水果富含各类氨基酸,不同种水果甚至不同产地的同品类水果酿造而成的果酒具有差异化的氨基酸组成,为果酒提供了独特的口感和营养[1]。在食品行业,氨基酸的含量和组成,尤其是人体必需氨基酸的组成是食品营养价值的重要评价标准[2-3]。

细胞固定化发酵技术因其具有细胞密度高、发酵速度快和菌种可以连续使用等优势,在发酵工业上应用越来越广泛,尤其在酿酒工业中普遍使用[4-5]。海藻酸钠是酵母固定化发酵工艺常采用的天然聚合物固定载体,酵母附着其上不会改变生物活性,因此能够避免发酵过程中受到发酵介质的影响,保证发酵工艺的连续开展[6-7]。

目前有很多关于固定化酵母发酵果酒以及果酒氨基酸营养价值的研究工作。章雪玲等[8]使用固定化酵母发酵百香果玫瑰茄复合果酒,发现固定化酵母比游离酵母发酵的果酒感官评分更高,果酒口感更加醇香。孙熙婧等[9]改进了固定化酵母凝珠的制作过程,应用于果酒发酵后发现固定化酵母组的果酒各指标均优于传统发酵组。李春燕等[10]研究发现固定化发酵的刺梨果醋更能保持刺梨的功效成分和香气物质。CHEN等[11]使用不同固定化载体固定酵母发酵甘蔗原醋,发现植物源固定化载体可有效提升果醋的香气品质及产酸效率。甘巧等[12]利用高分辨质谱检测了6款柑橘果酒氨基酸含量,发现不同品牌柑橘果酒氨基酸含量组成存在显著差异。ZHANG等[13]采用氨基酸比值系数法、线性回归法、聚类分析法和主成分分析法评价自酿米麦曲黄酒、中国黄酒和日本清酒的氨基酸营养价值,结果发现4种方法均得到相似结果,自酿的米麦曲黄酒氨基酸营养价值最高。秦红艳等[14]发现将水果加工成果酒和果酱后,氨基酸种类没有变化,但是深加工后的产品中氨基酸的配比更加科学。TSUJI等[15]评估了日本米酒(清酒)自由基吸收能力和抗氧化成分,发现清酒中游离氨基酸对清酒自由基吸收能力的贡献相当重要,揭示了清酒中贡献抗氧化能力的主要成分是游离氨基酸。GARCA-GARCA等[16]采用二维凝胶蛋白质组学分析,固定化酵母细胞与游离酵母细胞中的蛋白质表达变化进行了表征,发现固定化酵母表达的蛋白质在DNA修复、细胞调控、氨基酸转化过程中发挥关键作用,而游离酵母表达的蛋白质主要参与糖酵解途径。

已有的很多研究工作展示出了固定化酵母较传统游离酵母发酵的优势。而果酒的氨基酸营养价值的评价工作基本都是基于游离酵母发酵方式开展,相较于传统游离酵母发酵方式,经酵母固定化发酵,尤其是连续多代固定化发酵后果酒氨基酸营养价值的变化还鲜见系统研究报道。

课题组前期研究了4种不同水果发酵成果酒后氨基酸营养价值的变化,同样发现了发酵后果酒中各类氨基酸的配比更趋合理[17]。为进一步探究固定化酵母连续发酵对氨基酸营养价值的影响,本研究对3种常见水果(百香果、蜜桃、杨梅)进行了连续3代的固定化发酵,对比分析果酒的氨基酸营养价值。以期为果酒的工业化大生产提供多元发酵方式下的营养价值理论参考,尤其是固定化发酵技术用于果酒发酵的营养价值层面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百香果、蜜桃、杨梅,市售;果酒专用酵母、酵母膏,安琪酵母股份有限公司;牛肉浸膏(生化试剂)、葡萄糖、CH3COONa(无水)、柠檬酸、CH3COOH、NaCl、HCl、NaOH、NaHCO3、海藻酸钠、CaCl2(无水)、苯酚、柠檬酸钠、茚三酮(色谱级),国药集团化学试剂有限公司,以上化学试剂均为分析纯。18种氨基酸混合标液,美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

BJ6100D电子天平,瑞士Precisa公司;S-443D全自动氨基酸分析仪,德国赛卡姆公司;CN-CA微滤膜,广东环凯微生物科技有限公司;CTYZ-300螺旋压榨脱水机,潍坊川泰机械有限公司;GS8000A-50L/SZT发酵罐,上海广世生物工程设备有限公司;BX-1手持糖度计,日本京都电子工业株式会社;JB-43磁力搅拌器,上海仪电科学仪器股份有限公司;LHS-24B蒸汽压力灭菌锅、pHSJ-6L型pH计,上海力辰仪器科技有限公司;TD4-WS离心机,盐城市凯特实验仪器有限公司;1 mL注射器,江西三鑫医疗科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固定化酵母的制备及相关指标测定

