芝麻是世界常见油料作物之一,年产量约为680万t[1]。我国是芝麻加工消费大国,年需求量约140万t[2],其中芝麻香油是主要加工产品。高温芝麻饼粕作为芝麻香油的加工副产物,年产50万t以上[3]。由于高温烘烤加热,芝麻蛋白变性严重,水溶性差,难以提取利用,故高温芝麻饼粕多作为饲料、肥料使用,其蛋白资源(蛋白含量约50%)未得到有效利用。

研究表明,芝麻蛋白是抗氧化肽的前体蛋白[4],故将高温芝麻饼粕蛋白酶解制备抗氧化肽是其高值化利用的有效途径。相较于芝麻蛋白,高温芝麻饼粕蛋白因热变性形成高分子热聚集物[5],部分酶解位点被掩盖,降低酶解效果。为改善酶解效果,多酶水解应用于高温芝麻饼粕酶解[6]。然而,具有外切酶活性风味蛋白酶(Flavourzyme)的引入会生成氨基酸,同时酶解液中还有蛋白质残留与盐类存在,以上杂质需要在分离纯化中除去。

树脂分离是常见分离纯化方法,因其处理量大、成本低、可重复利用、条件温和等优点,已成功应用于多肽分离纯化[7]。然而树脂的分离效果受料液组成、树脂类型、处理条件等多因素影响,故多肽经树脂分离纯化要获得满意效果,需对树脂种类、料液组成与操作条件进行全面研究。目前,针对芝麻抗氧化肽的树脂分离研究有以下空白:缺乏不同树脂对芝麻抗氧化肽分离纯化效果的系统比较,也未明确树脂处理对芝麻多肽组成影响。为推动芝麻抗氧化肽理论研究与工业推广,有必要开展树脂分离纯化芝麻抗氧化肽研究。

本研究以多肽、氨基酸、蛋白质、盐分、抗氧化活性为评价指标,分析极性、中极性、弱极性、非极性大孔吸附树脂、阴离子与阳离子交换树脂等6类20种树脂静态吸附芝麻抗氧化肽的表现。根据树脂的吸附选择性,筛选出适宜树脂D3520,随后分析其吸附前后多肽组成变化,并解析吸附液与洗脱液中多肽的结构差异,以探究树脂纯化多肽的分子机制,为优化树脂纯化蛋白酶解液提供理论参考与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高温芝麻饼粕,河南省久创科技有限公司;胰糜蛋白酶[酶活力(400 349±4 576)U/g],上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碱性蛋白酶(Alcalase)[酶活力(178 152±1 267)U/g]、DPPH、ABTS,Sigma-Aldrich公司;风味蛋白酶[酶活力(197 042±2 477) U/g],安琪酵母股份有限公司;CAD40树脂(中极性大孔吸附,孔径70～80 nm)、HD-8树脂(强酸性阳离子交换)、HP-20树脂(非极性大孔吸附,孔径29～30 nm)、HPD100树脂(非极性大孔吸附,孔径8.5～9 nm)、HPD400树脂(中极性大孔吸附,孔径7.5～8.0 nm)、HPD500树脂(强极性大孔吸附,孔径8.5～9.0 nm)、NKA树脂(非极性大孔吸附)、D3520树脂(非极性大孔吸附,孔径8.5～9 nm),北京瑞达恒辉科技发展有限公司;X-5树脂(非极性大孔吸附,孔径29～30 nm)、AB-8树脂(弱极性大孔吸附,孔径13～14 nm)、XAD16树脂(弱极性大孔吸附)、D101树脂(非极性大孔吸附,孔径100 nm)、NKA-9树脂(极性大孔吸附,孔径15.5～16.5 nm)、DM130树脂(弱极性大孔吸附,孔径9～10 nm),上海麦克林生化科技股份有限公司;D380树脂(弱碱阴离子交换),安徽皖树化工销售有限公司;DM301树脂(中极性大孔吸附,孔径14～17 nm),济宁方与化工有限公司;D113树脂(弱酸阳离子交换),上海开平树脂有限公司;DA201-C树脂(极性大孔吸附,孔径10～13 nm),天津市光复科技发展有限公司;717树脂(强碱性阴离子交换)、732钠型树脂(强酸性阳离子交换)、其他试剂,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限公司;ROTANTA460R离心机,德国Hettich科学仪器公司;Infinite M Nano酶标仪,瑞士TECAN公司;K1100全自动凯氏定氮仪,海能未来技术集团股份有限公司;Lyovac GT1冷冻干燥机,德国SRK公司;Waters 2695液相色谱仪,沃特世科技(上海)有限公司;UltiMate 3000 高效液相与Fusion高分辨质谱仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高温芝麻饼粕蛋白提取

