化维生素A发生氧化、脱水和聚合等反应,使得乳液不稳定,导致其结构变化而降低维生素A保留率及生物利用率[13]。
2.3.1 Zeta电位
Zeta电位的数值与胶态分散的稳定性相关,更高的电位将增加溶液的稳定性[14]。如图3所示,不同UHT灭菌条件对于乳液的zeta电位无显著影响,4批乳液的zeta电位均稳定在-30 mV左右。这可能是由于乳液在灭菌前后均经过均质处理,使产品中的物料能够充分分散,最终成品中无明显的颗粒和结块,呈光滑的液体状。食品乳液的稳定性主要是由蛋白质的乳化特性决定的。一般来说,普通乳清蛋白热稳定性较差,在高温下的空间结构会被逐渐破坏,这种变性会导致蛋白质分子展开,进而可能发生聚集沉淀[15]。而本乳液体系在相对较高的温度下保持较好的稳定性,可能与配方中乳清蛋白具有一定的耐热特性有关。
图3 四批特医食品的zeta电位
Fig.3 Zeta potential of four batches of FSMP
2.3.2 平均粒径
平均粒径及其分布是表征乳液、悬浮液和粉末等颗粒体系的重要指标,对产品性能和使用均有影响[16]。通常平均粒径越小,溶液越稳定。如图4所示,在不同的灭菌条件下,各产品的平均粒径出现显著差异。D1条件下时,2种不同来源的维生素A乳液产品的平均粒径无明显差异,均维持在500 nm左右。而在D2条件下时,产品的平均粒径均降至400 nm左右,这说明D2条件下生产的乳液较稳定。这可能是由于D1灭菌时间长,变性的蛋白粉倾向于聚集,从而增加了富含蛋白质的乳制品的平均粒径[17]。此外,有研究表明均质剪切速率越高,平均粒径越小[18]。同时,对于加入不同种维生素A的乳液,平均粒径越低,其保留率越高,这可能是因为乳液体系越稳定,乳液中的主要营养成分就损失得越少。
图4 四批特医食品的平均粒径
Fig.4 Average particle size of four batches of FSMP
2.4 加速试验过程中乳液平均粒径、zeta电位、pH和维生素A含量的变化
加速试验是将产品储藏在高于长期贮存温度和湿度的条件下,以考察产品的稳定性。该实验不仅能为配方和工艺设计、偏离实际贮存条件产品是否依旧能保持质量稳定提供依据,还可以初步预测产品在规定的贮存条件下的长期稳定性。在食品的贮存期间,温度和湿度与食品货架期密切相关。在一定的温度和相对湿度下,维生素A可能会发生降解。因此,为了在短时间内检验乳液中的维生素A发生的变化,需进行高温加速试验。考虑到温度过高,会引起乳液蛋白质变性,改变其氧化特性。为了使加速试验和实际贮藏条件下的维生素A衰减情况有很好的相关性,根据《特殊医学用途配方食品稳定性研究要求》中的规定,本实验选取30 ℃来考察稳定性较优的Z2产品中维生素A的稳定性。
如图5-a所示,第1个月内,乳液的平均粒径变化不大。第2～3个月时,乳液的平均粒径呈现出明显的增长趋势,其平均粒径值从320 nm提高至540.97 nm。3个月后,乳液的平均粒径变化逐渐趋于平稳,直至第6个月,其平均粒径为530.80 nm。这可能是由于全营养乳液中的蛋白质在贮藏过程中与麦芽糊精和蔗糖发生碰撞并经共价交联或非共价结合形成较大颗粒的聚集物,导致体系粒径增大[19]。
a-平均粒径;b-zeta电位;c-pH;d-维生素A
图5 加速试验过程中乳液平均粒径、zeta电位、pH和维生素A含量的变化
Fig.5 Changes in average particle size, zeta potential, pH, and vitamin A content of emulsion during accelerated testing
