亚麻籽粕是亚麻籽在冷压榨油后所产生的一种副产物,也称亚麻饼,其含有多种必须氨基酸和丰富的营养物质,如α-亚麻酸、ω-3脂肪酸、钙、磷、镁、铁、膳食纤维、黄酮、木酚素等物质,是一种高脂肪、低蛋白的优质植物蛋白饲料[1-2],有研究表明,亚麻籽粕中蛋白质含量为32%～49%,所含的必需氨基酸成分与人体相近[3]。亚麻籽粕中的蛋白质主要是α-亚麻酸所产生的α-亚麻油酸和α-亚麻油酰基蛋白。我国亚麻籽的主要用途为榨油,产生的亚麻籽粕大多用来作为饲料[4-6]、肥料或者丢弃,XU等[7]研究表明亚麻籽粕可以替代豆粕作为新蛋白质饲料成分,但发酵亚麻籽粕在畜禽上的应用极为有限,其营养价值尚未得到准确评估。陶薪燕等[2]也有结果表明,亚麻籽粕可作为反刍动物优质的蛋白源饲料,但其精准使用量和对畜产品质量的影响及其作用机理有待进一步研究。可以看出其利用情况并不理想,造成了大量资源浪费[8]。国内外针对亚麻籽粕及其功能性成分产品的研发还很缺乏,其功能性因子的提取技术及功能研究还不够深入,对于亚麻籽粕的研究和开发任重道远。因此,进一步开展亚麻籽粕的加工利用研究,高值化利用亚麻籽粕资源,最大限度地发挥其经济效益,促进亚麻籽粕产业持久、健康地发展,是目前亟待解决的一项重要课题。
酱油是一种起源于中国的发酵调味液,它是通过有益菌对蛋白质和淀粉原料进行酶解发酵制成,经过浸漂、调配等工序后,具有独特的色泽、香气、味道和口感[9],其营养价值十分丰富[10]。传统酱油一般以黄豆或者豆粕作为蛋白原料进行发酵,而我国大豆资源主要依赖进口。在2021年,我国大豆进口量高达1.003 3亿t,并且大豆价格不断上涨[11],导致以黄豆为主要原料生产的酱油成本持续增加。因此,以蛋白质与氨基酸含量丰富的亚麻籽粕替代黄豆生产酱油,在降低酱油生产成本的同时减少亚麻籽粕资源的浪费,具有重大的研究意义。目前常用的工艺生产方法主要有低盐固态发酵和高盐稀态发酵,低盐固态发酵过程操作简单,周期短,成本较低,出品率高,但其高温发酵会加速美拉德反应及谷氨酸焦化作用,生成浓烈色素,有产酯产香差[12]和原料利用不足[13]的缺点,而高盐稀态发酵可以使原料充分分解[14],发酵原油具有更好的风味[15]和更高的营养价值,酱油品质更加优良。
目前酱油发酵工艺的优化主要包括添加菌种、添加其他外源物质、改良发酵方式、运用不同底物等几种方式。其他外源添加物包括酵母抽提物、酸性蛋白酶、荞麦蛋白水解物、鱼类提取物、大曲等。发酵酱油所用到的底物除了传统的大豆、面粉、炒小麦外,还有豆芽、发芽小麦、牡丹籽粕。添加的菌种包括曲霉[16]、乳酸菌、酵母。近年来就有学者致力于在酱油发酵中增加新的底物,或者对于底物进行优化的研究,降低传统原料的用量,为酱油发酵工业提供新思路。SU等[17]发现,利用脱脂大豆和大豆酿造而成的酱油风味各具特色,运用全脂大豆发酵的酱油具有明显的酸味、果味和熟土豆风味,脱脂大豆酱油则是烟熏和麦芽风味较为明显,且脱脂大豆酱油中的中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性较高。SHI等[18]利用发芽小麦作为原料制备酱油,与运用炒小麦、生小麦酿造酱油的样品相比,氨基酸、总氮、还原糖等含量均较高,抗氧化能力强,有利于延长酱油产品的货架期,其中产生的酱油风味的前体物质乙酸乙酯的量也较多,有助于形成酱油良好的风味,且可降低产生污染物的风险。
针对亚麻籽粕利用不足和酱油原料单一的问题,本研究以不同比例的亚麻籽粕和炒小麦为原料,采用高盐稀态发酵工艺制备亚麻籽粕酱油,通过对成曲酶活、酱醪发酵理化特性和成品指标进行检测,对比传统大豆粕酱油参数以确定最佳发酵工艺。本研究探讨了亚麻籽粕用于酱油生产的可行性,为提高亚麻籽粕的加工利用途径和扩宽酱油原料来源具有极大的现实意义。
1 材料和方法
1.1 材料
亚麻籽粕(脱毒),粗蛋白含量为38.57%(干基),河北凯阔食品集团股份有限公司;炒小麦,河北省保定市涿州市高尔夫大道永鑫炒麦加工;豆粕,粗蛋白含量为46.21%(干基),本地商贸市场;米曲霉3.042,保存于本实验室。
1.2 试剂
酪氨酸(生物试剂)、氨基酸标品(色谱级)、干酪素(生物试剂),索莱宝科技有限公司;福林酚(生物试剂),上海吉至生化科技有限公司;K2SO4、CuSO4、浓硫酸、硼酸、溴甲酚绿-甲基红指示剂、硼砂、羧甲基纤维素钠、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、无水碳酸钠、乳酸钠、乙酸钠、无水葡萄糖、乳酸、DNS试剂、冰乙酸、三氯乙酸,均为分析纯,天津市化学试剂供销公司;2,4-二硝基氟苯和N,N-二甲基甲酰胺,上海麦克林生化科技股份有限公司;
1.3 主要仪器与设备
