近年来,随着人民生活水平不断提升,巴氏杀菌乳市场需求量不断增大。食品中菌落总数是判断食品加工过程卫生情况的关键指标,也是重要的出厂检验依据。而实践中巴氏杀菌乳的出厂检验面临实际问题:巴氏杀菌乳保质期相对较短,但菌落总数的出厂检验检测则耗时较长,客观上无法做到终产品按国标法检测并待结果合格后再出厂放行。因此,开发食品微生物快速检测技术,并比较其与国标方法(平板计数法)结果之间的差异性和一致性,成为巴氏杀菌乳出厂检验亟待解决的重要问题之一。
食品微生物快速检测技术具有高通量处理、特异性和高灵敏度等特点[1],是食品安全风险防控的有效手段。近年来,随着免疫学技术、电阻抗技术、分子生物学技术、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术等的研究和应用,食品微生物快速检测方法发展迅速[2]。其中,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生物发光法因其操作快速简便,检出率高[3],在医药[4]、环境[5]、化妆品[6]等领域应用较为广泛。其原理是基于萤火虫发光原理,将含有ATP的食品样本与荧光素酶、荧光素等试剂混合时,ATP作为反应底物触发相应化学反应,从而产生荧光信号被仪器检测到[7-8],且使用光电倍增管时,可以检测浓度低至103～104 CFU/mL的细菌[9]。目前ATP生物发光法在食品工业中的应用研究涵盖肉制品[10]、饮料酒[11]、乳制品[12]等领域,且已有研究证明,ATP生物发光法与国标法检测结果相比,显示出良好的线性关系,检测结果稳定可靠[13]。但目前对低温短保质期巴氏杀菌乳中菌落总数的检测验证鲜有开展。
本研究在前期相关研究基础上[14-15],以巴氏杀菌乳中的菌落总数为研究对象,采用ATP生物发光法与国标法结合,建立了巴氏杀菌乳中菌落总数与ATP荧光值的数学模型,并与国标法进行比对分析,验证了ATP生物发光法在巴氏杀菌乳菌落总数检测中的应用,可解决传统检测方法耗时长与产品保质期短之间的矛盾、满足企业出厂检验需求、确保产品合规出厂。同时,采用ATP生物发光法研究了不同杀菌条件下巴氏杀菌乳中菌落总数的变化规律,这对优化杀菌工艺、提高生产效率和降低成本具有重要意义。最后,本研究讨论了建立巴氏杀菌乳出厂检验标准的可行性,为实际生产和监管提供了参考。
1 材料与方法
1.1 ATP生物发光法与国标法对比
1.1.1 仪器与试剂
Charm EPIC-PLUS微生物检测系统、EPIC1000复合荧光试剂,北京中检葆泰生物技术有限公司;GR60DA型高压灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司;DHP-9052恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;JZ-Vortex3000旋涡振荡器,北京九州晟欣科技有限公司;HWS-24水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;BSC-1100IIA2-X生物安全柜,山东博科生物产业有限公司;电子天平,上海精密科学仪器有限公司;移液器(5～50 μL、100～1 000 μL),赛默飞世尔科技(中国)有限公司;一次性吸头(200 μL、1 000 μL);玻璃容量瓶(100 mL);EP管(2 mL)等。
大肠埃希氏菌(CICC 10389);平板计数琼脂培养基(PCA),广东环凯微生物科技有限公司;无菌生理盐水。
1.1.2 试验方法
1.1.2.1 微生物ATP荧光值与菌落总数相关关系
取出冷藏于斜面培养基中的大肠埃希氏菌CICC 10389,将其划线接种于培养皿内,于36 ℃培养24 h。取10 mL无菌生理盐水,注入已划线培养24 h的培养基表面,打散其表层菌落并收集至无菌玻璃试管内,振荡、摇匀,作为菌悬液原液备用。为将菌悬液原液稀释至不同浓度梯度,用无菌原料乳进行10倍系列稀释,制备得到菌落总数范围约6～1.7×106 CFU/mL的系列稀释液。吸取1 mL稀释液,按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》测定其菌落总数。再分别吸取各梯度下稀释液50 μL并转移至样品杯中,另加入25 μL复合荧光试剂,振荡并充分混匀后,用Charm EPIC-PLUS微生物检测系统测定各样品荧光值。重复该操作,并对菌落总数(CFU/mL)与 ATP荧光值(RLU/50 μL)开展数学建模。