如图5-b所示,第1个月内,乳液的zeta电位变化不大,稳定在-26 mV左右。第2个月时,乳液的zeta电位有着显著增高,提升至-20 mV左右。第2～6个月,乳液的zeta电位虽然有所降低但变化不大,最终维持在-22 mV左右。这可能是由于高温度环境下油水界面蛋白等乳化分子的热流动性增加,它们更容易从液滴界面逃逸,分布在液滴界面上的同种电荷数量减小,削弱了静电斥力,促进了液滴之间的聚结,从而使乳液稳定性下降[20]。
如图5-c所示,经高温瞬时灭菌后的新鲜全营养乳液的pH值为7.23,加速1、2、3、6个月后,乳液的pH值分别变化为6.99、7.01、7.00和6.81。总体来说,乳液的pH呈现下降趋势,这可能与乳液中脂肪氧化水解所导致的氧化酸败有关。此外,随着贮藏时间的延长,乳基中残留的脂肪酶与蛋白酶的酶解反应速率会随贮藏温度的升高而逐步加快,从而导致游离脂肪酸含量上升,加剧全营养乳液pH的下降[21]。
如图5-d所示,第1个月内,乳液中的维生素A的含量无明显的下降,能维持在95%以上。第2个月内,乳液中的维生素A的含量开始显著降低,月末降至87%左右。此外,第3～6月内,乳液中维生素A的含量虽然仍在持续缓慢下降,但整体变化幅度不大,最终乳液维生素A的含量维持在85%左右。加速试验通常通过提高温度、相对湿度等条件加速降解,但化学反应需要一定时间启动,第1个月可能处于“积累阶段”,降解产物未明显增多,因此含量变化不显著。第2个月时,长期加速条件(如高温)可能会导致乳液分层、部分乳化剂失效,使原本被包裹的部分维生素A暴露在水相或空气中,增加了与残留的氧气、光线的接触机会,从而加速降解。另外,维生素A氧化降解的中间产物(如过氧化物)可能具有催化作用,进一步加速自身降解,导致含量在短时间内显著下降[22]。而随着降解的进行,维生素A的浓度逐渐降低,反应速率减慢,这可能是因为氧气、水分等降解因素在体系内的浓度已相对稳定(如氧气扩散达到平衡),且高温等条件对乳液的破坏趋于平缓,不再显著加剧降解,因此整体变化幅度缩小,降解速率放缓。王磊等[23]采用UHT灭菌和无菌包装工艺生产的液态婴儿乳液,在25 ℃保存6个月后,其维生素A保留率低于80%。ALBAL
-HURTADO等[24]对西班牙市场上的一款液态婴儿乳液进行研究,发现产品在30 ℃保存5个月后,其维生素A保留率低于85%。李子琰等[25]制备了一款全营养乳剂型特医食品并探讨了贮藏条件对其稳定性的影响,结果表明,该产品在25 ℃保存30 d后,其维生素A保留率为85%左右。本研究中所生产的乳液在30 ℃保存6个月后,其维生素A保留率仍能维持在85%左右,且该乳液体系中没有添加额外的抗氧化剂,这说明了该体系内的维生素A具有良好的稳定性。
3 结论与讨论
本研究选用了2种不同来源的维生素A,依据F0值设计了2种UHT灭菌条件,在中试生产线上生产了4批特医食品。随后测定了4批乳液的粒径、zeta电位和维生素A保留率,挑选出最具潜力的产品,并通过加速试验进一步考察其稳定性和维生素A保留能力。结果表明,UHT灭菌时间越长,灭菌后产品的pH下降幅度越大。该特医全营养食品在配方设计中考虑到产品体系的稳定性,通过维持弱碱性的pH值而获得较为稳定的产品体系。通常,zeta电位的绝对值绝高于30 mV的乳液被认为具有良好的稳定性,且平均粒径越小,乳液稳定性更好。本研究中的4批产品zeta电位的绝对值都高于30 mV,说明它们都具有良好的稳定性。此外,C2和Z2的粒径显著低于C1和Z1,说明在D2灭菌条件下得到的产品更加稳定。同时,2种条件下的棕榈酸视黄酯来源的维生素A保留率均比醋酸视黄酯高,达到了90%以上。其中,Z2产品较稳定,加速试验结果显示,6个月后其维生素A保留率仍能维持在85%以上,具有广泛的市场应用潜力。本研究对于特医食品中维生素A的添加和工艺条件的优化有一定的参考价值。
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