酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)正在成为全球肝脏相关死亡及肝硬化、肝细胞癌发病的首要因素[1],对人类生命健康和社会经济均造成了严重的影响。当前治疗手段主要依赖于调整患者生活方式、补充营养物质、使用皮质类固醇等药物[2],总体而言疗效欠佳,长期给药甚至可能导致骨质疏松、血糖升高、感染风险增加等多种副作用[3]。肝脏是乙醇吸收、代谢的主要场所,乙醇及其毒性代谢物所介导的肝脏氧化应激稳态失调、脂质代谢紊乱、激活促炎转录因子等多种生物学过程是酒精性肝损伤的主要的发病机制[4]。因此,筛选具有增强肝脏抗氧化、抗炎能力的天然产物成为当前肝病研究的重要方向之一[5]。蜂王浆(royal jelly,RJ)是工蜂咽下腺、下颚腺产生的一种分泌物,素有“超级食品”的美称,具有抗氧化、抗炎、抗衰老、调节神经系统、肝保护等多种生理功能[6]。已有研究表明,RJ的生物活性可能归因于其关键功能组分,包括脂类物质[如10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid, 10-HDA)]、活性蛋白[如王浆主蛋白(major royal jelly proteins, MRJPs)]以及小分子代谢物(如维生素和氨基酸)[7]。
近年来,RJ及其功能组分因具有良好的抗氧化活性而受到广泛关注,在治疗酒精性肝损伤方面呈现出良好前景。如王金胜[8]发现RJ能显著提高谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性,明显抑制脂质过氧化,对CCl4诱导的急性肝损伤起保护作用。冯彤彤等[9]的研究也表明,RJ水溶蛋白可通过提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性抵抗高糖所致HUVEC细胞的损伤。此外,牛佳卉等[10]的研究表明,王浆酸能够有效提升酒精性肝损伤小鼠肝脏中GSH-Px和SOD的活性,提高谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,同时降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,从而显著抑制脂质过氧化反应,对肝脏起到良好的保护作用。FOCAK等[11]的研究表明,CCl4诱导了Wistar大鼠肾毒性和肝脏损伤,具体表现为酮尿、蛋白尿、高肌酐和尿素水平升高,血液学指标异常(如贫血、白细胞增多),以及肝细胞的细胞遗传学损伤和低蛋白血症。研究发现,RJ在保护肝肾损伤方面比蜂胶提取物更为显著,2种提取物都能有效调节蛋白尿、酮尿和低蛋白血症,减少肝脏中的血小板聚集,并通过增加红细胞数目保护贫血,减少白细胞数量则可能与其抗炎作用相关。总体而言,蜂胶提取物和RJ对CCl4引起的肝肾损伤、贫血和炎症反应具有积极的保护作用。
然而,对RJ及其主要活性成分在修复酒精诱导氧化损伤方面作用的直接比较研究还较为缺乏。基于此,本研究拟通过超滤透析、真空冷冻干燥及甲醇-二氯甲烷提取法等方法获得王浆主蛋白(major royal jelly proteins, MRJPs)及王浆脂(royal jelly lipids, RJL),并对其进行定性分析。随后系统评估RJ、MRJPs、RJL对酒精诱导HepG2细胞氧化损伤的修复作用差异,阐明其核心功效物质。为RJ作为潜在天然保肝保健药物或食品的综合开发利用提供方向,为RJ高值化开发利用打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料与试剂
RJ原浆,南京老山药业股份有限公司;透析膜(12～14 kDa),上海源叶生物科技有限公司;甲醇(色谱纯)、二氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯),上海麦克林生化科技股份有限公司;DMEM高糖完全培养基,武汉普诺赛生命科技有限公司;PBS、胰蛋白酶、双抗、HepG2细胞,二代逆转录试剂盒,武汉塞维尔生物科技有限公司;细胞存活率测定(CCK-8)试剂盒,碧云天生物技术公司;总蛋白定量测试试剂盒(BCA法)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)试剂盒、MDA测定试剂盒、GSH测定试剂盒、SOD测定试剂盒,南京建成生物工程研究所。
1.1.2 仪器与设备
3H20RI智能高速冷冻离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;HJ-4A磁力加热搅拌器,深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司;Multiskan FC型酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;UV-6100紫外可见光分光光度计,上海元析仪器有限公司;DHP-9272电热恒温培养箱,上海齐欣科学仪器有限公司;Agilent 1290-6470三重四极杆液质联用仪、7890A液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;CFX Connect型荧光定量PCR仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;ETC811型PCR仪,北京东胜创新生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 MRJPs的分离提取