1.1.2.2 巴氏杀菌乳 ATP荧光值与菌落总数相关关系
为确保巴氏杀菌乳样本测定准确性,随机选取36份巴氏杀菌乳样品。分别按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》规定的方法测定其内含菌落总数;再吸取50 μL样品溶液并转移至样品杯中,另加入25 μL复合荧光试剂,振荡并充分混匀后,用Charm EPLC-PLUS微生物检测系统测定各样品荧光值。针对测得的36对菌落总数(CFU/mL)与ATP荧光值(RLU/50 μL)数据间潜在的关联关系构建数学模型,并计算分析其检出限及该模型预测准确性。
1.2 不同杀菌工艺条件下巴氏杀菌乳菌落总数的变化规律
1.2.1 样品信息
2024年5月至2024年12月期间,采集了不同杀菌条件下的巴氏杀菌乳样品。样品来源包括:某乳制品生产企业提供的原料乳样品(序号1)72份、对应批次的工业化杀菌样品(序号3)72份(杀菌条件:72 ℃、15 s)、对应批次的实验室模拟杀菌处理样品72份(序号4)(杀菌条件:85 ℃、15 s)、对应批次的工业化杀菌样品72份(序号2)(杀菌条件:65 ℃、30 min)。具体样品信息见表1。
表1 样品信息
Table 1 Sample information
序号样品信息杀菌条件样本数量1原料乳—722工业化杀菌样品65 ℃、30 min723工业化杀菌样品72 ℃、15 s724实验室模拟杀菌处理样品85 ℃、15 s72
所有样品采集后均立即置于含冰袋的冷藏箱中低温保存,并迅速运送至实验室进行后续检测。
1.2.2 试验方法
采用ATP生物发光法对巴氏杀菌乳中的菌落总数进行测定。
1.2.3 数据处理
对原料乳及经不同条件杀菌后的菌落总数等数据,采用SPSS 26.0软件中非参数检验功能进行比较分析。
2 结果与分析
2.1 ATP生物发光法与国标法对比
2.1.1 微生物ATP荧光值与菌落总数的关联关系模型
接种大肠埃希氏菌CICC 10389并按上述方法重复测定其菌液菌落总数与ATP荧光值5次,获得46对菌落总数及其对应ATP荧光值数据,并构建微生物ATP荧光值与菌落总数的相关关系模型如公式(1)所示。
lg(菌落总数)=1.565×lg(ATP荧光值)-1.617
(1)
式中:菌落总数,CFU/mL;ATP荧光值,RLU/50 μL,两者均取常用对数(以10为底)。两者相关系数(R2)为0.982,模型线性耦合良好。其中,ATP荧光值最大为2.0×105 RLU/50 μL,最小为6.5×101 RLU/50 μL,对应的菌落总数最多为1.7×106 CFU/mL,最少为6.0×100 CFU/mL。
按照前述方法测定14对样品的菌落总数与ATP荧光值,并验证所构建两者关联关系模型预测结果的准确性:即将ATP荧光值的数值代入公式(1),得到菌落总数的常用对数值,进一步换算得到菌落总数的预测值。结果(图1,表2)显示,该预测值与经平板计数法实测菌落总数值对比,两者无明显差异,即ATP生物发光法与平板计数法测定菌落总数的评价效果基本一致。
图1 大肠埃希氏菌ATP荧光值与菌落总数的关联关系模型
Fig.1 Correlation model between ATP fluorescence value and total bacterial count of Escherichia coli
表2 大肠埃希氏菌菌落总数的实测值及模型预测值
Table 2 Measured values and model-predicted values of the total number of E. coli colonies
序号ATP荧光值/(RLU/50 μL)lg(ATP荧光值)lg(菌落总数预测值)菌落总数预测值/(CFU/mL)菌落总数平板计数法实测值/(CFU/mL)1671.831.24 1.74×1019.00×1002651.811.22 1.66×1011.00×10131172.071.62 1.55×1021.17×10242912.462.24 1.73×1021.04×10258732.942.99 9.67×1021.90×10369812.993.06 1.16×1032.00×10371 6433.223.42 2.60×1033.80×10381 2423.093.23 1.67×1033.90×10397 7423.894.47 2.94×1046.50×104108 5123.934.53 3.42×1046.70×1041144 8714.655.66 4.61×1053.80×1051229 8874.485.39 2.44×1053.90×10513157 3985.206.52 3.28×1061.30×10614230 3875.366.78 5.96×1061.70×106