酵母培养基制备:300 mL蒸馏水中加入1%(质量分数,下同)酵母膏、2%牛肉浸膏和2%葡萄糖,在121 ℃高压灭菌锅中灭菌处理30 min。

酵母活化:取4.00 g酵母接入培养基中,在30 ℃下培养60 h,得到酵母母液。

固定化酵母微球制备参考CADIZ等[18]的方法并加以修改。先将海藻酸钠在121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min,然后称取4.995 0 g海藻酸钠粉末溶于蒸馏水中,置于65 ℃的恒温水浴锅中,搅拌至海藻酸钠完全溶解,冷却,待加入112.5 mL活化后的酵母母液后定容至250 mL,配制成20 g/L海藻酸钠-酵母均一溶液。同时称取20.011 3 g CaCl2粉末溶于1 000 mL蒸馏水,也配制20 g/L CaCl2溶液。

海藻酸钙微球制备:将酵母-海藻酸钠混合液转入1 mL注射器,注射器下方放置盛有1 L CaCl2溶液的烧杯。开启磁力搅拌使CaCl2溶液形成浅涡流,控制液滴从离开烧杯10 cm高度滴入溶液中。注射完成,搅拌30 min后用漏勺收集微球,并用蒸馏水洗涤,备用。

使用游标卡尺测量微球直径为1.71～1.83 mm。挑选6个均匀微球,置于水平玻片上,取50 g重的砝码持续施压60 s,测量微球加压前后的直径,以加压后与前的直径比来表示机械强度[19]。测得6个微球的机械轻度范围为1.031～1.037,平均机械强度为1.034。

采用血球计数法测定海藻酸钠微球的酵母负载量。取5颗固定化微球加入5 mL的5%柠檬酸钠溶液解离,振荡10～15 min至凝胶完全溶解。解离后的菌悬液经梯度稀释,采用血球计数板计数,按公式(1)计算得到单颗海藻酸钠固定化酵母微球的酵母菌负载量水平在2.23×107。

负载量/(酵母菌数量/颗)

(1)

1.3.2 果酒加工

果酒加工工艺流程参照文献[17]的方法,主要区别在于多次固定化酵母接入的发酵过程。向发酵液接种酵母时,接入固定化酵母微球,作为对照样,同时平行接入相同数量级活化后的游离酵母母液0.15%。

固定化酵母多代发酵操作要点:一次固定化酵母发酵结束后倒出发酵果酒液,收集酵母微球用无菌蒸馏水洗涤3次,然后补充新的果汁发酵液,进行下一代发酵,如此重复数代发酵。

1.3.3 氨基酸含量测定

参照GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中氨基酸检测方法[20]。氨基酸含量采用三重复测试设计,隔天检测每批次测试样品以避免时间相关性误差。最终数据经Grubbs检验排除异常值后,取算术平均值作为果酒样品氨基酸含量表征值(n=3),标准差范围0.05～0.28 mg/100 mL。

1.3.4 数学模糊识别分析[21]

建立数学模型,设U为待评价样品,即U={u1,u2,u3,u4,u5,u6,u7,u8,u9}, u1、u4和u7分别为游离酵母发酵百香果果酒、蜜桃果酒和杨梅果酒,u2和u3分别为第1、3代固定化酵母发酵百香果果酒,u5和u6分别为第1、3代固定化酵母发酵蜜桃果酒,u8和u9分别为第1、3代固定化酵母发酵杨梅果酒。假设任一样品ui对应模型P(ui)=(uik),i分别表示9种果酒,i=1～9;k表示样品ui中的7种必需氨基酸,k=1～7。ak为标准模型的第k种必需氨基酸含量(%),即P(a)=P(ak),k=1～7,则有联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界卫生组织(World Health Organization,WHO)模型P1=(3.5,6,4,5,7,4,5.5)[22],全鸡蛋蛋白模型P2=(5.7,9.3,4.7,6.6,8.6,5.4,7)[23],a1～a7分别是7种必需氨基酸的含量。

由兰氏距离公式[24]计算样品ui和2种标准必须氨基酸模型贴近度U(a,u),见公式(2):

(2)

式中:c,适当选择的常数,取0.09以使计算结果处于区间[0,1],增加分辨度,利于结果比较。

1.3.5 氨基酸比值系数分析[25-26]

