格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)是一种革兰氏阳性细菌,存在于酸奶等发酵食品及肠道、口腔、母乳等环境。格氏乳杆菌可以进行同型乳酸发酵,因此被广泛应用于发酵乳品、发酵饮料、发酵肉制品等食品发酵工业[1]。
近年来,格氏乳杆菌的益生作用受到了广泛关注。常见的格氏乳杆菌益生特性包括调节肠道微生态平衡、减肥、抗氧化、免疫调节等[1]。除此之外,格氏乳杆菌HHuMIND可以抑制变异链球菌的生长和牙斑的形成,从而保护口腔[2]。日常摄入格氏乳杆菌CP2305可以改善睡眠[3]。格氏乳杆菌PA-3可以降解嘌呤,并且可以抑制小鼠对嘌呤的吸收,从而预防痛风等相关疾病[4]。格氏乳杆菌345A可以增强肠道蠕动,从而改善便秘[5]。格氏乳杆菌CCFM1346可以显著降低小鼠尿酸水平,缓解高尿酸血症[6]。因此,格氏乳杆菌的益生作用表现出多样性和菌株特异性。
格氏乳杆菌TF08-1是分离自健康人体粪便样本的一株益生菌,具有较强的胆盐耐受性和胆固醇清除能力[7],有较好的开发潜力和应用前景。本文从抑菌活性、抗逆性和安全性3个方面对该菌株进行研究,以期全面了解其益生特性,完善其安全性评价体系,为该菌的进一步开发应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
益生菌:格氏乳杆菌TF08-1,分离自健康人体粪便样本[7]。
抑菌活性指示菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 29213、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 25922、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC 23355。
溶血性检测对照菌株:英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)CICC 10417(阴性对照)、金黄色葡萄球菌CICC 10473(阳性对照)。
L-乳酸、D-乳酸检测试剂盒,Megazyme公司;API50CHL乳杆菌属鉴定试剂条,bioMérieux公司;MRS培养基、脑心浸出液肉汤(brain heart infusion, BHI)培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;血琼脂平板,北京陆桥技术股份有限公司。
半胱氨酸MRS培养基:MRS培养基中加入500 μg/mL半胱氨酸。
LSM培养基:将V(Iso-Sensitest培养基)∶V(MRS培养基)=9∶1混合。
无机盐混合物(g/L):KCl 0.64、KH2PO4 0.15、NaHCO3 2.63、MgCl2·6H2O 0.03、CaCl2·2H2O 0.22。
人工唾液:无机盐混合物1 L,(NH4)2CO3 0.06 g/L,α-淀粉酶75 U/mL,溶菌酶30 mg/L。
人工胃液(pH 2.0)(g/L):无机盐混合物1 L,(NH4)2CO3 0.075,NaCl 4.3,胰蛋白胨15,盐酸L-半胱氨酸盐0.5和胃蛋白酶(400 U/mL),盐酸调pH值到2.0。
人工肠液:无机盐混合物1 L,NaCl 3.5 g/L,胰蛋白酶(180 U/mL)。
1.2 实验方法
1.2.1 格氏乳杆菌TF08-1对病原菌生长的抑制能力