2.1.2 巴氏杀菌乳中ATP荧光值与菌落总数的数学模型及其预测结果验证
将测得的36对巴氏杀菌乳样品的菌落总数/(CFU/mL)常用对数与ATP荧光值/(RLU/50 μL)常用对数构建关联关系模型(图2),去掉其中最高浓度平板菌落总数<30 CFU的样品数据。
图2 巴氏杀菌乳ATP荧光值与菌落总数的关联关系模型
Fig.2 Correlation model between ATP fluorescence value and total bacterial count in pasteurized milk
巴氏杀菌乳中菌落总数与ATP荧光值的相关数学模型可见公式(2):
lg(菌落总数)=1.871×lg(ATP荧光值)-2.105
(2)
式中:菌落总数,CFU/mL;ATP荧光值,RLU/50 μL,两者均取常用对数(以10为底)。两者相关系数(R2)为0.931,模型线性耦合较好。其中,ATP荧光值最大为790 RLU/50 μL,最小为38 RLU/50 μL,对应的菌落总数最多为2.2×103 CFU/mL,最少为1.5×101 CFU/mL。
按照前述方法测定12对样品的菌落总数与ATP荧光值,并验证所构建两者关联关系模型预测结果的准确性:即将ATP荧光值数值代入公式(2),得到菌落总数常用对数值,进一步换算得到菌落总数的预测值。结果(表3)表明,将该预测值与国标法测得的菌落总数实际值对比,两者无明显差异,即ATP生物发光法测定菌落总数的数据与平板计数法实测结果基本一致。
表3 巴氏杀菌乳菌落总数的实测值及模型预测值
Table 3 Measured values and model predicted values of total bacterial count in pasteurized milk
序号ATP荧光值/(RLU/50 μL)lg(ATP荧光值)lg(菌落总数预测值)菌落总数预测值/(CFU/mL)菌落总数平板计数法实测值/(CFU/mL)143043.634.694.94×1042.70×104238793.594.614.07×1042.70×104340843.614.654.48×1044.00×10444692.672.897.81×1021.30×10255052.702.958.97×1021.30×10264672.672.897.75×1021.30×10274622.662.887.60×1023.60×10283322.522.614.09×1022.31×1029871.941.523.34×1011.30×10110611.791.241.72×1011.00×10111521.721.111.28×1011.30×10112411.610.918.18×1001.50×101
2.2 不同杀菌工艺条件下巴氏杀菌乳菌落总数的变化规律
采用ATP生物发光法对原料乳及经不同工艺杀菌的样品进行测定,根据公式(2)计算出样品的菌落总数,并分析不同杀菌工艺条件下巴氏杀菌乳菌落总数的变化规律。相关结果如表4所示。
表4 原料乳及不同杀菌工艺下巴氏杀菌乳中菌落总数的变化
Table 4 Changes in total bacterial count of raw milk and pasteurized milk under different sterilization processes
样品信息杀菌条件菌落总数/(CFU/mL)原料乳—87 721.13±55 455.80a工业化杀菌样品65 ℃、30 min503.52±145.39d工业化杀菌样品72 ℃、15 s1 437.15±225.60b实验室模拟杀菌处理样品85 ℃、15 s664.28±166.08c
注：同一处理不同列之间小写字母代表样品间存在显著差异(P<0.05)。
