基于四极杆飞行时间高分辨质谱定量鉴别鸭血制品中掺假猪血

鸭血营养丰富,口感嫩滑,脂肪含量低,蛋白质含量较丰富,鸭血中的血红素铁含量较高,血红素铁更容易被人体吸收利用,在我国有着悠久的消费历史。鸭血掺假或造假事件层出不穷,早在2015年央视315晚会就曝光假鸭血泛滥,记者抽检发现,部分知名餐饮企业通过低价猪血来冒充鸭血牟利。到2024年3月14号央视“社会与法”栏目又曝光了假鸭血事件,记者在多地和网络随机购买的22份鸭血,检测只有8份是纯鸭血,假鸭血的比例接近70%。鸭血仅占鸭子体积的9%,鸭子体型较小,鸭血收集比较困难。相反猪的体积比较大,血液供应量充足,加上猪血营养价值不及鸭血,所以猪血价格比鸭血低廉。一些不法商家会用价格低廉的猪血冒充鸭血,消费者很难从感官上判断出所购买的鸭血是否掺假猪血,这将严重威胁消费者的身体健康,以及影响市场的公平交易[1-2]。

常用实时荧光PCR法鉴定鸭血中是否掺假其他畜禽类血液成分,而市售的部分鸭血经过高温加热后再售卖,核酸分子在加工过程中受到高温(>80 ℃)、酸碱(pH<4或>9)及氧化作用的破坏,可能会影响测试结果的准确性。相对于核酸分子来说,蛋白质加热后空间结构会发生变化,但氨基酸序列不会发生改变。基于质谱的蛋白质组学技术逐渐成为肉制品掺假鉴别的研究热点[3-5],利用串联质谱或高分辨质谱技术可成功鉴定不同肉类中的特征肽段的种属来源,这为鸭血掺假检测提供了重要参考。基于“自下而上”的蛋白组学法需要对蛋白质进行提取、酶解、肽段纯化等多个步骤,鉴定蛋白质种属来源的关键是选择合适的特征肽。通过纳升级液相色谱串联高分辨质谱进行数据依赖性采集,对所有样品中的肽段进行全面鉴定,使用集合运算找出10条潜在的特征肽,并采用生物信息学验证这些肽段的特异性,最终确认2条鹿皮明胶特征肽[6]。该筛选策略中将质谱数据与数学集合论方法结合,可避免使用复杂的统计模型,但是纳升级液相色谱的流速极低(如300 nL/min),大规模样本分析的重复性不好。通常需要较长的色谱梯度(通常为60～120 min)以获得足够的分离效果,难以应用于需要快速分析大量样本的场景。当需要从少量细胞或组织中提取的蛋白样品中筛选生物标志物等,纳升级液相色谱是强有力的工具,这也是该设备在发现蛋白质组学中如此盛行的原因。而对于食品类基质复杂、目标肽段的丰度值较强,需要进行高通量、高重现性的靶向分析,选择更稳定、更快速的微流液相色谱或分析型液相色谱则更实用。该类仪器设备在灵敏度和分辨率方面虽不如纳升级色谱系统,筛选出的肽段和蛋白质数量虽然相对较少,但是该法筛选到的特征肽丰度值较强、在靶向定量中可有效避免部分肽段测不出的难题[7-8]。另一方面,分析型液相色谱仪(特别是超高效液相色谱)是大多数实验室使用的主要设备,易于操作和维护,系统稳定性较强,在高通量靶向筛选与定量中具有突出的优势。基于多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)技术的三重四极杆质谱被认为是蛋白质组学中进行蛋白质靶向定量的“金标准”[9],该技术具有较高的特异性、出色的灵敏度以及较高的重现性,但是,由于三重四极杆质谱分辨率有限,对于复杂的基质可能存在共流出、产生相同质核比的子离子干扰物,导致定量结果偏高(假阳性)。近年来,高分辨率质谱仪已具备足够的灵敏度,还能够获取指定前体离子在指定质核比范围内的完整产物离子谱,从而能够在高精度和高分辨率下同时监测几乎所有可检测的产物离子,可有效确认来自目标肽段所定量的信号,而不是基质中的其他成分,确保定量的准确性,在靶向定量方面成为“新金标准”[10]。