参考LEE等[8]的方法检测格氏乳杆菌对病原菌的抑制能力:将过夜培养的格氏乳杆菌TF08-1培养液离心,取上清液用0.22 μm孔径无菌滤膜过滤,获得无菌上清液。按照V(无菌上清液)∶V(2×BHI培养基)=1∶1混合,然后接种过夜活化的指示菌,置于96孔板中37 ℃培养24 h。培养基中加入相应体积的无菌水作为阳性对照,培养基中加入庆大霉素(终质量浓度100 μg/mL)作为阴性对照。分别检测0 h和24 h的OD600值,记为OD600_0和OD600_24,每组实验设置3个重复。含有上清液/庆大霉素培养基中致病菌存活率的计算如公式(1)所示:
存活率
(1)
1.2.2 格氏乳杆菌TF08-1抑菌机制的初步分析
将过夜培养的格氏乳杆菌TF08-1培养液离心,上清液用0.22 μm孔径无菌滤膜过滤,获得无菌上清液。分别检测上清液中L-乳酸和D-乳酸的含量,然后在新鲜MRS培养基中加入相同浓度的L-乳酸和D-乳酸,参考1.2.1节中的方法检测乳酸的抑菌活性。将MRS培养基用盐酸调到相应pH值,检测其抑菌活性。每组实验设置3个重复。
1.2.3 格氏乳杆菌TF08-1消化道耐受性分析
参考滕堃如等[9]的方法检测格氏乳杆菌TF08-1对消化道的耐受性:将过夜培养的格氏乳杆菌TF08-1离心,弃上清液,菌体用无菌PBS洗涤2次后用等体积PBS重悬。取100 μL菌悬液分别加入到900 μL人工唾液、人工胃液或人工肠液中,37 ℃分别孵育10 min、2 h和2 h。在孵育起始和完成时分别采样,采用稀释涂布平板法检测格氏乳杆菌TF08-1生物量。每组实验设置3个重复。格氏乳杆菌TF08-1存活率的计算如公式(2)所示:
存活率
(2)
1.2.4 格氏乳杆菌TF08-1自聚集能力分析
参考TIAN等[10]的方法检测格氏乳杆菌TF08-1的自聚集能力:将过夜活化的格氏乳杆菌TF08-1培养液涡旋混匀,室温静置30 min,分别检测静置前和静置后上清液的OD600值,记为OD600_0和OD600_30。每组实验设置3个重复。菌株自聚率的计算如公式(3)所示:
自聚率
(3)
1.2.5 格氏乳杆菌TF08-1黏附能力分析
采用细胞爬片法检测格氏乳杆菌TF08-1的黏附能力[11]。取600 μL过夜活化的格氏乳杆菌TF08-1培养液加入到含有细胞爬片的24孔板中培养24 h,然后将菌液吸出,用无菌PBS洗涤24孔板3次,以去除未黏附的细菌。洗涤完成后,将细胞爬片置于含600 μL无菌PSB的无菌均质袋内超声波处理10 min,使菌体扩散到缓冲液中,利用稀释涂布平板法检测缓冲液中格氏乳杆菌TF08-1的生物量。
1.2.6 格氏乳杆菌TF08-1溶血性检测
分别挑取格氏乳杆菌TF08-1、英诺克李斯特氏菌CICC 10417和金黄色葡萄球菌CICC 10473单菌落穿刺接种于血琼脂平板,37 ℃厌氧培养48 h后观察。
1.2.7 格氏乳杆菌TF08-1产生物胺能力的检测
参考GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》检测格氏乳杆菌TF08-1菌体中生物胺,方法如下:将活化后的格氏乳杆菌TF08-1在MRS液体中培养48 h后离心,收集菌体。加入100 g/L三氯乙酸沸水浴1 h。取上清液加入丹磺酰氯进行衍生化反应,氮吹除去丙酮,乙醚萃取后氮吹除去乙醚,沉淀用乙腈溶解。随后利用液相色谱检测溶液中生物胺浓度。液相色谱方法如下:色谱仪为Ultimate 3000,色谱柱为Shim-pack VP-ODS(25 cm,4.6 mm,5 μm,Shimadzu)。梯度洗脱程序参考GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》。检测波长254 nm,上样量20 μL,柱温35 ℃。腐胺、组胺和酪胺的检出限为1.25 μg/g,尸胺为0.75 μg/g。
1.2.8 格氏乳杆菌TF08-1抗生素耐药性的检测