分析可知,原料乳样品的菌落总数为(87 721.13±55 455.80) CFU/mL,显著高于所有经杀菌处理的样品(x2=213.98,P<0.05),表明几种杀菌工艺均能有效降低微生物数量以达到杀菌效果。分析不同杀菌条件所得巴氏杀菌乳样品菌落总数可知,经65 ℃、30 min,72 ℃、15 s和85 ℃、15 s处理后的样品菌落总数分别为(503.52±145.39)、(1 437.15±225.60) CFU/mL和(664.28±166.08) CFU/mL。其中,65 ℃、30 min处理的样品菌落总数最低,这可能是由于实验室条件下样品升温至65 ℃时间较长,升温过程中虽然温度较低但也具有一定的杀菌作用,从而降低了菌落总数;而85 ℃、15 s处理的样品菌落总数低于72 ℃、15 s处理的样品,这表明随着杀菌强度的增加,菌落总数显著下降,也说明在较短时间内,较高温度可更有效地杀灭微生物。65 ℃、30 min,72 ℃、15 s和85 ℃、15 s处理的样品菌落总数总体在同一数量级上,差异较小,说明在一定范围内,不同杀菌温度和时间组合在降低微生物总数方面的效果相近,故在实际生产中可根据具体需求选择最适杀菌条件,而不必过分追求极高温度或过长时间,从而在保证杀菌效果的前提下,通过优化工艺提高生产效率和降低成本。
3 建议与展望
3.1 加强ATP生物发光法在巴氏杀菌乳出厂检验中的应用研究
长期以来,低温短保质期巴氏杀菌乳出厂检验耗时长的问题,给企业的合规管理带来困难。目前虽有研究验证了ATP生物发光法与国标法的相关性,但对巴氏杀菌乳产品中菌落总数研究少有涉及,且此类研究多以ATP荧光值(RLU)作为评价指标,而未与其他微生物检测方法结果进行交叉验证[16-18]。本研究以ATP荧光值的常用对数值与菌落总数预测值的常用对数值进行线性化建模,经与GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物检验 菌落总数测定》方法所测菌落总数结果对比发现,二者间无显著差异。因此可以认为,将ATP生物发光法用于巴氏杀菌乳中菌落总数测定,可以有效解决其检测耗时长的问题,该方法的推广应用,将有助于提高企业出厂检验效率、完善出厂检验规程。今后,建议乳品企业应加强对ATP生物发光法等快速检验方法的研究与推广,并充分验证其与国标法结果的一致性,为出厂检验方法标准化提供依据。
3.2 根据需要科学选择最适巴氏杀菌时间温度组合
巴氏杀菌可保留生牛乳中优质蛋白、脂肪、维生素等营养物质,但过度加工会造成牛乳中活性成分和重要营养物质的损失,若热处理强度不够,巴氏杀菌乳中的微生物又无法被杀灭,造成食品安全风险,因此科学选择巴氏杀菌条件至关重要。本研究表明,牛乳经巴氏杀菌处理后,不同时间温度下结果均显著降低了菌落总数[19-20]且在一定范围内相差较小。因此,实际生产中不必过分强调杀菌强度,以避免产生因过高杀菌温度或过长杀菌时间导致产品活性成分和营养物质损失。今后,建议企业应根据具体生产需求,科学选择最适巴氏杀菌条件,在确保食品安全的基础上,提高生产效率和降低生产成本。
3.3 探索建立巴氏杀菌乳出厂检验标准的可行性
根据前期研究的结论,采用科学的检验方法可显著提高低温短保质期巴氏杀菌乳出厂检验效率、提升产品的市场价值,因此建立巴氏杀菌乳出厂检验规程标准具有重要意义。今后,建议从以下几方面探索相关标准建立的可行性:一是应确保乳品巴氏杀菌效果验证,微生物快速检测方法应通过科学评估,并与食品安全国家标准交叉验证。巴氏杀菌乳出厂时,对于短时间内可完成检测的质量安全指标必须进行检验,对微生物可采用快检方式进行,若合格则产品可先放行,但仍需同步采用国家标准方法进行检测,可作为必要验证指标为后续追溯或突发情况备查以及数据监测等使用。二是应严格防控巴氏杀菌乳原料的微生物风险。确保生乳的微生物指标符合相关国家标准要求,但对巴氏杀菌乳的原料检验应更加严格,由于巴氏杀菌乳加工过程杀菌强度较低,对生乳原料的初始菌落总数应尽可能严格要求,在一定范围内尽可能降低到最低水平,因此今后相关标准中建议明确巴氏杀菌乳所用生乳原料的微生物限值,例如建立独立且必检的菌落总数指标。三是制定以“原料+过程+终产品”全链覆盖的巴氏杀菌乳出厂检验标准[21],为政府有效监管、行业落实主体责任、产品全周期追溯提供必要依据。如开展过程微生物检验(菌落总数),明确巴氏杀菌过程检验放行的要求,建立并保存过程杀菌记录等。同时,乳品企业应建立产品全周期质量安全管控制度和措施[22],并须通过科学评估和严格验证。
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