根据FAO/WHO必需氨基酸模式,计算必需氨基酸比值(ratio of essential amino acid, RAA)、比值系数(ratio coefficient, RC)和比值系数分(score of ratio coefficient, SRC),如公式(3)～公式(5)所示:

(3)

(4)

SRC=100-100×CV

(5)

当某种氨基酸的RC>1表示其相对过剩,RC<1表示其相对不足,RC最小的氨基酸为第一限制性氨基酸。若样本必需氨基酸组成比例与标准模式中必需氨基酸完全一致,则变异系数(coefficient of variation,CV)=0,SRC=100;CV越大,SRC分值越小,营养价值也越小。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式下果酒氨基酸含量分析

由表1可知,游离发酵和固定化酵母发酵不同代数得到的3种果酒样品均含有16种游离氨基酸,包含7种必需氨基酸(essential amino acid, EAA)和9种非必需氨基酸(nonessential amino acid, NEAA),EAA包括Thr、Thr、Met、Ile、Leu、Phe、Lys。不同类型果酒所含的游离氨基酸种类均没有变化,但是各氨基酸含量出现了较为明显的差异。百香果3种果酒的总氨基酸(total essential amino acids, TAA)平均含量为102.57 mg/100 mL,明显高于蜜桃果酒和杨梅果酒的总氨基酸平均含量(43.23 mg/100 mL 和44.73 mg/100 mL)。这与不同品种水果果汁中氨基酸含量差异有关[17]。

对比游离酵母和第1、3代固定化酵母发酵果酒的氨基酸含量,可以看出,固定化酵母第1代和第3代发酵的百香果果酒氨基酸含量在100.91 mg/100 mL和101.23 mg/100 mL,均略低于游离酵母发酵的果酒氨基酸含量105.58 mg/100 mL,降低幅度为4.4%和4.1%。另外2种果酒也均出现了同样情况。蜜桃果酒第1代和第3代固定化发酵较游离酵母发酵的氨基酸含量降幅分别为5.6%和5.4%。而杨梅果酒第1代和第3代固定化发酵较游离酵母发酵的氨基酸含量降幅分别为3.8%和3.7%。固定化酵母通过局部高密度菌群分布提升发酵效率,其封闭式载体结构使氨基酸平均利用率较游离酵母有一定提升,使得固定化发酵的总体氨基酸低于游离发酵。同时比较3种果酒的固定化发酵第1代和第3代发酵果酒,发现总氨基酸含量的差异非常小,可见固定化酵母连续发酵果酒的氨基酸营养价值展示出一定的稳定性,这也对之前关于固定化多代发酵稳定性做了营养价值方面的补充[27]。

酿酒酵母菌利用发酵液中糖及其他营养成分增殖代谢,在发酵过程中酵母会选择性利用发酵液的氨基酸进行代谢活动,选择性消耗一部分原有的氨基酸,代谢产生部分新的氨基酸,从而改变原来发酵液中的氨基酸含量和组分[28]。几种果酒在酵母固定化发酵后,总氨基酸含量均出现了略微下降现象,这可能和酵母被载体固定化后局部高浓度菌群的功能活性增强有关。酵母固定化发酵的机理就是利用酵母活细胞比游离细胞高得多的密集度,高浓度的酵母细胞相比游离态酵母活性功能可成倍增长,加速反应,提高发酵效率。在投料期(图1-a),固定化酵母发酵时,发酵液中还不存在游离的酵母。在发酵初期(图1-b),固定化酵母发酵时,发酵液中仅存很少数的酵母,载体表面率先接触培养液,固定在载体较外层的酵母细胞优先开始增殖。由于海藻酸钠载体具有一定的渗透性,发酵液能够渗透到内部,一定时间后(图1-c),深层次的酵母细胞开始增殖,活细胞不断向外传递,形成酵母活细胞的生成器,源源不断提供高浓度的“发酵催化点”。正因为固定化发酵方式存在数个高浓度的“催化发酵点”,所以能够将发酵底物利用更彻底,发酵效率也更高。而游离酵母在发酵液中浓度均匀存在,缺乏高浓度的发酵点位,因此发酵效率低于固定化酵母。同时,由于固定化载体保护的存在,新增殖的固定化酵母细胞所处环境较游离细胞简单,不受发酵底液各种物质的干扰,其后续的代谢生长更为旺盛,细胞密度也更高,使固定化酵母发酵比游离酵母发酵转化氨基酸更为高效[6,16,29]。尤其一些影响果酒关键品质成分的发酵产率没有固定化酵母高,这与许多文献所报道的结果一致[19,30]。