参考HU等[12]的方法,将RJ按固液比1∶9(g∶mL)溶于pH=7的磷酸缓冲液中,在4 ℃下磁力搅拌至两者混合均匀,后于10 000 r/min离心40 min。收集上清液,用截留分子质量12～14 kDa的透析膜透析24 h,将所得溶液真空冷冻干燥即为MRJPs冻干粉。随后通过SDS-PAGE法测定蛋白质组成及分子质量范围。
1.2.2 RJL的分离提取
参考陈伊凡[13]的提取方法,将新鲜RJ样本置于烧杯中,以1∶4(g∶mL)的固液比加入CH2Cl2∶MeOH混合溶剂(体积比=2∶1),经振荡混合后室温静置,重复操作3次以充分萃取。随后在3 000 r/min条件下离心15 min,收集下层有机相,向有机层中按1∶4(体积比)加入去离子水去除蛋白杂质,振荡分层后再次离心分离,将下层有机相转移至新管中,采用氮气吹干法挥干溶剂直至形成透明脂质膜。随后通过GC-MS对RJL中的脂肪酸组成进行定性分析。依据GB 9697—2008《蜂王浆》中规定的10-HDA含量检测方法,并结合实验室前期建立的脂肪酸标准曲线对RJ中10-HDA的含量进行准确计算。
1.2.3 采用CCK-8法检测RJ、MRJPs、RJL及无水乙醇对HepG2细胞活力的影响
细胞活力检测可直接反映药物对细胞存活和增殖的影响。基于细胞活力检测,能够确定无水乙醇(ethanol, EtOH)对肝细胞的体外损伤剂量并观察RJ及其提取物对HepG2细胞活力的促进作用[14]。
使用CCK-8试剂盒检测细胞活力,具体操作方法为:将细胞以5×104的密度接种于96孔板中,每孔添加100 μL的细胞悬液。培养48 h后,弃去原培养基,每孔加入100 μL含不同质量浓度RJ、MRJPs、RJL(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1、1.5、2 mg/mL)及乙醇(50、100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 mmol/L)的培养基,培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液。在培养箱孵育2 h后,采用酶标仪检测每孔的吸光度(OD=450 nm),每组做6个复孔,重复3次。细胞活力的计算如公式(1)所示:
细胞活力
(1)
式中:As,给药组吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液、药物);Ac,对照组吸光度(含细胞、细胞、培养基);Ab,空白组吸光度(培养基、CCK-8溶液,不含细胞、药物)。
1.2.4 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤HepG2细胞存活率的影响
根据1.2.3节所述方法,细胞培养24 h后分为3组:对照组、模型组和给药组。对照组和模型组每孔加入100 μL完全培养基,而给药组则分别使用含不同质量浓度(0.2、0.4 mg/mL)RJ、MRJPs和RJL的完全培养基处理24 h。孵育结束后,弃去上清液,除对照组外,其余孔均加入600 mmol/L乙醇溶液以诱导细胞损伤,持续24 h后,使用上述CCK-8法检测细胞活力。
1.2.5 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤HepG2细胞中各生化指标的影响
HepG2细胞经胰蛋白酶消化离心(1 000 r/min,5 min)后,加入PBS重悬离心,洗涤细胞3次,弃上清液,留细胞沉淀。向细胞沉淀中加入0.5 mL PBS后混匀细胞溶液,冰水浴条件下手动匀浆,得到充分破碎后的细胞匀浆。按各制造商的说明书操作,分别检测细胞中ALT和AST的渗漏量及细胞中SOD、GSH的活性和MDA的含量。
1.2.6 RJL对酒精损伤HepG2细胞中氧化应激、酒精代谢及炎症细胞因子表达水平的影响
从细胞中提取总RNA,使用逆转录试剂盒于PCR仪上完成逆转录。采用2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行荧光定量PCR。以GAPDH为内参基因,利用2-ΔΔCt法对各个基因表达量进行相对定量分析。细胞样本引物序列如表1所示。
表1 引物序列信息
Table 1 Primer sequence information