采用微量肉汤稀释法检测格氏乳杆菌TF08-1的抗生素耐药性[12]。将菌株分别接种于含有不同质量浓度氨苄西林(0.032～16 μg/mL)、万古霉素(0.25～128 μg/mL)、庆大霉素(0.5～256 μg/mL)、卡那霉素(2～1 024 μg/mL)、链霉素(0.5～256 μg/mL)、红霉素(0.016～8 μg/mL)、克林霉素(0.032～16 μg/mL)、四环素(0.125～64 μg/mL)或氯霉素(0.125～64 μg/mL)的LSM培养基中,37 ℃厌氧培养48 h后观察结果。
1.2.9 格氏乳杆菌TF08-1遗传稳定性的检测
参考薛梅等[13]的方法检测格氏乳杆菌TF08-1的遗传稳定性。将格氏乳杆菌TF08-1接种于MRS固体培养基,37 ℃厌氧培养24 h记为出发菌株;挑取出发菌株单菌落转接至新鲜MRS固体培养基,37 ℃厌氧培养24 h记为1次,转接20次后观察菌株形态学特征,利用API50CHL乳杆菌属鉴定试剂条分析其生理生化特征,扩增16S rDNA和苯丙氨酸-tRNA连接酶α亚基(pheS)的DNA序列,送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序后进行比较。基因扩增引物序列见表1。
表1 基因扩增所用引物
Table 1 Primers used in this study
基因名称引物序列16S rDNA-FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG16S rDNA-RGGTTACCTTGTTACGACTTpheS-FGGTACTTACATGGAAGCTCGTCTTAAGGAACpheS-RATTTTTGTTCATGTAATCACTCCTTCTTA-AGCACGTTTGAACTGTTG
1.2.10 格氏乳杆菌TF08-1对小鼠致病性的检验
1.2.10.1 腹腔注射
参考《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020版)》进行操作。实验通过北京维通利华实验动物技术有限公司实验动物使用与管理委员会伦理审核(伦理审核编号PA24010401)。挑取半胱氨酸MRS固体培养基上的格氏乳杆菌TF08-1菌落,重悬于生理盐水制备菌悬液,获得浓度为5.9×107 CFU/mL的菌悬液。随后将200 μL菌悬液注射入小鼠腹腔,继续培养21 d后观察小鼠生长状况。实验组和对照组喂养雌雄小鼠各10只。小鼠喂养使用标准实验鼠粮粗饲料,不同组间无区别。
1.2.10.2 经口灌胃
参考《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020版)》进行操作。将过夜活化的格氏乳杆菌TF08-1转接到半胱氨酸MRS液体培养基,37 ℃培养48 h,离心,收集上清液,其中一部分用于菌悬液的制备,另一部分冷冻浓缩至原体积的1/5,获得5倍浓缩上清液;收集菌体,重悬于上清液或5倍浓缩上清液,分别获得浓度为3.9×108 CFU/mL的菌悬液及1.9×109 CFU/mL的5倍浓缩液后经口灌胃。灌胃剂量为20.0 mL/kg·BW,每日灌胃1次,连续灌胃3 d,培养21 d(从第一次灌胃开始算)后观察小鼠生长状况。实验组和对照组喂养雌雄小鼠各10只。对照组分别以上清液及5倍浓缩上清液灌胃小鼠。小鼠喂养使用标准实验鼠粮粗饲料,不同组间无区别。
1.3 数据处理
所有实验均设置3个以上重复。利用Excel的t-test进行2组数据之间的差异性分析,P<0.05为具有显著差异。采用SPSS软件的单因素方差分析进行多组之间的差异分析。
2 结果与分析
2.1 格氏乳杆菌TF08-1对病原菌的抑菌活性
