白酒是我国国酒,也是世界六大蒸馏酒之一,在日常生活和国民经济中占有重要地位。其中,清香型白酒作为历史最为悠久的白酒香型之一,清香纯正自然,醇甜柔和协调,余味爽利干净,恰好契合当代消费者的饮用偏好[1]。清香型白酒中含量最多的风味物质是乙酯类化合物, 赋予了酒体愉悦的花香和果香,也决定了清香型白酒独特的风格[2]。
在大曲微生物体系中,酵母菌是一类关键微生物类群,可划分为酿酒酵母与生香酵母两大类别。其中生香酵母作为具备独特代谢特性的微生物群体,在白酒发酵过程中能够生成多样的酯类物质[3]。这类酯类成分不仅为白酒赋予独特香气特征,更能显著提升白酒的口感品质[4]。生香酵母主要归属于汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia),仅少数属于球拟酵母属(Torulopsis)。该类微生物兼具好氧特性与产酯功能,可通过自身酯化酶催化合成以乙酸乙酯为主导的复合香型物质,既能有效丰富酒体风格,又能提升香气物质的种类与含量。
目前研究中用于丰富白酒风味的产香酵母多为异常威克汉姆酵母、毕赤酵母、东方伊萨酵母、扣囊复膜酵母等[5]。然而,少有研究分析费比恩塞柏林德纳氏酵母菌的发酵产香特性,因此本研究从清香大曲中筛选出一株高产酯的费比恩塞柏林德纳氏酵母并分析了其产香特性,从而为提升酒体品质和丰富酒体风味提供新的科学依据和思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
清香型大曲,湖北省、山西省某酒厂;粳高粱、糯高粱,市售。
1.1.2 化学试剂
乙酸正戊酯、三丁酸甘油酯(均为色谱纯,纯度≥98.0%),上海麦克林生化科技有限公司;葡萄糖、NaOH、H2SO4、NaCl(均为分析纯)、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉(均为生化试剂),国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
YPD培养基:参考文献[6]的方法配制。
高产酯酵母菌初筛培养基(g/L):三丁酸甘油酯0.2%(体积分数),NaCl 10,酵母浸出粉5,蛋白胨10,琼脂粉20,121 ℃灭菌20 min。
高粱汁液态发酵培养基:取粳高粱375 g制备成高粱粉、125 g全高粱、2 L纯水混合,水浴加热至90 ℃,按使用说明加入淀粉酶液化1 h,液化结束后降温至55 ℃,按照使用说明加入糖化酶,搅拌均匀糖化2 h后用纱布过滤,滤液以4 000 r/min离心20 min后取上清液,测量糖度并调整至12 °Bé。
1.2 仪器与设备
LRH-250生化培养箱,上海智城分析仪器有限公司;LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;5977B-7890B GC-MS仪,美国安捷伦公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酵母菌的分离纯化与形态学观察
参考文献[7]的方法称量10 g经粉碎过筛处理的清香型大曲,置于已灭菌的0.9%生理盐水(质量分数),摇床振荡培养(30 ℃、180 r/min) 24 h后得到初始浓度为10-1的样品液,用0.9%生理盐水对10-1的样品进行梯度稀释,依次配备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液,选择合适的梯度,将100 μL的样品液涂布在YPD固体培养基上,于30 ℃静置培养48 h。选择生长状况较好、呈现典型酵母菌落形态且产香特性突出的菌株,通过平板划线对其进行纯化。
1.3.2 产酯酵母菌菌株初筛
采用酯化透明圈法对分离纯化后的菌株进行初步筛选:取活化后的酵母单菌落接种至初筛培养基表面,置于30 ℃培养箱恒温静置培养72 h后,在逆光条件下观察。若透明圈直径与菌落直径的比值(D/d)越大,则表明菌株脂肪酶活性越高,可初步判断其产酯能力越突出。
1.3.3 产酯酵母菌菌株分子生物学鉴定