本文基于超高效液相色谱串联四级杆飞行时间高分辨质谱技术定量测定猪血源的特征肽,根据特征肽的测定结果鉴别猪血,以期建立一种高效、灵敏的定量检测鸭血制品中掺假猪血的方法,为鸭血等制品的掺假鉴别提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛胰蛋白酶(Type I,10 000活力单位/mg蛋白)、正己烷(色谱级)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT,≥99.5%),西格玛有限公司;乙腈(质谱级)、甲酸、甲醇等,默克股份有限公司;CaCl2·H2O(≥99%)、硫脲(≥99%)、NH4HCO3、尿素、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris,≥99%)等,生工生物工程(上海)股份有限公司;猪血源肽(EAVLGLWGK、VLQSFSDGLK、VGGQAGAHGAEALER,纯度≥95%),南京杰肽生物科技有限公司;鸭血源肽(FISLLDELQK、LADNLDTLGAAAAK,纯度≥95%),上海强耀生物科技有限公司;C18固相萃取柱(100 mg/3 CC),美国沃特世有限公司;超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm),实验室自备;鸭血和猪血,购于当地屠宰场。

1.2 仪器与设备

H-Class Plus超高效液相色谱仪、Xevo G2 QTOF高分辨质谱仪,沃特世科技有限公司;CV200真空离心浓缩仪,北京吉艾姆科技有限公司;Milli Q超纯水系统,密理博有限公司;ZX4涡旋振荡器,意大利VELP公司;3K15冷冻离心机,西格玛有限公司;JY3002电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理及蛋白提取

准确称取经热加工后的血液样品0.1 g放入离心管中,加入2.5 mL正己烷,超声波处理3 min。立即将样品置于旋涡振荡器上涡旋5 min, 10 000 r/min离心3 min,去除上清液,保留沉淀物。重复上面的方法2次,并在氮气中将血液样品沉淀物干燥近干。加入4 mL混合提取液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0),涡旋5 min,超声波处理3 min,在4 ℃下以15 000 r/min离心4 min,收集样品上清液,弃去沉淀物,将上清液转移到10 mL离心管中并涡旋混匀。在室温下于1 315×g离心提取物3 min,以去除上一步可能产生的泡沫(如样品无泡沫可省去这个步骤),所得溶液为蛋白提取液,采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

取一定量的蛋白提取液稀释10倍,充分涡旋混匀,取200 μL蛋白稀释液于2 mL离心管中,加入150 μL 0.5 mol/L的NH4HCO3溶液,充分涡旋混匀,加入10 μL的DTT溶液(0.5 mol/L),充分混匀后,75 ℃下水浴处理30 min,让样品中的蛋白质充分变性,待提取物冷却到室温。加入IAA溶液(150 mmol/L),使得样品中IAA的最终浓度为15 mmol/L,避光反应30 min。紧接着,加入50 μL胰蛋白酶溶液(30 mmol/L NH4HCO3溶液配制,0.5 mg/mL)和10 μL CaCl2溶液(0.1 mol/L),马上将溶液涡旋混匀,37 ℃下恒温水浴中酶解8 h,水解过程中每间隔1 h将酶解液取出涡旋以防止管壁吸附。酶解后,向样品酶解液中加入20 μL甲酸以终止反应,涡旋混匀,室温下放置15 min,将样品酶解液加水定容至1 mL。

首先用3 mL甲醇活化和洗涤固相萃取柱,然后用3 mL体积分数1%甲酸平衡固相萃取柱。将1 mL酶解液定量转移至固相萃取柱中,用0.5 mL体积分数1%甲酸冲洗离心管,并将冲洗液转移到小柱中。用2 mL体积分数为1%甲酸洗涤小柱。最后,用1 mL体积分数50%乙腈洗脱吸附的肽段,加入洗脱液后,需要在小柱中浸泡10 min,再用1 mL洗脱液重复洗脱1次。将收集的洗脱液用真空浓缩仪干燥,分析前用0.5 mL体积分数3%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)复溶,涡旋混匀30 s,过0.22 μm PVDF滤膜,上机检测。