如图1所示,庆大霉素对所有指示菌均表现出抑菌活性,病原菌存活率均在0.34%以下。格氏乳杆菌TF08-1上清液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效率与庆大霉素无显著差异,对大肠杆菌和阴沟肠杆菌的抑制效率低于庆大霉素。在含有格氏乳杆菌TF08-1上清液的培养基中,大肠杆菌和阴沟肠杆菌的存活率分别为(28.47±7.28)%和(16.93±4.99)%。因此,格氏乳杆菌TF08-1可以产生抑菌物质,抑制病原细菌的生长。
图1 四种病原菌在含有庆大霉素或格氏乳杆菌TF08-1上清液培养基中的存活率
Fig.1 Survival of four pathogens in the medium supplemented with gentamicin or the supernatant of L. gasseri TF08-1
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 格氏乳杆菌TF08-1抑菌机制的初步分析
格氏乳杆菌TF08-1上清液中L-乳酸和D-乳酸的含量分别为(5.71±0.18)、(0.98±0.11) g/L。抑菌实验结果表明,病原菌在含有该浓度D-乳酸的培养基中的存活率与对照无显著差异(图2),在含有该浓度L-乳酸的培养基中的存活率为(39.91±6.64)%(铜绿假单胞菌)到(68.10±5.97)%(大肠杆菌)。进一步分析表明,L-乳酸的抑菌效率与相应pH(pH 4.9)及总乳酸pH(pH 4.8)的抑菌效率无显著差异(图2)。格氏乳杆菌TF08-1上清液pH(pH 4.2)低于总乳酸的pH。以pH 4.2的MRS培养基代替上清液,3种病原菌的存活率进一步下降,分别为(36.36±2.46)%(金黄色葡萄球菌)、(54.48±2.53)%(大肠杆菌)和(46.11±5.19)%(阴沟肠杆菌)。以含有总乳酸的MRS培养基代替上清液,铜绿假单胞菌的存活率为(24.88±7.83)%;以pH 4.2的MRS培养基代替上清液,铜绿假单胞菌的存活率分别为(23.47±2.89)%,二者无显著差异。
图2 四种病原菌在含有乳酸和不同pH培养基中的存活率
Fig.2 Survival of four pathogens in the medium supplemented with lactic acid and the medium with different pH
2.3 格氏乳杆菌TF08-1对消化道的耐受性
将格氏乳杆菌TF08-1分别在人工唾液、人工胃液和人工肠液中孵育,结果显示,该菌存活率可达(80.22±10.43)%、(76.45±8.92)%和(105.09±7.15)%。
2.4 格氏乳杆菌TF08-1的定殖能力
将格氏乳杆菌TF08-1静置30 min,其自聚集率可达(70.38±6.53)%。该菌在细胞爬片上的附着量可达(95.93±22.45) CFU/mm2。
2.5 溶血性检测结果
在血琼脂平板上接种受试菌株(图3),结果发现,阴性对照菌株——英诺克李斯特氏菌CICC 10417菌落周围无透明圈,而阳性对照菌株——金黄色葡萄球菌CICC 10473菌落周围出现透明圈。格氏乳杆菌TF08-1菌落周围未出现透明圈,与阴性对照相似,说明格氏乳杆菌TF08-1无溶血活性。
图3 格氏乳杆菌TF08-1溶血性检测结果
Fig.3 Hemolysis test of L. gasseri TF08-1
注:左,英诺克李斯特氏菌CICC 10417;中,金黄色葡萄球菌CICC 10473;右,格氏乳杆菌TF08-1。
2.6 生物胺检测结果
通过高效液相色谱法,未在格氏乳杆菌TF08-1菌体检出腐胺、尸胺、组胺和酪胺,说明格氏乳杆菌TF08-1不产生这几种生物胺或生物胺产量低于检出限。
2.7 格氏乳杆菌TF08-1对抗生素的耐药性
不同抗生素对格氏乳杆菌TF08-1的最小抑制浓度见表2。根据参考文献[12]建议的抗性临界点对该菌株耐药性进行结果判定。结果表明,该菌株对所有检测的抗生素都敏感。