基因名称上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)GAPDHGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCTGATGACCCTTTTGGCTCCCNrf2TGAGGTTTCTTCGGCTACGTTCTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGGHO1TTCCCCAACATTGCCAGTGATCGGAGAAGCGGAGCCTTNF-αTCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGAAGACCCCTCCCAGATAGAIL-6ATGAGGAGACTTGCCTGGTGAACTCTGGCTTGTTCCTCACTACTCTCADHAAGACTCACAGTCTGCTGGTGTGCATTTGATTACTTTTCCTGCTGTPPARαCACGGAAAGCCCACTCTGCGGTATTCCGTAAAGCCAAAGC
1.2.7 数据处理
实验数据经 SPSS Statistics 22.0处理,以“平均值±标准差”形式表示3次重复实验的结果。当P<0.05时,认为差异具有统计学意义。实验结果的图表通过GraphPad Prism 10进行绘制。
2 结果与分析
2.1 MRJPs分离提取结果的鉴定
如图1所示,结合相关文献针对MRJPs的分子质量的报道[15],推测从上到下的5个条带分别是MRJP5(72 kDa)、MRJP4(68 kDa)、MRJP3(64 kDa)、MRJP1(57 kDa)、MRJP2(49 kDa)。
图1 MRJPs组分的SDS-PAGE鉴定结果
Fig.1 Identification of major royal jelly proteins components by SDS-PAGE analysis
2.2 RJL中脂肪酸的GC-MS检测结果
总离子流图如图2所示,经质谱图解析,共鉴定出15种化合物,分析结果显示,RJ脂提取物主要由中链脂肪酸如10-HDA、辛酸甲酯,以及长链脂肪酸如十二碳和十六碳脂肪酸组成。利用面积归一化方法测定了各组分的相对含量列于表2,结果表明,在这些脂质组分中10-HDA的相对含量最高,达39.05%,是RJL中最主要的脂肪酸成分,该发现与先前文献报道的结果一致[16]。在气相条件下,根据峰面积之间的关系以及实验室前期研究得到的标准曲线计算出RJ中10-HDA的含量为(5.52±0.02)%。
图2 RJL的GC-MS总离子流图
Fig.2 GC-MS chromatogram of RJL
表2 RJL的气质解析结果
Table 2 GC-MS analysis of RJL
保留时间/min组分相对含量/%5.457辛酸甲酯 0.539.9893-羟基癸酸甲酯4.7511.72310-羟基癸酸甲酯17.2412.329癸二酸二甲酯12.8512.57010-HDA39.0513.1192-十二烯二酸二乙酯13.4813.531十一羟基十二烷酸甲酯2.4713.766十一烷二酸二甲酯0.5214.355反式-2-十六烯酸甲酯0.5014.68111-羟基十二烷酸甲酯0.4015.391十二烷二酸二甲酯1.5316.272反式-2-十二烯二酸二甲酯0.9616.638十六烷酸甲酯3.3719.991硬脂酸甲酯1.8129.284四碳酸甲酯0.56
2.3 不同质量浓度RJ、MRJPs、RJL对HepG2细胞活力的影响
不同质量浓度RJ、MRJPs、RJL及酒精对HepG2细胞活力的影响如图3所示。随着RJ及其提取物质量浓度增加,细胞活力呈现出先升高后下降的趋势。当药物质量浓度达0.4 mg/mL时,与药物质量浓度为0 mg/mL的对照组相比,RJ、MRJPs、RJL处理使细胞活力分别提高了18.63%、32.8%、46.75%。然而,当RJ及其提取物质量浓度超过1 mg/mL时,细胞活力显著下降(P<0.05),表现出明显细胞毒性。因此,综合不同质量浓度RJ及其提取物对细胞活力的促进作用,选定0.2、0.4 mg/mL作为后续实验的低浓度组和高浓度组,以进一步探究RJ及其提取物对HepG2细胞的影响。
a-RJ;b-MRJPs;c-RJL
图3 不同浓度RJ、MRJPs和RJL对HepG2细胞活力的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of RJ, MRJPs, RJL on cell viability of HepG2 cells
注:与药物质量浓度为0 mg/mL的对照组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01),***表示差异高度显著(P<0.001)。
2.4 不同浓度无水乙醇对HepG2细胞活力的影响
由图4可知,无水乙醇浓度在100～2 000 mmol/L区间内逐渐升高时,HepG2细胞活力随之降低(呈剂量依赖性)。当无水乙醇浓度超过100 mmol/L时,细胞活力开始受到显著抑制。400、600、800 mmol/L无水乙醇处理下的细胞活力分别为(69.43±7.28)%、(56.25±9.15)%及(42.59±10.85)%。根据氧化应激模型构建标准,应当选择使细胞活力降至50%～70%的浓度作为造模浓度。且此前已有研究表明,细胞系中的乙醇浓度达到200 mmol/L或更高时,该浓度与认为酗酒者血液中的乙醇浓度相当[17]。综合考虑损伤效果及成本,在后续实验中选择600 mmol/L的乙醇浓度诱导HepG2细胞氧化损伤。