1.3.4 超高效液相色谱-高分辨质谱分析条件

色谱条件:Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流速0.2 mL/min;柱温40 ℃;进样量5 μL;流动相A(0.1%甲酸水,体积分数)和流动相B(0.1%甲酸乙腈,体积分数)、梯度洗脱程序为:0～1 min 95% A相、1～3 min 95%～90% A相、3～8 min 90%～80% A相、8～18 min 80%～70% A相、18～20 min 70%～10% A相、20～23 min 10% A相、23～23.1 min 10%～95% A相、23.1～25 min 95% A相。

质谱条件:电喷雾电离,正离子模式,准多重反应监测,毛细血管电压3.0 kV,离子源温度130 ℃,脱溶剂气温度250 ℃,锥孔电压60 eV,锥孔气流速60 L/h,脱溶剂气流速800 L/h,扫描时间0.2 s,数据格式为棒状图,一级母离子扫描质核比(m/z)范围为400～1 200,二级碎片离子扫描m/z范围为50～1 200,前1 min和后5 min的流动相进废液不采集信号。质谱数据在采集过程中使用外部锁定液进行对质荷比的实时锁定,外部锁定液由200 pg/μL的亮氨脑啡肽溶液组成、以10 μL/min的流速注入,在正离子模式下产生实时参考离子[M+H]+(m/z 556.2771),以确保准确的质谱分析[11]。

1.3.5 方法学验证

对超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱法测定特征肽的方法学验证,系统分析线性范围、基质效应、加标回收率、精密度、检出限(limit of determination,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)等方法学参数。加标回收率采用在鸭血基质中添加低(50 μg/L)、中(100 μg/L)、高(500 μg/L)3个浓度的混合肽标准溶液,按照上述样品处理后上机测定,按照公式(1)计算回收率。

式中:Ci和C0分别为鸭血基质加标样液和非加标样液中特征肽的测定浓度,μg/L;Vi和V0分别为加标样液及非加标样液的体积,mL;m为特征肽的加标量,μg。

根据信噪比(signal to noise,S/N)的10倍和3倍为依据分别计算特征肽的LOQ和LOD。取适量的特征肽标准溶液,根据质量比添加入按照1.3.1节～1.3.3节处理的蛋白酶解液中,配成一定浓度梯度的混合工作液,旋转30 s,过0.22 μm滤膜上机测定,绘制特征肽的基质标曲,与同浓度水平下的标准曲线进行比较,按照公式(2)计算基质效应(matrix effect,ME):

式中:KM,基质标曲的斜率;KS,溶剂标准曲线的斜率。

1.3.6 方法定量分析能力验证

配制不同比例的猪血与鸭血混合体系,按质量比0%、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%进行系列混合,再按照1.3.1～1.3.3节的方法处理样品制备蛋白酶解液,采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱法定量分析猪血源特征肽和2条鸭血源特征肽FISLLDELQK(P603)、LADNLDTLGAAAAK(P672)的信号强度[11]。以猪血对鸭血的质量比值为横坐标、以猪血源特征肽对鸭血源特征肽的信号强度比值为纵坐标,进行线性拟合比较相关系数。

1.4 数据处理

使用MassLynx V4.2软件(沃特世有限公司)进行仪器控制、数据采集和数据分析,通过Skyline软件(MacCoss实验室,美国华盛顿大学)获得各特征肽的母离子及碎片离子理论质核比。实验结果以至少重复3个平行样的“平均值±标准偏差”表示,用SPSS 19.0进行一维方差分析和曲线线性拟合,差异显著性采用邓肯(Duncan)检验,检验水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 特征肽的筛选