表2 格氏乳杆菌TF08-1的抗生素耐药性检测结果
Table 2 Antibiotic resistance of L.gasseri TF08-1
抗生素最小抑制浓度/(μg/mL)耐药性结果氨苄西林0.5敏感万古霉素1敏感庆大霉素8敏感卡那霉素16敏感链霉素4敏感红霉素0.25敏感克林霉素4敏感四环素4敏感氯霉素4敏感
2.8 遗传稳定性检测结果
将格氏乳杆菌TF08-1转接20次后,MRS固体培养基上菌落呈现白色,圆形,表面湿润,不透明,边缘整齐(图4-b),与出发菌株无明显差异(图4-a);菌体细胞呈现杆状,单个或成对排列(图4-d),与出发菌株无明显差异(图4-c)。转接20次菌株可利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖等碳源,与出发菌株相同(表3)。对16S rRNA和pheS基因进行测序,结果显示,出发菌株和转接20次菌株基因序列完全一致,未发生突变(图5、图6)。因此,格氏乳杆菌TF08-1性状可稳定遗传。
a-出发菌株菌落形态;b-转接20次菌株菌落形态;c-出发菌株菌体形态;d-转接20次菌株菌体形态
图4 格氏乳杆菌TF08-1菌落和菌体形态
Fig.4 Colony and cell morphology of L. gasseri TF08-1
图5 出发菌株和转接20次菌株的16S rDNA序列比较
Fig.5 The sequence of 16S rDNA of L. gasseri TF08-1 in generation 0 and generation 20
图6 出发菌株和转接20次菌株的pheS序列比较
Fig.6 The sequence of pheS of L. gasseri TF08-1 in generation 0 and generation 20
表3 出发菌株和转接20次菌株的代谢特性
Table 3 Metabolic properties of L. gasseri TF08-1 in Generation0 and generation 20
化合物出发菌株转接20次菌株化合物出发菌株转接20次菌株甘油--卫矛醇--D-阿拉伯糖--甘露醇--D-核糖--α-甲基-D-甘露糖苷--L-木糖--N-乙酰葡糖胺++β-甲基-D-木糖苷--熊果苷++D-葡萄糖++水杨苷++D-甘露糖++D-麦芽糖++L-鼠李糖--D-蜜二糖--肌醇--D-海藻糖++山梨醇--D-松三糖--α-甲基-D-葡萄糖苷--D-棉籽糖--苦杏仁苷++糖原--七叶灵++D-龙胆二糖++D-纤维二糖++D-来苏糖--D-乳糖++D-岩藻糖--D-蔗糖++D-阿拉伯醇--菊糖--葡萄糖酸钾--赤藓糖醇--5-酮基-葡萄糖酸盐--L-阿拉伯糖--淀粉--D-木糖--木糖醇--阿东醇--D-土伦糖--D-半乳糖++D-塔格糖++D-果糖++L-岩藻糖--L-山梨糖--L-阿拉伯醇--2-酮基-葡萄糖酸盐--
注：+表示可以生长;-表示不能生长。
2.9 格氏乳杆菌TF08-1的动物致病性
2.9.1 腹腔注射实验结果
雄性小鼠对照组初始体重为(21.5±0.4) g,而实验组初始体重为(21.2±0.7) g,体重无显著差异(图7-a)。将生理盐水注射入小鼠腹腔后继续喂养20 d,雄性小鼠最终体重达到(38.7±2.2) g;而将格氏乳杆菌TF08-1注射入小鼠腹腔,继续喂养21 d,雄性小鼠最终体重为(37.7±2.9) g,和对照组相比,无明显差异(图7-a,P>0.05)。与之相似,雌性小鼠对照组和实验组初始体重分别为(20.7±0.9) g和(21.1±0.8) g,而最终体重分别达到(29.3±1.8) g和(30.4±2.6) g,无显著差异(图7-d,P>0.05)。另外,在小鼠培养过程中,未发现小鼠死亡现象。因此,格氏乳杆菌TF08-1对小鼠体重无影响,并且不会造成受试小鼠死亡。