图4 不同浓度无水乙醇对HepG2细胞活力的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of ethanol on cell viability of HepG2 cells
注:与药物浓度为0 mmol/L的对照组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01),***表示差异高度显著(P<0.001)。
2.5 RJ、MRJPs、RJL对无水乙醇损伤HepG2细胞的保护作用
如图5结果所示,在给药保护的正式实验中,模型组在600 mmol/L无水乙醇作用下,细胞活力降至(45.61±3.15)%,与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。干预结果显示,与模型组相比,除0.2 mg/mL的RJ组外,其余处理组均能剂量依赖性地显著提高无水乙醇损伤HepG2细胞活力。在0.4 mg/mL RJ、MRJPs、RJL处理组的细胞活力较模型组分别提升了46.81%、69.29%及93.57%。其中,RJL处理组细胞活力可恢复至(88.29±2.71)%,保护效果显著优于同质量浓度的MRJPs处理组和RJ处理组(P<0.05)。上述结果表明,高质量浓度RJ及其组分均能有效改善酒精诱导的氧化应激损伤,且总体而言保护效能RJL>MRJPs>RJ,提示RJ对肝细胞的保护作用可能很大程度上来自RJL的贡献。与兰天等[18]的研究结果一致,该文对RJ及其粗蛋白提取物、蛋白类功能因子提取物和脂类功能因子提取物的改善睡眠作用进行研究。腹腔注射对氯苯丙氨酸构建失眠小鼠模型后,比较不同干预处理对小鼠睡眠潜伏期、睡眠时长、血清中5-羟色胺、多巴胺水平及失眠症状相关神经递质异常表达的影响,最终得出结论,RJ中发挥促睡眠作用的主要功效成分可能为脂类提取物,蛋白类功能因子在其中起到辅助协同效果。
图5 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤HepG2细胞的保护作用
Fig.5 Protective effects of RJ, MRJPs, and RJL against ethanol-induced damage in HepG2 cells
注:与对照组相比,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01),###表示差异高度显著(P<0.001);与模型组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01),***表示差 异高度显著(P<0.001)(图6～图8同)。
已有研究发现,RJL能够通过下调细胞因子NO的分泌,抑制炎症因子IL-6、IL-10、iNOS和TNF-α mRNA的表达以抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应。同时,RJL中所含有的多不饱和脂肪酸组分有助于维持细胞膜的完整性和流动性,防止细胞内容物泄漏和有害物质侵入,保护细胞结构的完整性[19]。此外,10-HDA作为RJL中占比最多的特征性脂肪酸,能够增强线粒体膜电位,加强质子梯度,从而提高耦合电子传递链的效率并导致产生更多的ATP,它还能够上调NADPH,提供一定程度的还原能力以减少氧化副产物的产生,提高线粒体功能效率[20]。基于以上研究结果,推断RJL通过抑制炎症反应、增强细胞膜完整性及提高线粒体功能效率等多种机制对肝细胞发挥保护作用,减轻HepG2细胞受到的氧化损伤。
2.6 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤的HepG2细胞AST、ALT及其比例的影响
正常肝细胞中ALT和AST活性的水平比血清中的ALT和AST活性水平高1 000～5 000倍,当肝细胞受损时,细胞内容物泄漏,血清中转氨酶活性水平将显著增加。转氨酶活性水平是评估肝脏健康的细胞渗漏和功能障碍的重要指标,因此,本研究采用肝功能指标ALT、AST来验证模型是否构建成功并评估肝细胞损伤的程度[21]。由图6-a和图6-b可知,在600 mmol/L的乙醇浓度作用下,与对照组相比,模型组培养基中ALT和AST水平显著提高至(15.58±2.64)、(36.4±3.52) U/g prot(P<0.001),表明乙醇诱导HepG2细胞氧化损伤模型构建成功。RJ及其提取物可剂量依赖性抑制乙醇诱导的AST、ALT泄露,其中高剂量RJL处理组可将培养基中ALT、AST水平分别降至(8.38±0.58)、(9.13±0.29) U/g prot,显著优于同质量浓度RJ及MRJPs处理组,表明RJL在保护肝细胞方面具有更为优越的效果,该结果与细胞活力的增加一致(图5)。