对初筛产酯菌株进行分子生物学鉴定,引物设计采用文献[8]的方法,PCR扩增产物委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序,将最终测序结果提交于美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI) 中,并利用基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)进行同源性比对,之后采用邻接法(neighbor joining,NJ)在MEGA 12.0软件中构建系统发育树。
1.3.4 产酯香酵母菌菌株复筛
将初筛产酯菌株接种于高粱汁液态发酵培养基中,将100 mL/250 mL锥形瓶置于摇床(30 ℃、180 r/min)振荡培养24 h制备一级种子液,同理制备出二级种子液,以10%接种量接种于发酵培养基中,将250 mL/500 mL锥形瓶于摇床(30 ℃、180 r/min)振荡培养24 h后,封膜静置厌氧培养6 d制取发酵液,将发酵液和体积分数为40%乙醇(无酯)溶液以1∶1的体积比混合加入1 000 mL圆底蒸馏瓶中进行蒸馏,收集100 mL馏出液,利用皂化回流法[6]测定总酯含量。
1.3.5 产酯香酵母菌产香特性分析
同1.3.4节制备酵母菌发酵液,参考文献[7]方法利用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)GC-MS法对酵母菌高粱汁发酵液的挥发性产物进行定性定量分析。
样品制备:将100 μL乙酸正戊酯(内标),3 g NaCl,6 mL发酵液加入10 mL顶空瓶中。
顶空固相微萃取:样品于50 ℃、550 r/min 下平衡15 min,萃取吸附45 min。
半定量分析:采用内标法,根据挥发性物质的峰面积与内标物的峰面积及含量进行计算,得出各挥发性物质的含量[9]。
挥发性物质的香气活度值(odor activity value, OAV)按公式(1)计算:
(1)
1.3.6 产酯香酵母菌菌株的生长曲线
按5%的接种比例将酵母菌液接种至 YPD液体培养基中,将20 mL/50 mL锥形瓶置于摇床(30 ℃、180 r/min)振荡培养,以2 h为间隔共12组取样,以空白培养基为对照,在波长600 nm处测定吸光值,测定菌株0～24 h内的生长曲线。
1.3.7 产酯香酵母菌菌株的耐受性分析
将种子液以10%的接种量接种于不同乙醇体积分数(3%、6%、9%、12%、15%、18%)、温度(18、22、26、30、34、38、42 ℃)及pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)的YPD液体培养基中,摇床(30 ℃、180 r/min)振荡培养24 h,在波长600 nm处测定吸光值。
1.3.8 数据处理
使用Excel 2019、SPSS 26.0对数据进行统计分析处理,柱状图与折线图由Origin 2023b绘制而成,挥发性化合物的热图利用Chiplot网站(https://www.chiplot.online/)绘制,利用SIMCA-P 14.1 软件进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)和计算变量重要性投影(variable importance in projection,VIP),在MEGA 12.0软件中制作酵母菌基于26S rRNA基因序列的系统发育树。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的分离纯化与形态学特征
以湖北省、山西省两酒厂清香型大曲为样本,通过在YPD固体培养基上涂布、多次划线纯化后成功得到10株酵母菌,菌株编号分别为A-2、B-6、F-1、F-8、H-2、J-6、K-1、Q-3、S-6、Z-5,具体菌落形态特征以及细胞形态见表1。
表1 10株酵母菌的菌落形态特征及细胞形态
Table 1 Colony characteristics and cell morphology of 10 yeast strains