特征肽是“鸟枪法”蛋白组学分析中连接庞大的蛋白质组与可测量的质谱信号的关键“桥梁”,其筛选策略融合了生物信息学的智慧与质谱知识的实践策略,选择能产生高强度、稳定碎片离子的肽段,对于后续的靶向定量至关重要。其筛选标准为:通常选择7～20个氨基酸的肽段,无漏切位点;避免含有C、W和M等易发生化学修饰的氨基酸,优先选择疏水性适中的肽段使其在反相色谱上有合适的保留时间,能与干扰物较好分离;优先选择能带2+或3+电荷的肽段,因为它们在电喷雾电离下信号更稳定;C末端不含G或P,N末端不含Q或E;避免“自剪接”肽段,即在质谱中容易在DP键上断裂的肽段等[12-13]。

特征肽挑选的常规流程是通过纳升级液相色谱-高分辨质谱分离蛋白酶解产物,根据母离子和碎片离子鉴别肽段,将鉴定到的肽段通过BLAST算法对比验证特异性,该法灵敏度高、分离效率好、通量高,但是耗时长、筛选效率极低。本实验采用靶向蛋白定向酶解的新流程(图1)。

猪血是由血浆和血细胞等成分组成,其中白蛋白是血浆中的主要蛋白,红细胞是血浆中的主要成分,血红蛋白是专一性地存在于红细胞内的功能蛋白,其含量约占红细胞干重的95%,因而血红蛋白占据了血液中总蛋白质的75%以上。血红蛋白是由珠蛋白结合血红素构成,由4个亚基组成,每个亚基是具有三级结构的多肽链,并含有1个血红素,血红蛋白α亚基(登录号:P01965)由141个氨基酸组成、β亚基(登录号:P02067)由147个氨基酸组成。分别将2种亚基的FASTA文件导入Skyline软件,利用胰蛋白酶酶解可形成7条和11条肽段,经特异性(BLAST算法)验证有2条和4条潜在特征肽,如表1所示。

特征pep6中含有3个重复性的V、疏水值较大,溶解性不佳,且不易合成,不适合作为特征肽。选择其余5条特征肽按照2.3节的方法处理猪血样品提取蛋白、酶解纯化后定量分析,测定结果如图2所示。这5条特征肽的质谱信号强度大、碎片离子的实测质核比与理论质核比的偏差均在10×10-6范围内,质谱图质量高,结果可靠,可用于鉴别分析。从图2中母离子的质谱图可知,肽段pep2中存在带2+电荷至4+电荷的母离子,且带4+电荷的母离子信号强度更高,这主要是由于肽段较长,潜在的质子化位点增多,正电荷之间的静电排斥力就越强,肽段稳定性降低,不易作为特征肽。肽段pep5的二级质谱图中仍有母离子信号,这表明该肽段裂解所需碰撞能较大,不易作为特征肽。综上,肽段pep1、pep3和pep4可选作鉴别猪血的特征肽。

2.2 方法学考察

由表2数据可知,3条猪血源特征肽在10～1 000 μg/L 的线性非常好,相关系数>0.999,基于高分辨质谱的信噪比计算得出方法的LOD为0.3～0.4 μg/L,LOQ为0.9～1.2 μg/L,3条特征肽的灵敏度可以满足低浓度肽定量测定的要求。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱技术测定猪血源特征肽,可实现对血液制品中蛋白质种属来源的高灵敏检测,其方法学参数满足复杂基质样本的精准定量分析需求。

2.3 方法的准确度评定

超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱技术测定过程中会存在一定程度的基质效应(表3)。3条特征肽的基质效应介于90%～100%,显示出一定程度的抑制效应,但是不显著,对实验结果不会产生显著影响(P>0.05)。

低、中、高3个质量浓度添加下的加标回收率分别为83%～110%、87%～96%、90%～106%,回收率均介于80%～120%,证明该方法具有较高的准确度。系统的应用这种方法可以准确地确定鸭血样品中猪血成分的含量。分别对3条特征肽加标样品进行日内和日间平行测定5次,以相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)评定其精密度,结果见表3,日内和日间的RSD值分别为1.3%～2.4%、1.8%～2.5%,均小于5%,适用于鸭血样品中掺假猪血的定量鉴别与测定。