采用碱溶酸沉法,具体条件参考文献[7]的方法。

1.3.2 芝麻抗氧化肽制备

采用多酶联合水解(碱性蛋白酶∶胰糜蛋白酶∶风味蛋白酶活力比为1∶0.98∶1.14),具体酶解条件见参考文献[8],酶解结束后,中和,沸水浴灭酶10 min,8 000 r/min离心10 min,收集上清液,加入3倍体积蒸馏水稀释,得到酶解液置于4 ℃密封保存备用。

1.3.3 树脂预处理

大孔吸附树脂预处理按照文献[9]操作。离子交换树脂的预处理采用GB/T 5476—2013《离子交换树脂预处理方法》。

1.3.4 树脂静态吸附芝麻抗氧化肽试验

结合前人研究[10-11]与前期试验结果,树脂静态吸附试验条件如下:称取8 g处理后树脂加入到100 mL具塞三角瓶,加入24 mL酶解液在25 ℃以120 r/min 振荡10 h后,过滤并分别收集吸附液与树脂。100 mL蒸馏水冲洗树脂、滤纸吸干树脂表面液体后,将树脂转移至具塞三角瓶,加入30 mL 75% (体积分数)乙醇以120 r/min振荡10 h,过滤收集洗脱液。分别取酶解液、吸附液、洗脱液测定多肽、蛋白质、氨基酸、盐的浓度,以及抗氧化活性和颜色变化。按照公式(1)～公式(3)分别计算多肽、氨基酸、蛋白、盐的吸附率、解析率、回收率(残留率)。

吸附率

(1)

解吸率

(2)

回收率(残留率)

(3)

式中:c1、c2、c0,吸附液、洗脱液与酶解液中某种物质(多肽、蛋白、氨基酸、盐)质量浓度,mg/mL;V1、V2、V0,吸附液、洗脱液与酶解液的体积,mL。

树脂吸附导致吸附液与洗脱液的颜色变化,采用脱色率评价,将酶解液、吸附液与洗脱液的多肽浓度稀释至1.0 mg/mL,在397 nm处测定吸光度,按公式(4)计算脱色率:

脱色率

(4)

式中:A0,酶解液吸光度;Ax,吸附液或洗脱液的吸光度。

1.3.5 多肽分子质量分布测定

采用体积排除色谱测定芝麻酶解液、吸附液、洗脱液的多肽组成,色谱条件:配置色谱柱BioCore SEC-300 (5 μm,7.8 mm×300 mm),流动相150 mmol/L磷酸盐缓冲液,流速0.7 mL/min,柱温 25 ℃,进样量20 μL,检测波长214 nm;Marker为IgG(150 000 Da)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(66 430 Da)、小肽VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM(3 246 Da)、酪氨酸(181 Da)。在获得各个分子质量范围的峰面积以计算浓度组成,随后乘以多肽浓度与体积,获得不同分子质量区间肽段的质量,从而推断不同分子质量多肽在树脂吸附解吸过程中的迁移规律。

1.3.6 多肽序列测定

分别取2 mL芝麻蛋白酶解液、D3520的吸附液与解吸液,加入0.6 mg的Gln-Cys-Lys-Glu (QCKE),混匀后,采用液质联用测定多肽组成,色谱测定条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC CSH130 C18,流速0.25 mL/min,进样量20 μL,柱温45 ℃,检测波长215 nm,流动相A为体积分数0.1%甲酸水溶液,流动相B为体积分数0.1%甲酸乙腈溶液,使用梯度洗脱程序进行分离,梯度洗脱程序:0～2 min,5%B;2～40 min,5%～28%B;40～50 min,28%～40%B;50～52 min,40%～90%B;52～56 min,90%B;56～56.1 min,90%～5%B;56.1～60 min,5%B。