菌株编号细胞形态图(40×10)菌落形态特征菌株编号细胞形态图(40×10)菌落形态特征Q-3白色、菌落小、圆形、哑光、湿润、扁平、边缘明显H-2白色、菌落大、椭圆形、外表有绒丝、菌落凸起、难以挑起S-6白色、菌落大、椭圆形、干燥、哑光、平滑、边缘明显F-8白色、菌落小、椭圆形、外表有绒丝、菌落凸起、难以挑起J-6白色、菌落小、圆形、湿润、光亮、微微凸起、边缘明显F-1白色、菌落大、圆形、干燥、扁平、有褶皱、有绒丝、呈放射状铺开A-2白色、菌落小、圆形、湿润、光亮、微微凸起、边缘有白圈K-1白色、菌落小、不规则、干燥、菌体、中心有白点、菌体呈线状放射状铺开B-6白色、菌落小、圆形、干燥、哑光、中心有白点向外虚化、边缘明显Z-5白色、菌落大、不规则、干燥、有假丝、扁平无凸起
2.2 产酯香酵母菌透明圈初筛结果
酯类化合物是白酒风味的主要贡献香气化合物,通过比较菌株在三丁酸甘油酯培养基上的透明圈直径与菌落直径的比值,可初步评估该菌株的产酯性能。由表2可看出,菌株F-1、J-6、A-2、B-6可初步认为是产酯能力较强的菌株,其中菌株F-1产酯能力最强,其他酵母菌均具有产酯能力。综上选择F-1、J-6、A-2、B-6这4株菌进行后续实验。
表2 10株酵母菌株产酯能力比较
Table 2 Comparative analysis of ester-producing capabilities of 10 yeast strains
菌株编号酯化圈图产酯能力(D/d)菌株编号酯化圈图产酯能力(D/d)F-13.15K-12.26J-62.84Q-32.19
续表2
菌株编号酯化圈图产酯能力(D/d)菌株编号酯化圈图产酯能力(D/d)A-22.47Z-51.85B-62.33F-81.69H-22.28S-61.03
2.3 产酯香酵母菌菌株分子生物学鉴定
对筛选出的产酯能力强的菌株F-1、J-6、A-2、B-6进行菌种鉴定,4株酵母菌的系统发育树见图1。系统发育树中聚于一枝表明亲缘关系最近[7]。由图1可知,菌株F-1鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、菌株J-6为费比恩塞柏林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)、菌株A-2为费比恩塞柏林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii)、菌株B-6为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
图1 基于26S rRNA基因序列产酯香酵母菌菌株系统发育树
Fig.1 Phylogenetic trees of ester aroma-producing yeasts strains based on 26S rRNA gene
2.4 产酯香酵母菌复筛结果
酯类化合物是白酒中最主要的一类挥发性成分,研究证明,高产酯酵母在酯酶作用下能生成大量酯类物质以去除酒类杂味从而提高酒类质量[10]。因此以总酯含量为依据复筛高产酯非酿酒酵母[11]。
如图2所示,费比恩酵母菌J-6、A-2总酯含量较高,分别达到了3 800.80、3 292.31 mg/L,异常威克汉姆酵母F-1总酯含量为2 575.12 mg/L,酿酒酵母B-6总酯含量最低,为302.86 mg/L。综上选择菌株A-2、J-6进行后续实验。
图2 产酯香酵母菌发酵液的总酯含量
Fig.2 Total ester content in fermentation broth of ester aroma-producing yeasts strains
2.5 产酯香酵母菌的产香特性分析
通过HS-SPME-GC-MS对2株酵母菌高粱汁发酵液中挥发性成分进行半定量分析,与NIST17标准谱库比对,共鉴定出48种挥发性物质,其中酯类物质19种,醇类物质8种,酸类物质7种,醛酮类物质4种,其他类物质10种。2株酵母菌发酵液不同种类挥发性相对含量见图3。
