中国酒文化源远流长,然而饮酒对人体健康的影响却也不容忽视。酒的主要成分是乙醇,在人体内主要通过乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)进行氧化代谢[1]。在这一代谢过程中,会产生多种有害物质,如具有致癌性的乙醛,以及导致脂质、DNA和蛋白质过氧化的自由基等[2-3]。短期内大量饮酒可能引发恶心、呕吐、记忆力减退、注意力涣散等不适症状,而长期饮酒则可能诱发精神障碍、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等一系列严重疾病[3]。因此,合理使用解酒产品以减轻酒精对身体的伤害,降低饮酒带来的健康风险,显得尤为重要。
当前,全球市场上解酒产品琳琅满目,种类包括天然食品、饮料、发酵制品、中药制品以及微生物制品等[4-8]。这些产品主要通过3种途径发挥作用[9]:一是与酒精结合,降低血液中乙醇的浓度,减缓酒精的吸收;二是增强ADH和ALDH的活性,加速酒精的代谢过程,减少如乙醛等有害代谢产物在体内的积累;三是提升肝脏功能,加快酒精的代谢速度。以Myrkl为例,这款以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌为主要成分的解酒产品,表示能有效分解酒精。在饮酒前1～12 h内服用,这2种细菌能在酒精抵达血液和肝脏之前,将其转化为二氧化碳和水,从而减少乙醛的生成[5]。另一项研究则利用梨(65%)、甜酸橙(25%)和椰子水(10%)开发出一种抗宿醉产品,体外实验显示,该产品能显著提升ADH和ALDH的活性,分别增加23.31%和70.02%[6]。还有研究表明,发酵制品枳椇醋能显著提高小鼠肝脏中ADH的活性,减少还原型谷胱甘肽的消耗,并能显著缓解酒精引起的肝脏脂肪变性和肝细胞肿大等症状,结果表明枳椇醋对小鼠肝脏具有保护作用[10]。尽管解酒产品的研究层出不穷,但在饮酒者中得到实际效果验证的产品却寥寥无几,因此,开发安全且高效的解酒产品显得尤为迫切。
本项研究使用的太岁复合菌种发酵液,源自纯天然药食同源材料,经过太岁菌种液的发酵而成。该发酵液的底物融合了人参、黄精等成分,经发酵后富含多种有益菌,如欧洲醋酸杆菌、红曲霉、代尔夫特菌、芽孢杆菌、甲基杆菌以及单胞菌属等。这些菌共同作用于底物,产生了一系列丰富的代谢产物,包括黄酮、多酚、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)和短链脂肪酸等[11],这些代谢产物在解酒、抗癌、抗衰老以及调节免疫平衡等多个方面展现出有益作用[12]。本文的研究重点专注于湖北省咸宁地区特产的太岁复合菌种发酵液,通过体外和体内解酒实验,深入探究其解酒效能及作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
太岁复合菌种发酵液和太岁复合菌种发酵口服液(太平百岁TM酵本草原浆,食品生产许可证编号SC10642011801443,生产日期2021年12月24日)由湖北九公堂生物科技有限公司提供;食醋(紫林山西陈醋,食品生产许可证编号SC10314012101087,生产日期2022年6月7日),市售;52度舍得白酒(智慧舍得藏品·十年窖藏,食品生产许可证编号SC11551092250025,装瓶日期2020年10月8日),市售;Mrykl解酒药(批号PS4701),主要功效物质为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酵母提取物和L-阿拉伯糖,市售;G0866W48乙醇含量测定试剂盒、G0829W乙醛含量试剂盒、G0806W ADH试剂盒、G0828W ALDH试剂盒,苏州格锐思生物科技有限公司;乙醇(CAS号64-17-5)、乙醛(CAS号75-07-0),上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Q/ANJ001 2015螃蟹先生酒精测试仪,深圳市聚伟发科技有限公司;HP250S型生化培养箱,上海精胜科学仪器有限公司;PB-10型酸度计,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SMAT型SynergyTM Mx酶标仪,美国伯腾仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 体外乙醇和乙醛溶液代谢效果测定