质谱条件:正离子检测模式,一级质谱扫描分辨率120 000,一级质谱扫描范围300～1 500 m/z,最大注入时间80 ms;母离子隔离窗口1.6 m/z,AGC target为3E+6,二级质谱扫描分辨率30 000,AGC target为1E+5,离子最大注入时间45 ms。采用PEAKS Studio 8.5 (Bioinformatics Solutions Inc.Waterloo, Canada)软件进行解析和检索分析,数据库为NCBI下载的芝麻(Sesamum)物种蛋白数据库。当多肽符合芝麻蛋白片段或多肽的肽段平均可信度(average local confidence, ALC)>90%(肽链长度<4,ALC>50%即可),则上述多肽为鉴定多肽。根据QCKE的峰面积,计算其他多肽组分浓度。

1.3.7 多肽浓度测定

参照文献[6]的方法测定,计算酶解液中多肽浓度。

1.3.8 水溶蛋白浓度测定

考马斯亮蓝法测定酶解液蛋白浓度,BSA作为标准蛋白,595 nm处进行测定。

1.3.9 游离氨基酸浓度测定

测定方法参考文献[6]的方法,标样采用GBW(E)100062氨基酸混合溶液标准物质,测定波长570 nm。

1.3.10 盐分测定

取10 mL样品液加入坩埚,采用GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定。

1.3.11 抗氧化活性测定

将多肽质量浓度稀释至1、1、2 mg/mL分别用于测定DPPH、ABTS、羟自由基清除活性,DPPH与ABTS测定参照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性测定——DPPH和ABTS法》,羟自由基测定参照朱金卫等[12]的方法,分别加入0.2 mL 2 mg/mL多肽溶液、0.2 mL 9 mmol/L FeSO4、0.2 mL 9 mmol/L水杨酸、0.2 mL 8.8 mmol/L H2O2,其中H2O2最后加入。37 ℃反应60 min,随后15 000 r/min离心6 min,取200 μL上清液加入96孔板,510 nm处检测吸光度。羟自由基测定如公式(5)所示:

羟自由基清除率

(5)

式中:A0,对照(双蒸水)吸光度;As,多肽样品的吸光度;As0,样品背景吸光度(体系中无H2O2)。

1.3.12 多肽性质预测

由于ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php)操作简单、资源开放、准确性好[13],采用ToxinPred预测多肽的疏水性、亲水性、空间位阻、pI等性质。

1.4 数据处理

无特殊说明,实验平行测定3次。单因素方差分析(Duncan算法)采用SPSS 26计算,显著水平0.05。火山图绘制采用Origin 2022的Volcano plot APP,Fold change为2,P值取0.01。多肽性质分布图中趋势经Kernel smooth曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 树脂吸附解吸多肽表现

树脂吸附多肽的表现受树脂种类、极性、孔径、比表面积影响。由图1可知,大孔树脂的吸附芝麻肽的效果优于离子交换树脂,这可归因于2种树脂分离机制差异,即大孔树脂兼具化学与物理吸附,主要通过范德华力、氢键等分子间作用力实现物质选择性吸附,并结合其多孔结构产生的分子筛效应对吸附质进行分离。离子交换树脂依赖表面功能基团与溶液中的离子发生可逆置换反应实现分离,阳离子树脂释放H+或Na+吸附阳离子,阴离子树脂释放OH-吸附阴离子。由于多数多肽分子的净电荷弱于溶液中的盐离子,离子交换树脂优先与盐离子发生交换吸附,从而减少对多肽的吸附。

除DA-201C外,其余大孔树脂均能成功吸附芝麻肽,但解吸行为却有显著差异,这与大孔树脂的极性有关。芝麻蛋白富含疏水氨基酸,酶解后得到多肽多呈现非极性或弱极性,因此与非极性树脂结合紧密,而与极性树脂吸附力较弱。当采用75%乙醇溶液洗脱树脂时,芝麻多肽更易从中高极性大孔树脂解吸。另外,大孔树脂的孔径也会影响多肽洗脱[14]。非极性大孔树脂HP-20与D101的孔径分别是30 nm与100 nm,而非极性大孔树脂NKA-9的孔径约为15 nm。当芝麻肽进入小孔径孔洞后,其与树脂结合紧密,难以解吸,导致NKA-9的解吸率弱于HP-20与D101。