图3 菌株A-2和J-6挥发性成分物质种类及相对含量
Fig.3 Species and relative contents of volatile components in A-2 and J-6
注:A-2-1、A-2-2、A-2-3为菌株A-2的3组平行酒样名称;J-6-1、J-6-2、J-6-3为菌株J-6的3组平行酒样名称。
酯类物质多呈现水果香气,醇类主要为白酒赋予花香与果香,同时使酒体更显醇厚;酸类在白酒中发挥协调功能;醛类则为白酒带来坚果类香气[12]。王震等[2]基于构建清香型白酒风味轮的研究发现,该类型白酒的花香、果香、甜香类型极为丰富,而坚果香、烤香等类别占比相对较低。由图3可知,A-2中酯类相对含量较高,达到了64.22%,种类数量为17种,菌株J-6发酵液中酯类物质相对含量为48.07%,种类数量为10种。总体上2株费比恩酵母挥发性化合物主体为酯类化合物,整体风味呈现为花果香。
如图4所示,菌株A-2和菌株J-6共有的物质有9种,其中酯类物质有乙酸异戊酯、壬酸乙酯、己酸乙酯、丙位壬内酯、棕榈酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸苯乙酯。这也与孙细珍等[13]的研究结果相符,通过重组缺失实验证实辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、异丁醇等物质是小曲清香型白酒的关键香气贡献成分。A-2中乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯含量显著高于J-6,分别为J-6的181.28%、1 169.09%、342.53%和245.38%。其中,乙酸苯乙酯具有甜感,蕴含玫瑰花香与粉香交织的蜂蜜般香气,同时呈现类似苹果的果香气,并带有可可与威士忌风格的香气特征;乙酸异戊酯则能为酒体赋予清甜的香蕉香气[12];辛酸乙酯是清香型白酒中广泛存在的重要香气成分,以果香为主要特征,对清香型白酒水果香气的形成起到关键作用[1]。
图4 菌株A-2和J-6挥发性成分物质含量热图
Fig.4 Heatmap of volatile component content of strains A-2 and J-6
与J-6相比,A-2增加了9种酯类物质,分别是花生酸苄酯、油酸苄酯、辛酸异戊酯、己酸异戊酯、壬基3-烯酸乙酯、4-乙酰氧基丁酸乙酯、反油酸乙酯、2-丙烯酸十二烷基酯和癸酸乙酯,其中癸酸乙酯含量较高为0.25 mg/L。癸酸乙酯多存在于白兰地酒、威士忌、啤酒、葡萄酒等中,带有果香与酒香的复合香气,兼具梨与白兰地般的香气特征,可赋予酒品独特风味[14]。
为研究2株高产酯酵母高粱汁发酵液的挥发性成分,将2株酵母高粱汁发酵液的48种挥发性成分进行比较,构建OPLS-DA模型(图5-a)。图5-a中拟合指数R2X=0.948,R2Y=0.999,Q2=0.999,R2和Q2值超过0.7,模型拟合结果可接受。将48种挥发性成分进行主成分分析(图5-b),A-2发酵液和J-6发酵液两组间分散程度较高,表明2株酵母菌发酵液挥发性成分差异显著,可以进行差异性分析。VIP可衡量 OPLS-DA 模型变量的权重程度, VIP 值越大,挥发性化合物对酒样整体香气的贡献率越大,筛选差异挥发性化合物时一般选取 VIP>1 的成分[15]。A-2和J-6发酵液总酯含量相差不大,但其发酵液的香气成分组成差异较大,故如图5-c所示,根据VIP>1及P≤0.05筛选出5种关键差异化合物,分别是乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、异戊醇和苯乙醇。而A-2中这5种物质含量显著高于J-6,为发酵液提供了浓郁的花香蜜香果香特征。
a-OPLS-DA图;b-主成分分析;c-VIP图
图5 不同发酵液的OPLS-DA图、主成分分析及VIP图
Fig.5 OPLS-DA,principal component analysis score plot, and VIP plot of different fermentation broth