a-ALT;b-AST;c-AST/ALT
图6 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤HepG2细胞ALT、AST、AST/ALT的影响
Fig.6 Effects of RJ, MRJPs, and RJL on ALT, AST, AST/ALT in alcohol-damaged HepG2 cells
临床上常使用AST/ALT的比值来判断肝损伤的程度,其中,AST/ALT<1表示肝细胞状态良好,肝损害较轻;AST/ALT>1时,表示肝细胞进一步损伤,大量酶泄露。实验结果显示,对照组AST/ALT比值为0.88<1,而模型组比值显著升高至2.36,表明酒精对HepG2细胞造成了严重损伤(P<0.05)。高剂量RJ、MRJPs、RJL处理可将AST/ALT比值分别恢复至1.56、1.32及1.09,其中0.4 mg/mL RJL处理组比值已恢复至接近对照组水平,显著优于同浓度RJ处理组和MRJPs处理组(P<0.05),进一步证实了RJL在缓解乙醇肝毒性方面具有显著优势。这可能是由于RJL中含量较高的10-HDA通过激活Nrf2/ARE通路增强内源性抗氧化防御体系,使细胞内源抗氧化剂(如SOD、GSH)水平提升,从而降低机体肝细胞损伤相关的转氨酶外泄。此外,RJL中的其他脂肪酸成分对酒精损伤HepG2细胞也具有保护作用,如已有研究表明,10-羟基癸酸可通过p53-自噬途径和p53-NLRP3通路减轻神经炎症反应,表明其具备一定的抗炎活性,能够抑制酒精诱发的炎症反应,减轻肝细胞所受损伤[22]。RJL中所含的十六烷酸甲酯和硬脂酸甲酯能够抑制脂多糖引起的炎性介质NO的产生,表明它们对酒精诱发的肝细胞炎症反应同样具有抑制效果。
2.7 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤的HepG2细胞SOD、GSH活性及MDA含量的影响
如图7-a和图7-b所示,对照组SOD、GSH活性分别为(52.71±2.00)、(14.45±0.51) U/mg prot,经600 mmol/L酒精损伤24 h后两者活性显著降低(P<0.05),分别降至(16.08±1.05)、(4.73±0.31) U/mg prot,再次证实氧化损伤模型构建成功。与模型组相比,RJ、MRJPs、RJL处理组中SOD、GSH活性均呈剂量依赖性回升,特别是当RJL质量浓度为0.4 mg/mL时,SOD、GSH活性显著提高至(56.41±2.76)、(13.96±0.98) U/mg prot,且酶活力显著高于同浓度RJ、MRJPs处理组(P<0.05)。这一结果表明,与RJ、MRJPs相比,RJL在提升SOD、GSH活性方面有更显著的效果,其作用机制可能是依靠自身自由基清除能力提高细胞抗氧化酶活性,缓解细胞所受的乙醇毒性。
a-SOD;b-GSH;c-MDA
图7 RJ、MRJPs、RJL对酒精损伤HepG2细胞SOD、GSH及MDA含量的影响
Fig.7 Effects of RJ, MRJPs, and RJL on on SOD, GSH, MDA contents in alcohol-damaged HepG2 cells
a-Nrf2;b-HO-1;c-TNF-α;d-IL-6;e-ADH;f-PPARα
图8 不同剂量RJL对酒精损伤HepG2细胞中Nrf2、HO-1、TNF-α、IL-6、ADH、PPARα基因相对表达量的影响
Fig.8 Effects of different doses of RJL on the relative expression levels of Nrf2, HO-1, TNF-α, IL-6, ADH, and PPARα in HepG2 cells after different doses of RJL treatment for alcohol-induced damage
乙醇暴露会导致自由基大量积累,并引发多不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应。这些不稳定物质会进一步分解,持续生成MDA等氧化产物,因此,MDA含量可以一定程度上反映出细胞氧化损伤程度。如图6-c所示,与对照组相比,模型组的MDA含量显著上升至(1.86±0.07) nmol/mg prot(P<0.05)。与模型组相比,在0.4 mg/mL RJ、MRJPs及RJL的预保护作用下,MDA含量分别显著下降了22.29%、36.16%及67.07%。MDA水平的降低表明高剂量RJ及其提取物均能减轻酒精诱导的氧化损伤,且其中RJL的效果更为显著。RJL的护肝作用与其特征性脂肪酸息息相关,10-HDA作为RJL中相对百分含量最高的脂肪酸,其护肝机制可能涉及辅助调节肝脏细胞因子、加速酒精代谢以及减少脂质过度积累。这种机制有助于降低一次性大量酒精摄入对肝脏造成的损伤程度,并且长期服用王浆酸还可有效增强肝脏的抗氧化能力。此外,10-HDA还能够激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase alpha, AMPK-α)信号通路,进而抑制乙酰辅酶A羧化酶的活性,减少脂肪酸合成,降低肝脏脂质沉积,从而减轻肝细胞的脂肪变性及损伤[23]。另一方面,RJL中所含有的其他脂肪酸组分同样可以作为自由基清除剂,通过其分子结构中的—OH基团和C