为客观评价太岁复合菌种发酵液体外解酒功效,选择4种制剂进行实验对比,分别是纯净水(作为阴性对照)、Myrkl(一种有文献研究支持的瑞典知名解酒产品,作为阳性对照)、食醋(民间相传具有一定解酒功能的参照物)、太岁复合菌种发酵液和太岁复合菌种发酵口服液(太岁复合菌种发酵液经过高温灭菌制成口服液产品)。参照MIAH等[13]试验方法改良后的进行,具体操作如下:制备待测溶液,包括:1)空白对照组:20 mL无菌纯水;2)食醋:20 mL;3)Myrkl:药片2粒,磨碎,溶于20 mL无菌纯水;4)发酵液:20 mL,将pH值均调至6.0备用;4)发酵口服液:20 mL,将pH值均调至6.0备用。在带盖的50 mL试管中,加入20 mL的100 mmol/L乙醇溶液(pH 5.0)或乙醛溶液(pH 4.6)分别作为乙醇或乙醛代谢实验底物。取以上待测溶液各4 mL,分别加入以上底物溶液中,混匀,置于37 ℃水浴锅中加盖温育。每隔15 min取1 mL反应液,测定乙醇、乙醛含量,计算乙醇、乙醛代谢速率,测定均采用微板法。此外,每隔15 min测定ADH活性,在0、15、60 min时测定ALDH活性,使用ADH和ADLH活性检测试剂盒测定其活性。
1.3.2 人群呼气酒精含量测定
呼气检测人体酒精含量是一种非侵入性、方便快捷的监测个体酒精含量的方法。呼气酒精质量浓度0.1 mg/L以上为酒驾,0.4 mg/L以上为醉驾[5,14]。本研究招募12名20～50岁的健康成年人自愿参加解酒实验,包括6名男性和6名女性。将受试者按照年龄与性别基本对称的原则分配为2组,每组6人。实验分为2轮进行,第一轮将2组人分别设为实验组和对照组,实验组饮发酵口服液,对照组饮纯净水。3 d后进行第二轮实验,将参加实验组与对照组的受试者互换,按照与第一轮同样的步骤进行第二轮实验。2次实验均于午餐时间进行,要求受试者基本空腹。饮酒前10 min,实验组每人一次性饮用发酵液产品25 mL,对照组每人一次性饮用纯净水25 mL。随后,每人在5 min内饮下75 mL酒精度52度的舍得老酒(十年陈酿)。随后,使用便携式呼气酒精测试仪监测受试者呼气酒精浓度变化,每隔5 min记录读数,持续监测150 min。
1.3.3 人群饮酒感官评价调查
在饮酒后24 h内,使用主观体感量表对饮酒愉悦感和不适感进行量化评价[15]。愉悦感评价内容包括微醺感、放松感、幸福感和其他愉悦感,不适感评价内容包括呕吐、眩晕、过敏、头痛、宿醉等。根据愉悦感与不适感的强烈/体验程度,用0～5分的分值进行标定,并进行统计学分析。
1.4 数据分析
用SPSS 27.0分析处理数据,单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)用于比较不同组之间的差异,所有实验数据均为3个平行试验的平均值,用“平均值±标准误”表示,图由GraphPad Prism 9.0.0绘制,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
2 结果与分析
2.1 太岁复合菌种发酵液和口服液体外代谢乙醇和乙醛分析
乙醇在人体内由消化道吸收,主要在肝脏代谢,在生理条件下乙醇首先经ADH代谢为乙醛,胃肠道中可发现ADH存在。但当服用大量乙醇时,胃肠道代谢则显得微不足道,在这期间产生的乙醛和自由基,会对肝脏等多个器官造成损害。乙醇在体内代谢为乙醛后,经ALDH氧化为乙酸,再进入三羧酸循环内生成水和CO2,最终排出体外[1-3]。本研究采用微板法测定不同解酒产品对乙醇和乙醛的体外代谢能力。如图1-a所示,太岁复合菌种发酵液组的乙醇浓度均值从15 min起开始下降,45 min时下降到初始浓度的94.1%(P>0.05),60 min时下降到初始浓度的85.5%(P<0.05),90 min时下降到初始浓度的70.7%(P<0.05),120 min分钟后乙醇浓度下降至初始浓度的50.5%(P<0.05)并持续降低,最终180 min时为初始浓度的40.5%(P<0.05)。太岁复合菌种发酵口服液组的乙醇浓度从干预开始起即可观察到下降,30 min时下降到初始浓度的95.4%(P>0.05),45 min时下降到初始浓度的90.6%(P<0.05),75 min时下降到初始浓度的79.7%(P<0.05),最终180 min时为初始浓度的66.7%(P<0.05)。