2.4 掺假区分能力评定

为了比较猪血源的3条特征肽在鉴别产品掺假方面的能力,对不同比例(从0%到100%)的猪血与鸭血的混合样品进行靶向质谱分析,结果如图3。在所有混合样品中均检测到了这3条猪血源特征肽,而空白基质组靶标特征肽的信号强度低,可有效排除假阳性结果。鸭血中混入10%猪血组的信噪比(如图3中a～c)的理论值远大于10,根据此信噪比值可得出pep1、pep3、pep4三条特征肽的理论LOD分别为0.018%、0.012%、0.017%,理论LOQ分别为0.060%、0.041%、0.056%,这表明该法的灵敏度可达到0.1%。考虑到实际应用中掺假量控制在1%以上,而本法在鸭血中混入1%猪血时,3条特征肽的信号强度值均大于105,证明该方法可完全满足实际样品的检测需求。

为了建立鸭血制品中掺假猪血的定量测定方法,不同比例的猪血与鸭血混合处理后,采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱法测定3条猪血源特征肽(pep1、pep3、pep4)和2条鸭血源特征肽(P603、P672)的信号强度,3条猪血源特征肽和2条鸭血源特征肽的比值与猪血/鸭血添加量比值的拟合关系如图4所示。随着猪血添加量比值的增大,3条猪血源特征肽的信号强度呈现出增加的趋势,且3条猪血源特征肽与鸭血源特征肽P672的比值与添加量的比值呈线性关系(相关系数>0.99),而3条猪血源特征肽与P603鸭血源特征肽的比值与添加量的比值呈非线性关系,这主要是由于猪血添加量超过60%后特征肽信号强度的变化趋缓。鸭血中掺假猪血成分的质量比与特征肽信号强度的比值呈正相关(P<0.05),可选用3条猪血源特征肽与鸭血源特征肽P672的比值定量分析鸭血制品中掺假的猪血成分。

为了验证所建立分析方法的适用性,对市场上随机抽取的7种不同的鸭血制品和实验室自制的3个盲样进行检测,结果如表4所示。结果显示,所有样品中均检测到2条鸭血源特征肽,这表明所有样品中均含有鸭血成分,其含量变化较大,可能与样品基质或鸭血含量有关;鸭血制品和盲样中特征肽的含量与猪血或鸭血的质量比相关,如样品S5和盲样3中猪血源特征肽的含量高、其掺假量也较高;市售的7种样品中S1和S5两份样品和3个盲样中均测出猪血源特征肽,这表明2份鸭血制品中掺有猪血成分,与相关研究报道的结果一致[14-15]。

从图5和图6样品中猪血源特征肽的色谱图与质谱图可知,样品中特征肽的出峰时间与标样中的出峰时间一致(偏差值<0.1 min),且样品中测定的各碎片离子的质核比与标准品中的质核比偏差值均不超过10×10-6,这进一步证明了鉴别的准确性。3个盲样中猪血掺假量的实测值与理论值非常接近,偏差<10%,这表明该检测方法准确可靠。由于动物的养殖区域、饲养方法、生长阶段等各种不同因素,对蛋白质的表达有一定的影响,会导致多肽含量的差异。因此,为了更好地鉴别鸭血掺假,还需要更进一步开展相关的研究工作,如增加特异性肽段的检测数量,针对不同区域的物种和不同生长阶段的特征肽段进行大规模的数据统计,借助大模型进行统计分析,尽可能的增加该方法定量鉴别的准确性。

3 结论

本文构建出一种基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱鉴别鸭血制品中掺假猪血的鉴别方法,采用靶向蛋白定量酶解策略确定猪血源肽段VGGQAGAHGAEALER、VLQSFSDGLK和EAVLGLWGK作为靶标定量分析特征肽。3条特征肽标准工作液在10～1 000 μg/L的范围内呈良好的线性关系(相关系数>0.99),特征肽的LOD和LOQ较低,基质效应在90.5%～99.7%,低、中、高3个加标浓度下的加标回收率为83%～110%,方法准确性好、精密度好、灵敏度高。构建猪血和鸭血不同质量比值模型确证,3条猪血源特征肽可定量鉴别鸭血中的掺假猪血,盲样分析进一步表明该检测方法的可靠性。综上所述,该方法可为鸭血制品中的掺假鉴别提供一定的技术参考。

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