C双键,与活性氧(如羟自由基)发生多步氧化反应,有效清除自由基,减少氧化应激对肝细胞的损伤[24]。
本研究发现,酒精诱导HepG2细胞使细胞存活率下降,ALT和AST泄漏水平增加,细胞内SOD和GSH活力降低,同时产生大量MDA。已有研究表明,一些天然产物如食叶草酵素、灯盏花素、鲟鱼籽酶解液可通过激活Nrf2信号通路提高抗氧化应激能力、改善肝脏细胞功能及减少细胞凋亡等机制,从而有效缓解酒精引起的肝细胞损伤[25-27]。RJ及其提取物预处理也显示出类似的保护作用,能够减少细胞中ALT及AST的泄漏,提高细胞SOD及GSH活力并减少MDA积累,与上述已报道的研究结果基本一致,进一步验证了RJ及其提取物对酒精诱导的HepG2细胞损伤具有一定的保护作用。
2.8 RJL对酒精损伤HepG2细胞中氧化应激、酒精代谢和炎症细胞因子表达水平的影响
上述实验表明,RJL在维持细胞转氨酶活性水平及氧化应激稳态等方面均具有显著优势,可能为RJ的核心保肝活性物质。已有研究表明,酒精可造成肝细胞氧化应激和炎性损伤,为探究RJL发挥肝脏保护作用的分子机制,本研究对酒精损伤HepG2细胞中酒精代谢、抗氧化酶及炎症因子相关基因的表达进行了检测。
Nrf2可通过控制包括下游靶基因HO-1在内的多种抗氧化和解毒酶基因的表达,帮助维持细胞内的氧化还原平衡,是研究Nrf2信号通路的重要组成部分。如图8所示,与对照组相比,模型组中Nrf2及HO-1基因表达水平显著降低(P<0.05,P<0.001),RJL干预后两者mRNA表达显著上调(P<0.001),表明RJL可通过调控体内抗氧化基因的表达以缓解酒精诱导的肝氧化损伤。ABOONABI等[28]的研究也表明,花青素可通过激活Nrf2-ARE信号通路抵抗细胞损伤。酒精的摄入会使NF-κB大量表达,它可与多种炎症因子如TNF-α、IL-6启动子区域中κB位点相结合,促进相关细胞炎症因子的表达,引发肝细胞炎症或死亡。RJL干预显著逆转了模型组中TNF-α与IL-6表达水平的反常升高,表明RJL可通过抑制炎症基因的表达,缓解酒精诱导的肝脏炎症反应。肝细胞中的乙醇代谢依赖乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶。与对照组相比,模型组中ADH的mRNA表达高度显著下调(P<0.001),RJL低、高剂量组中ADH的mRNA表达均显著上调(P<0.001),说明RJL可提高ADH的mRNA表达水平,加速乙醇向乙醛转化。AMPK是肝脏脂质代谢的核心调节因子,酒精暴露可显著抑制AMPK磷酸化水平,使过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)的转录激活受损。与对照组相比,模型组中PPARα基因表达水平高度显著降低(P<0.001),高剂量RJL干预后PPARα的mRNA表达高度显著上升(P<0.001),表明RJL发挥保肝作用还与机体代谢调节密切相关。
3 结论
本研究系统解析了RJ活性组分的化学特征,并通过体外实验系统比较了RJ、MRJPs、RJL在保护受损肝细胞、体外抗氧化活性、抑制脂质过氧化等方面的生物活性差异。结果表明,在0.4 mg/mL质量浓度下,RJ、MRJPs和RJL预处理均能显著提升无水乙醇损伤HepG2细胞的细胞活力,较模型组(45.61%)分别提高了 46.81%、69.29% 和 93.57%,保护效能表现为 RJL>MRJPs>RJ。这些物质均具有良好的体外抗氧化活性,能够剂量依赖性地抑制转氨酶外泄,并提升内源抗氧化剂水平,其中RJL的调控效果最优。此外,在抑制脂质过氧化方面,与模型组相比,在0.2、0.4 mg/mL RJL的作用下,MDA含量水平分别下降了43.02%、67.07%,抑制效率显著高于同浓度RJ、MRJPs处理组,进一步证明了RJL可能为RJ的核心保肝活性物质,MRJPs在其中起到协同辅助作用。机制研究表明,RJL通过上调抗氧化、酒精代谢及脂质代谢相关基因的表达,并抑制炎症因子mRNA表达水平,显著缓解酒精诱导的氧化损伤。本研究不仅为RJ在天然保肝保健药物或食品开发中的应用提供了理论依据,更为其高附加值转化指明了关键活性靶标。然而,本研究仅以HepG2细胞模型为切入点,对RJ及其提取物的保肝作用开展了初步探究。鉴于单一细胞模型可能存在的局限性,后续研究拟构建小鼠急性酒精性肝损伤模型,联合非靶向代谢组学技术,探明RJ及其中的活性物质对急性酒精性肝损伤的保护效应及其作用机制。
[1] DEVARBHAVI H, ASRANI S K, ARAB J P, et al.Global burden of liver disease:2023 update[J].Journal of Hepatology, 2023, 79(2):516-537.