纯净水组、Myrkl组和食醋组的乙醇浓度则没有明显的下降(P>0.05)。如图1-b所示,太岁发酵液组的乙醛浓度从干预开始起即可观察到下降,45 min时即下降到初始浓度的74.6%(P<0.05),75 min时下降到初始浓度的56.9%(P<0.05),90 min时乙醛浓度已下降至初始浓度的53.5%(P<0.05)以下并持续降低,最终180 min时浓度仅为初始浓度的28.3%(P<0.05)。太岁发酵口服液组的乙醛浓度同样从干预开始起即可观察到下降,30 min时下降到初始浓度的77.6%(P>0.05),60 min时下降到初始浓度的75.3%(P<0.05),75 min时乙醛浓度已下降至初始浓度的69.3%(P<0.05)以下,并持续降低,180 min时为初始浓度的48.3%(P<0.05)。Myrkl组的乙醛浓度则在90 min时才下降到初始浓度的72.6%(P<0.05),最终180 min时浓度为初始浓度的49.4%(P<0.05),较太岁发酵液组180 min时的乙醛浓度高1.8倍。纯净水组和食醋组的乙醛浓度则没有观察到明显下降(P>0.05)。实验结果显示,随着反应时间延长,太岁复合菌种发酵液及口服液均能显著降低体系中的乙醇和乙醛含量,且代谢速率显著优于其他3组。其中,口服液组在前45 min表现出最快的代谢速率。在2 h内,发酵液对乙醇和乙醛的代谢速率分别为空白对照的9倍和7倍,口服液对乙醇和乙醛的代谢速率分别为对照的4倍和7倍。以上实验结果表明,太岁复合菌种发酵液及口服液在体外具有显著提升乙醇和乙醛代谢的能力,其代谢效率显著优于其他对比产品。
a-乙醇浓度;b-乙醛浓度;c-ADH活性;d-ALDH活性
图1 不同产品干预处理对乙醇、乙醛浓度、ADH活性和ALDH活性的影响变化
Fig.1 The impact of various product interventions on the changes in ethanol concentration, acetaldehyde concentration, ADH activity and ALDH activity
注:图1-a～图1-b显著性为组内各时间点浓度与初始浓度比较;图1-c～图1-d显著性为组间酶活性比较;不同小写字母代表差异显著(P<0.05),相同代表差异不显著(P>0.05)(下同)。
同时本研究采用微板法测定了不同解酒产品对ADH和ALDH活性的影响。如图1-c所示,在ADH活性检测中,太岁发酵液组和口服液组在2 h内各个时间点的ADH活性均显著高于其他组(P<0.05),其酶活性峰值分别达空白对照组的10倍和4倍,表现出长达120 min的半衰期。如图1-d所示,在ALDH活性检测中,太岁发酵液组与口服液组在60 min内各时间点的酶活性均显著高于纯净水组及食醋组(P<0.05),其酶活性峰值分别达到空白对照组的170%和160%。与Myrkl组相比,发酵液和口服液的ALDH活性也略有升高,但差异不显著(P>0.05)。太岁发酵液及口服液中均富含高活性ADH与ALDH,且2种酶在体外表现出良好的稳定性。该产品可通过高活性的ADH催化乙醇氧化为乙醛,同时利用ALDH的催化活性驱动乙醛进一步氧化为乙酸,由此构建双酶协同作用的乙醇代谢通路,为其解酒效应提供关键的酶学机制支撑。
2.2 太岁复合菌种发酵口服液解酒效果评价
2.2.1 太岁复合菌种发酵口服液对饮酒者呼气酒精含量的影响
如图2所示,人群试验结果显示,实验组酒精含量全程显著低于对照组。实验组在饮酒后120 min内,呼气酒精质量浓度最高为0.13 mg/L,最低为0.02 mg/L。实验组饮酒后15 min开始观察到呼气酒精浓度下降,为对照组的84.8%,至20 min时酒精质量浓度已经降至0.10 mg/L(酒驾)以下,为对照组的58.8%,之后在0.10 mg/L上下稍有浮动,45 min后稳定降至0.10 mg/L以下,之后持续下降,60 min时为对照组48.1%,115 min后降低至0.02 mg/L左右后不再变化。对照组在饮酒后120 min内呼气酒精质量浓度最高为0.18 mg/L,最低为0.08 mg/L。对照组饮酒后115 min呼气酒精质量浓度才降至0.10 mg/L(酒驾)以下,之后继续下降,直至150 min后仍为0.06 mg/L,为实验组呼气酒精浓度的3倍高。综上,太岁复合菌种发酵口服液可高效代谢人体酒精,为人体健康与人身安全提供保护。