由表1可知,第1代和第3代固定酵母发酵的百香果果酒必需氨基酸在总氨基酸中的占比(EAA/TAA)接近且最高。根据FAO/WHO蛋白质模型,理想的EAA/TAA在40%左右,而EAA/NEAA在60%以上[31],所有果酒样品的必需氨基酸组成均达不到理想模型水平。但是对比发现,游离酵母发酵后的几种果酒EAA/TAA和EAA/NEAA数值均要略低于固定化酵母的第1代和第3代发酵果酒。从不同发酵果酒的氨基酸绝对总量下降幅度看出,固定化酵母对氨基酸的利用和代谢要略强于游离酵母,同时得到果酒中必须氨基酸在总氨基酸中的相对占比却略有提升,表明固定化酵母发酵得到的果酒氨基酸组成蛋白质模型要更接近理想蛋白质的要求,也就是整体的氨基酸组成更加有利于人体利用。这与GARCA-GARCA等[16]的研究结果一致。

2.2 氨基酸营养价值对比评价

2.2.1 数学模糊识别分析

由公式(2)计算得游离和第1、3代固定化酵母发酵的3种果酒必需氨基酸组成相对FAO/WHO模型和全鸡蛋蛋白模型的贴近度U1和U2,如表2所示。贴近度反映出样品必需氨基酸组成与标准模型的接近程度,U越接近1,表示接近程度越高。

从表2可以看出,以FAO/WHO模型为基准,游离和第1、3代固定化酵母发酵3种果酒必需氨基酸贴近度U1为0.920～0.957。而以全鸡蛋蛋白模型为基准,贴近度U2为0.831～0.868。其中最高的为第1代和第3代固定化酵母发酵得到的百香果果酒的必需氨基酸贴近度,均为0.957(FAO/WHO模型)和0.868(全鸡蛋蛋白模型)。

仔细对比各果酒必需氨基酸贴近度,第1代和第3代固定化酵母发酵后3种果酒相较各自游离酵母发酵果酒必需氨基酸贴近度均有略微提升,即u1<u2和u1<u3(百香果果酒)、u4<u5和u4<u6(蜜桃果酒),u7<u8和u7<u9(杨梅果酒)。说明经过固定化酵母发酵的果酒中必需氨基酸组成比游离酵母发酵果酒更接近2种标准模型,其原因可能为在高密度的固定化酵母作用下,发酵液中氨基酸的利用和转化会更加高效。酵母固定化后,由于载体中心源源不断提供高浓度的“发酵催化点”,在发酵过程中始终保持高浓度酵母输出,还发生了部分因为游离酵母浓度低而不能发生或者缓慢发生的氨基酸转化反应,得到比原先游离酵母发酵更贴近标准模型的必需氨基酸组合。第1、3代固定化酵母发酵果酒中的氨基酸组成更加平衡,这也印证了上述结果。

2.2.2 氨基酸比值系数分析

如表3所示,游离和第1、3代固定化酵母发酵的3种果酒SRC为80.319～82.326,其中第1、3代固定化酵母发酵的百香果果酒SRC最高(分别为82.326和82.267)。对比还发现,3种果酒第1、3代固定化酵母发酵果酒SRC均略高于游离酵母发酵果酒,即经固定化酵母的增殖利用后,果酒的必需氨基酸SRC有一定提升。固定化酵母技术优化了酵母细胞的代谢环境,载体内新增殖产生的酵母细胞不受外界发酵液中各成分浓度变化的干扰,对氨基酸组成的转化更为彻底高效,提升了果酒氨基酸营养价值,在提升氨基酸营养品质方面展现出一定优势。

根据FAO/WHO氨基酸模型[32],经游离酵母和第1、3代固定化酵母发酵的3种果酒限制性氨基酸没有变化。百香果果酒第一限制氨基酸均为Met。蜜桃果酒第一限制性氨基酸为Leu,而杨梅果酒第一限制性氨基酸为Ile。固定化酵母高效的发酵能力对发酵液整体的氨基酸深度利用有限,并不能改变果酒的第一限制性氨基酸。对比同种果酒的SRC数据发现,BG1较BY提升约0.37%,BG3较BY提升约0.3%;MG1较MY提升约0.42%,MG3较MY提升约1.1%;YG1较YY提升约0.17%,YG3较YY提升约0.34%。果酒的SRC均有增长,但是增长幅度均在1.1%以内。酵母固定化后发酵得到的果酒SRC较游离酵母提升幅度较小。固定化发酵后果酒氨基酸SRC的小幅度提升是发酵过程中氨基酸组成优化的结果,反映了果酒营养价值、风味品质和功能活性上的改善,这一现象与发酵工艺、微生物代谢等多因素相关[8,15],其内在机制仍有待深入研究。未来通过精准调控发酵过程和精心设计氨基酸添加策略,有望进一步提高果酒的氨基酸比值,开发出兼具良好营养和风味特征的新型功能性果酒产品[3]。虽然固定化发酵对于果酒整体的SRC提升幅度较小,但有一定实际意义。在不改变发酵原液的前提下,将游离酵母替换成更加经济的固定化发酵酵母便能够使得果酒的氨基酸营养价值有所提升,同时可能对果酒的综合风味协调性或功能活性有正向促进作用,这对工业化生产有一定实际指导意义。