OAV是基于化合物的嗅觉感受阈值建立的一种确定样品关键风味化合物的方法。挥发性成分含量的高低难以直接体现酵母的产香特性,一般根据OAV的大小来衡量香气组分对发酵液整体香气的贡献程度[16]。通常,OAV≥1意味着该香气组分对发酵液香气会产生一定影响;而当OAV≥10时,则表明该香气组分对发酵液整体香气的贡献十分显著[17]。
A-2和J-6发酵液3组平行组中均能检测到的化合物共有17种。如表3所示,在5种VIP≥1的差异化合物中,除苯乙醇外,其余4种差异化合物OAV均大于1,说明两者香气轮廓差异明显。A-2中 OAV≥1的物质共有10种,其中癸酸乙酯OAV为2.20,呈现为白兰地香气和梨香,是威士忌的重要风味成分[11],OAV最大的辛酸乙酯呈现出香蕉和梨子的香气[18],乙酸苯乙酯则赋予发酵液玫瑰香、蜂蜜香[19],这些均为清香型白酒中的关键香气物质[2]。J-6中OAV≥1 的物质共有7种,分别是异戊醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。A-2与J-6相比,增加了苯乙醇、己酸和癸酸乙酯3种关键香气贡献化合物,整体呈现出浓郁的蜜香果香特征。
表3 不同发酵液挥发性成分OAV及香气描述
Table 3 OAV and aroma description of volatile components of different fermentation broth
序号化合物阈值[20-22]/(mg/L)OAVA-2J-6香气描述[23]1异丁醇2.83 0.610.30葡萄酒香、麦芽香2异戊醇0.104 585.9958.01水果香、花香3苯乙醇2.891.490.94清甜的玫瑰花香、蜜香4己酸0.2521.370.79汗臭、动物臭、酸臭水果香5庚酸1.382 10.030.02酸臭、汗臭、窖泥臭、霉臭62-甲基丁酸0.593 10.670.34奶酪、汗7醋酸160.020.01酸味8癸酸乙酯0.112 22.200.00果香、梨香、白兰地香气9乙酸异戊酯0.093138.3311.78香蕉香、甜香10壬酸乙酯0.3150.290.12带果香及玫瑰样香气的酒香11己酸乙酯0.005 5349.7644.25苹果香、菠萝香12庚酸乙酯1.315 30.070.04香蕉香味、草莓香13乙酸乙酯3.255 111.576.38菠萝香、苹果香14棕榈酸乙酯20.060.01蜡香、果香、乳香15辛酸乙酯0.001 287199.2281.19香蕉香、梨子香16乙酸苯乙酯0.090 883.3824.35甜的、玫瑰花香174-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.012 38.015.55香瓜香、水果香、甜香、花香、烟熏味
A-2和J-6虽总酯含量差别不大,均在3 000 mg/L以上,但其发酵液香气组成成分差异较为明显。A-2较J-6而言,香气成分组成更丰富,酯类种类及含量更高,关键香气贡献化合物有10种,其中辛酸乙酯OAV最高,且J-6中未能检测到的癸酸乙酯。综上,选择费比恩塞柏林德纳氏酵母A-2为高产酯的功能酵母菌进行菌种特性研究。
2.6 产酯酵母菌的生长曲线
如图6所示,菌株A-2生长较快,0～8 h为延迟期,8 h后进入对数生长期,14 h后进入稳定期,细胞数量增长不大趋于稳定。
图6 菌株A-2的生长曲线
Fig.6 Growth curve of strain A-2
2.7 产酯酵母菌耐受性分析
在不同的发酵条件下,酵母菌所遭受的胁迫情况存在差异,而乙醇浓度、酸碱度以及发酵温度通常是酿造过程中酵母菌所面临的主要应激因素[8]。将最终筛选产香能力强的菌株A-2在YPD液体培养基中培养后,通过测定其OD600nm,考察菌株对温度、pH、乙醇的耐受性。
在固态白酒发酵过程中,乙醇是促使微生物群落结构发生演变的关键因素之一。然而,当乙醇的体积分数逐渐升高时,酵母菌会产生毒效应,从而抑制酵母的生长与繁殖[24]。由图7-a可知,随着酒精体积分数的增加,菌株A-2生长逐渐受到抑制,在体积分数为6%时菌株生长最好,体积分数为8%时仍可以生长,12%以上菌株几乎无法生长。