图2 饮用太岁复合菌种发酵口服液人群呼气酒精浓度变化曲线
Fig.2 Changes in exhaled alcohol concentration in individuals consuming Taisui Consortia Fermentate
2.2.2 太岁复合菌种发酵口服液对主观体感的影响
将服用太岁复合菌种发酵口服液的实验组与对照组的愉悦感评分做对比分析,如图3-a所示,从均值来看,饮用复合菌种发酵口服液人群的放松感提升了50.0%,幸福感提升了166.7%,微醺感提升了75.0%,其他愉悦感提升了25.0%。其中,幸福感和微醺感的提升具有显著性。
a-愉悦感;b-不适感
图3 服用太岁复合菌种发酵液对人群饮酒后主观体感评分的影响
Fig.3 Effect of administration of Taisui Consortia Fermentate on post-alcohol consumption subjective physical sensation scores in subjects
将服用太岁复合菌种发酵口服液的实验组与对照组的不适感评分做对比分析,如图3-b所示,从均值来看,饮用复合菌种发酵液人群的头痛感降低63.6%,眩晕感降低46.2%,呕吐感降低80.0%,过敏降低31.3%,脸红降低13.3%,困倦感降低61.1%,其他不适感降低66.7%。其中,头痛感和困倦感的降低具有显著性。
综上,实验组摄入太岁复合菌种发酵口服液后,在提升愉悦感与缓解不适感方面均呈现一定积极趋势,表明该发酵口服液在增强饮酒愉悦体验及减轻不良体感方面具有潜在效用。鉴于主观体感存在显著的个体差异性,且本研究样本量有限,部分观测指标尚未达到统计学显著性水平。后续研究拟扩大样本量,并进一步按年龄、性别进行亚组分层分析,以提高结论的统计学效能及稳健性。
3 结论与讨论
本研究通过体外试验与人群试验系统证实了太岁复合菌种发酵液及口服液的解酒效应,采用微板法对比评估了该产品与传统解酒产品(食醋)及国外解酒制剂(Myrkl)的乙醇、乙醛代谢能力,其中,食醋是中国传统酿制的发酵产品,因具备调节血脂、血糖及保护肝脏免受氧化应激损伤的生物学活性而在民间常被用作解酒产品[10,16],Myrkl作为国外唯一在临床注册的益生菌解酒制剂,则通过枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等菌株在肠道定殖扩增后,分解酒精,以减少血液对酒精的吸收,并维护肠道屏障[5],而太岁复合菌种发酵口服液含8 000余种共生微生物的灭活后生元,远超Myrkl微生态丰富程度,并富含中国药食同源植物来源的多种天然活性产物(类黄酮、多酚、维生素等)及发酵产生的功能性成分(吡咯喹啉醌、γ-氨基丁酸、短链脂肪酸等),是中国微生物与药食同源植物资源多样性开发与应用的重要体现。体外实验结果显示,太岁复合菌种发酵液及口服液对乙醇、乙醛的代谢速率显著优于其他受试产品,其中发酵液与口服液对乙醇的降解效率在2 h监测期内分别为对照组的9倍和4倍,对乙醛的降解效率均为对照组的7倍,而食醋未表现出体外代谢乙醇和乙醛的能力,Myrkl也未展现体外代谢乙醇的活性。酶活性检测进一步证实,上述高效代谢能力源于其含有的高活性且稳定性良好的ADH和ALDH,发酵液及口服液中的ADH活性均显著高于纯净水、食醋和Myrkl(Myrkl的ADH活性与纯净水相近),分别为对照的10倍和4倍;ALDH活性均显著高于纯净水和食醋,与Myrkl相近且略高,是空白对照的170%和160%,表明该产品可通过双酶协同通路直接催化乙醇→乙醛→乙酸的代谢过程[17]。人群试验结果显示,饮用太岁复合菌种发酵口服液的参与者自饮酒后15 min起,呼气酒精浓度即快速下降,同时伴随愉悦感增强与不适感减轻。该效应可能源于服用后产品中的ADH和ALDH被快速输送到胃肠道,在体内高效催化了乙醇氧化和乙醛氧化2步连续反应,从而将有害的乙醇、乙醛氧化为无害的乙酸并进一步分解和利用。综上,本研究首次从酶学机制与应用效果双重层面证实了太岁复合菌种发酵产物的解酒作用,与Myrkl相比,该产品通过直接增强代谢酶活性,从源头减少了酒精及毒性代谢物(乙醛)在体内的蓄积,直接作用效果更优,可起到快速代谢酒精、减轻肝脏负担、改善醉酒症状的作用,为解酒产品的研发与应用提供了重要的理论依据和实践参考。
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