3 结论

本研究通过对比分析第1代和第3代固定化酵母发酵与游离酵母发酵的3种果酒氨基酸组成,采用数学模糊识别与氨基酸比值系数2种方法评价果酒氨基酸营养特征与品质。结果表明,经第1、3代固定化酵母发酵后氨基酸总量与游离酵母发酵相比下降明显。固定化酵母通过局部高密度菌群分布提升发酵效率,其封闭式载体结构使氨基酸平均利用率较游离酵母有一定提升。固定化酵母发酵的果酒必需氨基酸组成相对更接近2种标准模型(FAO/WHO模式和全鸡蛋蛋白模式),且必需氨基酸SRC也均略有提升。第1、3代固定化发酵后的百香果果酒在3种果酒中必需氨基酸组成与标准模型更接近,贴近度分别为0.957(FAO/WHO模式)和0.868(全蛋白模式),且必需氨基酸SRC最高,分别为82.326和82.267。固定化酵母发酵较游离酵母发酵在氨基酸营养价值方面有所提升。本研究为固定化酵母发酵果酒工艺提供了营养价值方面的理论依据,表明固定化酵母技术能够优化微生物代谢环境来提升果酒氨基酸营养品质,也为功能性果酒开发提供理论支撑。

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Nutritional characteristics and quality comparative evaluation of amino acids in fruit wines fermented with immobilized yeast

SHEN Bing1,2*, LU Yanyan1,2, HAN Jialin1,2, ZHONG Xuan1,2, CHEN Jiangfeng3

1(Guangxi Vocational and Technical College, Agricultural Engineering College, Nanning 530226, China)

2(Guangxi Zhuang Autonomous Region Engineering Research Center for Healthy Tea Beverages, Nanning 530226, China)

3(State Key Laboratory of Non-Food Biomass Energy Technology, Nanning 530226, China)

ABSTRACT To evaluate the impact of immobilized yeast fermentation on the amino acid nutritional quality of fruit wines, this study analyzed the amino acid composition of three types of fruit wines (passion fruit, honey peach, and waxberry) produced using free yeast as well as first- and third-generation immobilized yeast.The nutritional value was assessed using fuzzy recognition and the amino acid ratio coefficient method.The results indicated that all wines contained 16 amino acids.The total amino acid content in wines fermented with immobilized yeast was generally lower than that in wines produced with free yeast, which can be attributed to the highly efficient fermentation mechanism of immobilized yeast within localized high-concentration environments. Compared to the amino acid profiles recommended by the Food and Agriculture Organization (FAO)/World Health Organization (WHO) and the whole-egg protein standard, the essential amino acid similarity degree of immobilized yeast-fermented wines slightly exceeded that of free yeast-fermented wines.Further comparison with the FAO/WHO essential amino acid pattern showed minor improvements (all below 1.1%) in the essential amino acid ratio coefficient scores (SRC) for immobilized fermentation. Among these, the first-generation immobilized passion fruit wine exhibited the highest SRC value (82.326).The essential amino acid composition of wines fermented with immobilized yeast aligned more closely with both reference patterns.These findings suggest that immobilized yeast fermentation can enhance the amino acid nutritional quality of fruit wines compared to free yeast fermentation.

Key words immobilized fermentation;fruit wine;amino acids;nutritional value;comparative evaluation

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044069

引用格式：沈冰,卢燕燕,韩佳临,等.固定化酵母发酵果酒的氨基酸营养特征与品质对比评价[J].食品与发酵工业,2026,52(9):60-67.SHEN Bing, LU Yanyan, HAN Jialin, et al.Nutritional characteristics and quality comparative evaluation of amino acids in fruit wines fermented with immobilized yeast[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(9):60-67.

第一作者：硕士,副教授(通信作者,E-mail:shenbing0139@163.com)

基金项目：2024年非粮生物质能技术全国重点实验室开放基金(SKL-NFBET-2025-26);广西职业技术学院2024年度自然科学类科研课题(桂职院[2024] 143号)

收稿日期：2025-07-29,改回日期：2025-09-28