[2] 张效威, 刘宜杭, 张润东, 等.中医药治疗酒精性肝病的组方用药规律及作用机制研究[J].中药新药与临床药理, 2024, 35(8):1246-1254.ZHANG X W, LIU Y H, ZHANG R D, et al.Analysis of prescription medication rules and mechanism of action of traditional Chinese medicine in the treatment of alcoholic liver disease[J].Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology, 2024, 35(8):1246-1254.
[3] JAURIGUE M M, CAPPELL M S.Therapy for alcoholic liver disease[J].World Journal of Gastroenterology, 2014, 20(9):2143-2158.
[4] SONG X L, CUI W J, MENG F Y, et al.Glucopyranose from Pleurotus geesteranus prevent alcoholic liver diseases by regulating Nrf2/HO-1-TLR4/NF-κB signalling pathways and gut microbiota[J].Food &Function, 2022, 13(5):2441-2455.
[5] 褚佳豪, 居瑞军, 樊远红, 等.芦荟皮提取物对急性酒精性肝损伤的保护作用与机制[J].食品工业科技, 2023, 44(1):378-388.CHU J H, JU R J, FAN Y H, et al.Protective effect and mechanism of Aloe bark extract on acute alcoholic liver injury[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(1):378-388.
[6] 阚默, 王继凤, 明思彤, 等.蜂王浆药理作用研究进展[J].特产研究, 2020, 42(6):55-59.KAN M, WANG J F, MING S T, et al.Research progress of pharmacological effects of royal jelly[J].Special Wild Economic Animal and Plant Research, 2020, 42(6):55-59.
[7] CAIXETA D C, TEIXEIRA R R, PEIXOTO L G, et al.Adaptogenic potential of royal jelly in liver of rats exposed to chronic stress[J].PLoS One, 2018, 13(1):e0191889.
[8] 王金胜. 蜂王浆对CCl4导致小鼠肝损伤保护作用的研究[D].福州:福建农林大学, 2014.WANG J S.Protective effects of royal jelly on carbon tetrachloride-induced liver injury in mice[D].Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry University, 2014.
[9] 冯彤彤, 张慧, 陈坤, 等.蜂王浆水溶蛋白对高糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].华西药学杂志, 2024, 39(4):392-394.FENG T T, ZHANG H, CHEN K, et al.Protective effects of water-soluble royal jelly protein on high glucose induced human umbilical vein endothelial cells[J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2024, 39(4):392-394.
[10] 牛佳卉, 袁静, 张慧芳, 等.王浆酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].食品工业科技, 2020, 41(3):291-296.NIU J H, YUAN J, ZHANG H F, et al.Protective effect of royal jelly acid on the alcohol liver injury in mice[J].Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(3):291-296.
[11] FOCAK M, SULJEVIC D.Ameliorative effects of Propolis and royal jelly against CCl(4)-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity in wistar rats[J].Chemistry &Biodiversity, 2023, 20(1):e202200948.
[12] HU H, WEI Q H, SUN Z H, et al.Development of a freshness assay for royal jelly based on the temperature- and time-dependent changes of antimicrobial effectiveness and proteome dynamics of royal jelly proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(36):10731-10740.
[13] 陈伊凡. 蜂王浆脂肪酸的抗炎活性及其机制研究[D].杭州:浙江大学, 2019.CHEN Y F.Anti-inflammatory effects and underlying mechanisms of royal jelly fatty acids[D].Hangzhou:Zhejiang University, 2019.
[14] TANG Z, ZHAN L, HE R R, et al.Hepatoprotective effect of tea composite solid beverage on alcohol-caused rat liver injury[J].Foods, 2023, 12(22):4126.