2.2 树脂吸附蛋白质与氨基酸表现

受蛋白质与氨基酸结构性质差异的影响,树脂对芝麻酶解液中蛋白质与氨基酸的分离行为有显著差异,尤以离子交换树脂突出。如表1所示,离子交换树脂未能有效吸附酶解液中蛋白质,却能有效吸附氨基酸,随后水洗、醇洗也未洗脱氨基酸,导致蛋白质、氨基酸分别富集于吸附液与树脂中。产生上述结果的原因,蛋白质结构相较于氨基酸更加完整,更容易将疏水区域藏于内部,从而难以与树脂形成疏水作用,同时,蛋白质的体积远大于氨基酸,使其难以进入树脂的孔洞;另外,氨基酸在非等电点的环境下带净电荷,而蛋白净电荷弱或受空间遮蔽,故离子交换树脂更易于氨基酸发生吸附,而对蛋白的吸附效果不佳。类似现象见树脂分离罗非鱼低聚肽的研究[15]。

另外,树脂极性也会影响脱除蛋白与氨基酸的效果。多数非强极性大孔树脂对氨基酸的去除效果优于蛋白,而强极性大孔树脂对二者的去除性能相近。这可能是强极性大孔树脂与氨基酸、蛋白质的疏水作用较弱,当采用乙醇洗脱时,较易破坏疏水作用,导致蛋白质、氨基酸进入洗脱液中。非强极性大孔树脂表现较好的吸附氨基酸能力的原因:除氨基酸进入大孔树脂内部,通过氢键、范德华力等非共价键与树脂结合外[16],芝麻蛋白酶解产物中疏水与中性氨基酸比例较高,易与弱极性、非极性大孔树脂形成稳定疏水作用结合,导致难以洗脱。

2.3 树脂吸附蛋白与氨基酸表现

根据盐残留率可知(图2),离子交换树脂的脱盐效率显著优于大孔树脂,尤其强阳离子交换树脂HD-8与732(Na)的盐残留率最低(在16%以下)。不同种类大孔树脂的盐吸附率相近(均约60%),但盐解吸率却差异显著,强极性大孔树脂的盐解吸率较低,这符合强极性大孔树脂由自身极性基团与盐离子形成强静电吸附,阻碍盐离子在乙醇溶液中解吸。故树脂吸附处理,非、弱、中极性大孔树脂的盐残留率为25%～30%,而强极性大孔树脂的盐残留率处于17.5%～21%。以上结果与强极性大孔树脂DA201-C纯化草鱼肽时盐残留率小于20%的结果一致[17]。

由图3可知,各种树脂均能吸附芝麻蛋白酶解液的色素,但脱色能力有明显差异,其中离子交换树脂的脱色效果最佳,强极性大孔树脂的脱色效果较差,非、弱、中极性大孔树脂的脱色效果居中。这与徐秉歆等[18]报道“离子交换树脂脱除鱼籽蛋白色素的效果弱于弱极性大孔树脂”的结果相反,产生以上差异的原因应与色素种类、吸附条件有关。75%乙醇洗脱后,大孔树脂洗脱液的脱色率约为20%,而离子交换树脂的脱色率在50%以上,这表明乙醇洗脱可以有效削弱大孔树脂与色素间非共价结合,使色素释放到洗脱液中。

2.4 树脂处理对多肽抗氧化活性的影响

由图4可知,绝大多数的树脂洗脱液的抗氧化活性显著强于对应的吸附液,且大孔树脂洗脱液的抗氧化活性优于未经树脂纯化的芝麻蛋白酶解液,这表明芝麻多肽中抗氧化肽经大孔树脂吸附富集后,主要存在于洗脱液中,这与草鱼抗氧化肽[17]、罗非鱼皮抗氧化肽[19]的大孔树脂纯化行为相一致。由非极性大孔树脂D3520的洗脱液的DPPH、ABTS阳离子与羟自由基清除能力均居于前列,且其他非极性大孔树脂的洗脱液抗氧化活性也较高可知,芝麻抗氧化肽应含有较多疏水性氨基酸残基,这与前人结论相符[4]。疏水性氨基酸残基有助于多肽抗氧化活性的形成与提高[20],故非极性大孔树脂洗脱液中多肽呈现较强抗氧化活性。