a-乙醇耐受性;b-pH耐受性;c-温度耐受性
图7 菌株A-2的耐受性试验结果
Fig.7 Results of tolerance tests of strain A-2
在白酒发酵初期,微生物体系由于生长代谢常常产生乙酸、乳酸等酸类物质使得发酵液pH降低,而pH值又会对酵母菌的生长代谢和酶活性有直接影响,在较低或较高的pH下酵母菌难以生长[25]。用不同pH的YPD培养基摇床培养菌株A-2,通过测定OD600nm考察pH值在2.5～6.5范围内的生长情况。如图7-b所示,菌株A-2随着pH的增加总体呈上升至平稳的趋势,当pH值为5.0～6.0时的耐受性最好。当pH=3.0时菌株的生长耐受性较好,当pH=2.5时菌株几乎不生长,总体而言菌株A-2对酸的耐受性较好。
不同香型白酒发酵方式不同,例如酱香型白酒是中高温大曲[26],微生物就需要对不同大曲有着不同温度的耐受性。由图7-c所示,菌株A-2的最适生长温度在26～30 ℃,在38 ℃高温下能较好生长,42 ℃下几乎不生长,在低温18 ℃下生长状况良好,这可能是因为该菌株分离于中低温大曲。
耐受性实验结果表明,费比恩塞柏林德纳氏酵母菌A-2可耐受38 ℃、pH 3.0、酒精度8%vol的生长环境,其最适生长pH值为6.0,最适生长温度26 ℃。
3 结论与讨论
为了丰富白酒的香气成分和提高白酒的品质,本研究采用传统分离技术从清香型大曲中分离出10株酵母菌,通过酯化透明圈法、总酯含量测定复筛得到菌株J-6和A-2,经鉴定均为费比恩塞柏林德纳氏酵母(Cyberlindnera fabianii),总酯含量分别为3 800.80、3 292.31 mg/L,略低于其他种类的产香酵母。研究表明,产香主要酵母菌种戴尔有孢圆酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母利用高粱汁发酵总酯含量可达 6 307、 4 429 mg/L[10]。目前产香酵母菌的研究主要集中于异常威克汉姆酵母、毕赤酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母等[6],对于费比恩塞柏林德纳氏酵母产香研究极少。本研究对A-2、J-6发酵液采用GC-MS技术,结合挥发性成分含量分析、挥发性成分差异分析及相关性分析,鉴定出48种挥发性成分,A-2与J-6中VIP≥1的关键差异香气化合物共有5种。A-2中OAV≥1 的物质共有10种,分别是异戊醇、苯乙醇、己酸、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚,OAV分别为85.99、1.49、1.37、2.2、138.33、46.76、11.57、199.22、83.38、8.01。A-2与J-6相比,辛酸乙酯OAV最高,达到199.22,且增加了苯乙醇、己酸和癸酸乙酯3种关键香气贡献化合物,A-2中检测出癸酸乙酯和辛酸乙酯含量为0.25、0.26 mg/L,赋予了酒体浓郁的花果香特征。目前清香型白酒产香酵母研究方向主要集中于高产乙酸乙酯[19],对于具有明显花果香的辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯等其他物质相关研究较少。最终选取产香特征明显的高产酯酵母菌A-2进行菌种特性研究,结果表明,菌株A-2可耐受38 ℃、pH 3.0、酒精度8%vol的生长环境。
本研究从清香大曲中分离筛选出一株高产酯酵母菌株A-2作为产香功能菌,为定向改善白酒风味应用提供了一定的理论基础和实践指导。但是关于高产酯功能菌A-2在发酵酒体中关键风味成分的代谢路径及调控机制研究仍存在不足。因此,未来研究中需进一步完善和拓展白酒风味组学的研究方法与技术工具,以推动该领域的深入探索。
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