a-雄性小鼠腹腔注射;b-雄性小鼠经口灌胃培养物原液;c-雄性小鼠经口灌胃培养物浓缩液;d-雌性小鼠腹腔注射;e-雌性小鼠经口灌胃培养物原液;f-雌性小鼠经口灌胃培养物浓缩液
图7 格氏乳杆菌TF08-1对小鼠的致病性
Fig.7 Pathogenicity of L. gasseri TF08-1 in rat
注:NS表示实验组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。
2.9.2 经口灌胃实验结果
实验初期,雄性小鼠实验组和对照组体重无明显差异(图7-b～图7-c,P>0.05)。摄入格氏乳杆菌TF08-1菌悬液21 d后,上清液对照组雄性小鼠体重为(38.0±2.9) g,而实验组雄性小鼠体重为(39.0±1.4) g,二者无显著差异(图7-b,P>0.05)。摄入5倍浓缩上清液后,雄性小鼠体重为(39.0±1.9) g;而摄入5倍浓缩菌体后雄性小鼠体重为(38.6±1.4) g,实验组和对照组雄性小鼠体重无显著差异(图7-c,P>0.05)。雌性小鼠摄入格氏乳杆菌TF08-1菌悬液前后,实验组和对照组体重均无显著差异(图7-e～图7-f,P>0.05)。另外,在小鼠培养过程中,未发现小鼠死亡现象。因此,格氏乳杆菌TF08-1对小鼠未发现致病性。
3 讨论与结论
传统的针对各种疾病的治疗主要依赖于药物。然而,这些药物可能会带来一系列的副作用。因此,开发副作用小的诊疗方案势在必行。近年来,随着人民生活水平的提高和研究的逐步深入,益生菌受到越来越多的关注。对其益生特性和安全性的全面评价,有助于菌株的开发利用。
3.1 格氏乳杆菌TF08-1的抑菌活性
抑菌活性是益生菌的一种重要特性。格氏乳杆菌的抑菌能力存在显著差异。格氏乳杆菌DSM 20077可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)和猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)[14]。而格氏乳杆菌FNMGHLBE6L1可以抑制金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis),但是不能抑制产肠毒素大肠杆菌[15]。本文结果表明,格氏乳杆菌TF08-1对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌均表现出抑菌活性,可以进一步开发为微生态制剂,用于调节肠道菌群,改善肠道微生态。
格氏乳杆菌TF08-1可以产生乳酸。本文的研究表明,乳酸的积累会导致环境中pH的下降,从而抑制病原菌的生长,与前人的研究相符[16]。除乳酸外,格氏乳杆菌还可以发酵产生草酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸[16],导致培养基的pH进一步下降,抑菌效果进一步增强。然而,致病菌在上清液中的存活率显著低于其在相应pH培养基中的存活率,说明pH的下降并不是格氏乳杆菌TF08-1抑菌的唯一因素。研究表明,除乳酸外,格氏乳杆菌还可以产生细菌素、过氧化氢等抑菌物质[2, 15]。不同的格氏乳杆菌中已发现多种细菌素[15],格氏乳杆菌TF08-1中也发现了细菌素编码基因[7]。因此,细菌素在格氏乳杆菌TF08-1抑菌中的作用有待进一步研究。
3.2 格氏乳杆菌TF08-1的抗逆性