鉴于多肽抗氧化活性,并结合多肽回收率、蛋白与氨基酸残留率、脱盐与脱色表现,D3520适宜处理芝麻蛋白酶解液。

2.5 D3520纯化对芝麻多肽组成的影响

由表2可知,对比D3520吸附液中多肽组成发现,洗脱液中分子质量低于30 kDa的多肽多于吸附液,分子质量高于30 kDa的多肽少于吸附液,这说明相较于高分子质量多肽,低分子质量多肽疏水结构暴露易于与大孔树脂形成疏水相互作用,另外,体积小、空间位阻小,更易接近或进入树脂,发生吸附作用。林利美等[17]在DA201-C纯化草鱼肽时也发现多肽平均分子质量下降现象。

采用液质联用从芝麻蛋白酶解液、吸附液、洗脱液分别鉴定出1 480、556、893条多肽(具体见电子版增强出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044009),其中吸附液与洗脱液的多肽均源于酶解液,部分多肽在水洗过程中损失。对吸附液与洗脱液中的多肽进行显著性分析(电子版增强出版附表2)后,采用火山图分析筛选出显著差异多肽(图5),相较于吸附液多肽浓度,有788条多肽为下调差异多肽(典型洗脱液多肽),392条多肽为上调差异多肽(典型吸附液多肽)。

由于差异多肽数目多,采用合成多肽随后分析性质的方法效率低、耗时长、花费高[21],故采用ToxinPred预测差异多肽理化性质(电子版增强出版附表3),从中归纳两类多肽的结构性质差异。两类多肽在亲水性、疏水性、空间位阻、pI的分布差异见图6。

相较于吸附液多肽,洗脱液多肽亲水性弱,疏水性强,空间位阻小,pI分布较宽,在pI>6仍有大量分布。鉴于D3520为非极性大孔树脂,故易于疏水性多肽发生吸附,另外,小尺寸多肽也易于接近树脂表面与内部。由吸附环境为中性、洗脱液多肽与吸附液多肽的pI分别为(6.94±2.02)与(5.19±1.40)可知,吸附液多肽带净负电荷,而洗脱液多肽则接近电中性,弱电荷状态减弱静电排斥的干扰,有利于吸附发生。但考虑两类多肽的亲水性、疏水性、空间位阻与pI无显著差异,多肽与树脂的吸附解吸并非由单一因素主导,而是受多种因素共同影响,其吸附机制仍需研究。

3 结论与讨论

3.1 不同种类树脂分离纯化芝麻蛋白酶解液效果分析

对比20种树脂分离纯化芝麻蛋白酶解液的效果发现:树脂纯化效果受树脂种类、极性、结构、目标多肽性质等因素协同影响。因分离机理差异,离子交换树脂在离子交换机制作用下,能较好地除去酶解液中的蛋白质、氨基酸、盐分与色素,但难以吸附芝麻抗氧化肽;而大孔树脂凭借疏水吸附与分子筛分机制有效富集纯化抗氧化肽。大孔树脂的种类也会影响纯化效果,相较于强极性大孔树脂,非极性、弱极性大孔树脂洗脱液的抗氧化活性更高,这与疏水氨基酸残基有助于提升多肽抗氧化活性有关[20, 22]。另外,大孔树脂孔径也会影响树脂吸附多肽、氨基酸、蛋白质的表现,如大孔径的非极性大孔树脂虽会增加多肽损失率,但会提升氨基酸的去除效果。前人也有大孔树脂孔径影响黄酮、多糖分离效果的类似报道[23-24]。故选择树脂分离纯化多肽溶液时,应综合考虑树脂的理化性质、目标多肽性质与溶液环境等因素,以实现目标肽类的高效富集与杂质有效去除。