[15] RAMANATHAN A N K G, NAIR A J, SUGUNAN V S.A review on Royal Jelly proteins and peptides[J].Journal of Functional Foods, 2018, 44:255-264.
[16] 于心雨, 李珊珊, 陶凌晨, 等.蜂王浆中脂肪酸标志物检测方法的研究进展[J].食品工业科技, 2023, 44(3):499-507.YU X Y, LI S S, TAO L C, et al.Recent advances in determination methods of fatty acid markers in royal jelly[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(3):499-507.
[17] YOU Y, MIN S, LEE Y H, et al.Hepatoprotective effect of 10% ethanolic extract from Curdrania tricuspidata leaves against ethanol-induced oxidative stress through suppression of CYP2E1[J].Food and Chemical Toxicology, 2017, 108:298-304.
[18] 兰天, 汪玲, 余贤娴, 等.蜂王浆及其提取物对失眠小鼠的睡眠改善作用[J].食品研究与开发, 2022, 43(20):83-90.LAN T, WANG L, YU X X, et al.Effects of royal jelly and its extracts on sleep improvement in mice with insomnia[J].Food Research and Development, 2022, 43(20):83-90.
[19] 李喜艳, 王加启, 卜登攀, 等.多不饱和脂肪酸对细胞膜功能影响的研究进展[J].生物技术通报, 2009, 25(12):22-26.LI X Y, WANG J Q, BU D P, et al.Advanced research of effect of polyunsaturated fatty acids on cell membrane function[J].Biotechnology Bulletin, 2009, 25(12):22-26.
[20] YUAN C Y, YANG S Z, GAO C M, et al.Biologically synthesized 10-Hydroxy-2-Decenoic acid activates cornified envelope formation via PPARα signaling, and regulates oxidative respiratory chain to improve mitochondrial function[J].Journal of Functional Foods, 2024, 122:106505.
[21] CHEN Y J, ZHANG X L, ZHENG Z H, et al.In silico prospecting of ADH activating peptides from Pacific oyster (Crassostrea gigas) and protective effect on ethanol-induced damage in HepG2 cells[J].Food Chemistry, 2025, 479:143777.
[22] TAKAHASHI K, SUGIYAMA T, TOKORO S, et al.Inhibitory effect of 10-hydroxydecanoic acid on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production via translational downregulation of interferon regulatory factor-1 in RAW264 murine macrophages[J].Biomedical Research, 2013, 34(4):205-214.
[23] TANG M Y, WANG X Z, WANG S, et al.10-Hydroxy-2-decenoic acid attenuates nonalcoholic fatty liver disease by activating AMPK-α signaling pathway[J].Biochemical Pharmacology, 2025, 231:116648.
[24] FAN P, SHA F F, MA C, et al.10-hydroxydec-2-enoic acid reduces hydroxyl free radical-induced damage to vascular smooth muscle cells by rescuing protein and energy metabolism[J].Frontiers in Nutrition, 2022, 9:873892.
[25] 李宪秀, 何涛, 毛旸晨, 等.食叶草酵素对HepG2细胞酒精性损伤的保护作用及机制[J].食品科学, 2025, 46(14):179-186.LI X X, HE T, MAO Y C, et al.Protective effect and mechanism of edible grass(Rumex patientia L.× Rumex tianschanicus A.LOS)jiaosu on alcohol-induced injury in HepG2 cells[J].Food Science, 2025, 46(14):179-186.
[26] 陈羽, 张清秀, 谷仕艳, 等.灯盏花素通过Nrf2信号通路改善HepG2细胞急性酒精性肝损伤[J].中南农业科技, 2024, 45(3):43-49;75.CHEN Y, ZHANG Q X, GU S Y, et al.Ligustrazine improves acute alcoholic liver injury in HepG2 cells via the Nrf2 signaling pathway[J].South-Central Agricultural Science and Technology, 2024, 45(3):43-49;75.
[27] 林春燕, 赵甜甜, 刘俊, 等.鲟鱼籽酶解液对酒精诱导HepG2细胞氧化损伤的保护效果研究[J].食品与发酵工业, 2025, 51(17):93-99.LIN C Y, ZHAO T T, LIU J, et al.Protective effect of sturgeon roe enzymatic hydrolysate powder on alcohol-induced oxidative damage of HepG2 cells[J].Food and Fermentation Industries, 2025, 51(17):93-99.
[28] ABOONABI A, SINGH I.Chemopreventive role of anthocyanins in atherosclerosis via activation of Nrf2-ARE as an indicator and modulator of redox[J].Biomedicine &Pharmacotherapy, 2015, 72:30-36.