目前益生菌的主要摄入方式是口服。格氏乳杆菌TF08-1进入肠道之前,需要通过口腔、胃等消化系统,并在肠道中定殖。其中,口腔中的溶菌酶、胃液中的胃蛋白酶会造成菌体的损伤和死亡;胃液极低的pH也会造成菌体的死亡[9, 17]。因此,益生菌在消化道的存活能力是对其进行评价的另一项重要指标。在pH 2的培养基中培养1 h后,格氏乳杆菌DSM 20077的存活率只有0.7%[14]。分离自健康人体的6株格氏乳杆菌在pH 2的培养基中培养2 h后,其存活率可达75%～85%[18]。因此,格氏乳杆菌在消化道中的存活能力差异较大。本文的结果表明,格氏乳杆菌TF08-1在人工唾液和人工胃液中有较高的存活率,而人工肠液不会影响该菌的生长。因此,格氏乳杆菌TF08-1对消化道环境具有较强的耐受性,有助于其穿过消化道,进入肠道定殖并发挥益生作用。
在肠道环境,益生菌的自聚集可以促进该菌株成为优势菌,并且可以抑制病原菌的入侵[19]。格氏乳杆菌菌株之间的自聚集率差异较大。10株分离自婴儿粪便的格氏乳杆菌静置2 h的自聚集率只有19.02%～33.52%[20],而格氏乳杆菌DSM 20077静置2 h的自聚率只有22.7%,24 h后达到74.2%[14]。格氏乳杆菌TF08-1具有较强的自聚集能力,静置30 min后自聚率即可达到70.38%。因此,该菌可以快速聚集,发挥相应的作用。益生菌在肠道的黏附不仅可以提高其竞争优势,刺激宿主的免疫反应,还可以占据相应的黏附位点,阻止病原菌的黏附[21]。因此,格氏乳杆菌TF08-1的黏附有利于其发挥益生活性。
3.3 格氏乳杆菌TF08-1的安全性
一直以来,乳杆菌被认为是“公认安全菌株”(generally regarded as safe,GRAS)。前期研究表明,格氏乳杆菌TF08-1基因组不含毒力基因[7]。本文结果表明,小鼠腹腔注射和经口灌胃实验也未发现该菌对小鼠生长的不利影响。因此,该菌未检出致病性。益生菌中含有的抗生素抗性基因可能会有传播风险,如果传播到致病菌,则会危害人类健康[22]。本文结果显示,格氏乳杆菌TF08-1未检测到抗生素抗性,不会带来抗生素抗性基因传播的潜在风险。
溶血性是益生菌安全性评价的另一个重要指标。某些致病菌会产生毒素,进而导致血液中红细胞被破坏,即为溶血[23]。溶血会进一步导致溶血性贫血等问题[23]。而红细胞被破坏之后释放的血红蛋白进一步被氧化,释放血红素。过量血红素导致活性氧的积累和细胞损伤,进而引起慢性炎症、肾功能损伤和血管疾病[23]。本文结果显示,格氏乳杆菌TF08-1不具有溶血活性,因此不会对红细胞造成伤害。
生物胺具有多种有益的生理功能,如突触传递、血压控制、免疫反应、体温调节、造血功能和伤口愈合。然而,过量的生物胺会引起功能失调,对人体健康带来危害[24]。本文的结果表明,格氏乳杆菌TF08-1不会产生这些生物胺,因此,不会对人体造成不良影响。
遗传稳定性可以保证生物体在当前的生境中存活,而突变则可能导致菌种衰退等现象,优良的遗传稳定性是益生菌产业化的必备条件[22]。薛梅等[13]检测了鼠李糖乳酪杆菌LV108的传代稳定性,结果发现,该菌传代20次后表型和基因型均未发生显著变化。传代15次后,干酪乳酪杆菌EPS-33和EPS-43胞外多糖产量基本保持不变,而EPS-19的胞外多糖产量显著下降[25]。本文的研究结果表明,传代20次之后,格氏乳杆菌TF08-1的表型未发生显著变化。16S rDNA基因序列是最常见的微生物分类鉴定指标,pheS基因序列也广泛应用于乳杆菌的分类鉴定[26],二者的基因序列均未发生变化。因此,格氏乳杆菌TF08-1的表型和基因型均未检出变异,该菌传代20次之内可以稳定遗传。
综上所述,格氏乳杆菌TF08-1具有较好的益生功能和抗逆性,并且未发现溶血、产生物胺等不良性状,遗传稳定性较强,未检出致病性,适合进一步开发应用。
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