3.2 非极性大孔树脂D3520吸附多肽行为解析

对比D3520吸附液与洗脱液中多肽组成发现,非极性大孔树脂吸附多肽的机理较为复杂,受多肽尺寸、极性、疏水性、亲水性、溶液环境等多种因素共同影响。这可以通过吸附液与洗脱液的多肽在不同分子质量范围内均有分布,两种溶液体系中多肽的空间位阻、pI、疏水性与亲水性均无显著差异以印证。但比较两类多肽理化性质分布趋势,可推断出分子质量小、空间位阻低、疏水性强、高pI值的多肽更易被非极性大孔树脂吸附,该推断与草鱼多肽经大孔树脂分离能富集高疏水性多肽的结果一致[25]。

根据20种树脂吸附芝麻蛋白酶解液的表现可知,树脂种类会显著影响分离纯化芝麻抗氧化肽的效果。综合多肽抗氧化活性、多肽回收率与杂质残留情况,非极性大孔树脂D3520适宜分离纯化芝麻抗氧化肽。D3520与多肽间的吸附受疏水作用、静电极性、空间位阻的影响,空间位阻小、pI高、疏水性强的多肽更易被D3520吸附。在后续研究中,拟以D3520为基础,引入离子交换树脂采用混合床法以提升对蛋白、氨基酸等杂质去除效果;另外,通过改变吸附洗脱条件深入解析D3520吸附多肽的作用机制,为探索非极性大孔树脂与多肽吸附解吸机制提供理论参考与数据依据。

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Screening of the suitable resin for separation and purification of sesame antioxidant peptides

LU Xin1, ZHANG Lixia1,2*, SUN Xiaojing1,2, SUN Qiang1,3, SONG Guohui1,2, HUANG Jinian1,2,3

1(Center of Agricultural Products Processing of Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China)

2(Henan Engineering Research Centre of Bioactive Substances in Agricultural Products, Zhengzhou 450002, China)

3(Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China)

ABSTRACT To identify the appropriate resin for the separation and purification of the sesame antioxidant peptides, the performance of 20 resins belonging to 6 types on the static adsorption of sesame protein hydrolysate were investigated with peptide recovery, impurity residue and antioxidant activity as evaluation indexes, the molecular weight distribution and composition of absorbed and unabsorbed peptides originated from macroporous resin D3520 were analyzed, finally, the difference on structural characteristics between absorbed and unabsorbed peptides was explored.Results showed that the type and structure of resin significantly affected the behavior of isolation and purification of sesame antioxidant peptides by resins, such as ion exchange resins were suitable for removing impurities (amino acid, protein, salt, pigment) in enzymatic hydrolysate, while the nonpolar macroporous resin was good at enriching the sesame antioxidant peptide.According to the performance on antioxidant activity and recovery of peptide, impurity removal, D3520 was suitable to separate and purify the sesame antioxidant peptide.Compared with the unabsorbed peptides after treated by D3520, the molecular weight distribution of absorbed peptides was concentrated to the low molecular weight, the kinds of absorbed peptides were 1.6 times more than unabsorbed peptides, the absorbed peptides showed higher hydrophobicity, lower steric hindrance, and higher pI.These findings provide the preliminary basis for optimizing the separation and purification of sesame antioxidant peptide or other peptides by resin, and also provide the date reference for exploring the adsorption mechanism of resin to peptides.

Key words macroporous resin;ion exchange resin;antioxidant activity;impurity removal;peptide composition

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044009

引用格式：芦鑫,张丽霞,孙晓静,等.筛选用于分离纯化芝麻抗氧化肽的树脂[J].食品与发酵工业,2026,52(9):205-212.LU Xin, ZHANG Lixia, SUN Xiaojing, et al.Screening of the suitable resin for separation and purification of sesame antioxidant peptides[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(9):205-212.

第一作者：博士,副研究员(张丽霞副研究员为通信作者,E-mail:414679034@qq.com)

基金项目：河南科技研发计划联合基金(应用攻关)项目(242103810085);国家特油产业技术体系(CARS-14)

收稿日期：2025-07-23,改回日期：2025-09-03