BSC-150恒温恒湿箱,上海博讯实业有限公司;SX-500立式压力蒸汽灭菌锅,日本TOMY公司;HC-3018高速离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;HWS24电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;UV-5100紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;SH220F石墨消解仪、K9840凯氏定氮仪,济南海能仪器有限公司;LC-20AD高效液相色谱仪,日本岛津公司;FiveEasy Plus pH计,梅特勒-托雷多公司。
1.4 实验方法
1.4.1 成曲制备
将亚麻籽粕在90 ℃热水中(亚麻籽粕∶水=1∶1.7,g∶mL)浸泡30 min后与炒小麦按不同比例(5∶5、6∶4和7∶3,g∶g)混合均匀[19],制成原料(亚麻籽粕+炒小麦)总质量200 g大曲,用曲布将其包裹,高温高压灭菌20 min。灭菌完成后,将包有原料的曲布放置在相应的曲盒中。等待其中心温度下降至30 ℃,接种原料质量3‰的米曲霉并搅拌均匀,将曲料堆积后盖上曲布,在30 ℃培养箱中进行培养[20]。分别在培养15、24 h时进行2次翻曲,把黏连在曲布上的物料团与曲布分离开,打散平铺,继续培养至48 h发酵结束。
制备豆粕酱油曲作为对照组时,原料中的亚麻籽粕用豆粕代替,其余步骤相同,并额外设置复合发酵组亚麻籽粕∶豆粕∶炒小麦=3∶3∶4(g∶g∶g)。
1.4.2 成曲中性蛋白酶、酸性蛋白酶、糖化酶和纤维素酶活力测定
跟踪检测大曲发酵24、36、42、48 h四个节点的酶活力。精确称取充分研细的成曲5.0 g,定容至100 mL,置于40 ℃水浴锅中保温1 h,将样品用4层纱布过滤,稀释后得到酶液稀释液。
1.4.2.1 中性蛋白酶活力测定
根据SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》中要求,对酱油大曲的中性蛋白酶(pH 7.2)和酸性蛋白酶(pH 3.0)进行测定。吸取1 mL酶液在40 ℃水浴2 min。随后,向其中加入1 mL同样经过40 ℃水浴预热的酪蛋白,保温10 min后,迅速向混合液中加入2 mL三氯乙酸,继续水浴保温20 min。离心后吸取1 mL上清液以及不同浓度的酪氨酸,加入5 mL碳酸钠溶液和1 mL稀释后的福林试剂,并在40 ℃下进行水浴,保温发色20 min后测吸光度。根据酪氨酸标准曲线计算蛋白酶活力。酶活力定义:在40 ℃下,每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸为1个单位。
1.4.2.2 糖化酶活力测定
吸取0.05 mL粗酶液,加入0.5 mL 10 g/L可溶性淀粉溶液和0.45 mL 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.8)后混匀,在40 ℃下水浴保温20 min后,吸取0.5 mL反应液以及不同浓度的葡萄糖标准液至预先装有1.5 mL DNS试剂的试管中,沸水浴15 min后,冷却至室温,加入10.5 mL蒸馏水后混匀。在波长为550 nm条件下测定吸光度。酶活力定义:40 ℃,pH 4.8下,1 min释放1 μmol葡萄糖的酶量定义为1个单位。
1.4.2.3 纤维素酶活力测定
吸取1 mL粗酶液,并加入1 mL 10 g/L的羧甲基纤维素缓冲溶液后混匀,在40 ℃下水浴保温20 min后,在反应液与不同浓度的葡萄糖溶液中分别加入2 mL DNS试剂,沸水浴5 min后,冷却至室温,加入6 mL蒸馏水后混匀。在波长为540 nm条件下,对该溶液进行光密度(optical density,OD)测定。酶活力定义:40 ℃,pH 4.8下,1 h水解羧甲基纤维素生成1 mg葡萄糖的酶量为1个单位。
1.4.3 酱醪发酵
选用高盐稀态发酵法进行酱油发酵。大曲发酵完成后,按照1∶2.5(g∶mL)的比例将大曲与盐水(浓度为18 g/100 mL)混合,进行酱醪发酵过程。选用30 ℃作为恒定的发酵温度,并持续发酵90 d。
1.4.4 酱醪理化指标测定
对酱醪发酵阶段0、7、15、30、60、90 d的样品进行理化检测。取各阶段酱醪样品5 g充分研磨定容到50 mL,离心取上清液用于后续指标的测定。
1.4.4.1 总酸的测定
根据GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中自动电位滴定法进行测定。
1.4.4.2 氨基酸态氮的测定
根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》进行测定。
1.4.4.3 还原糖的测定
酱醪还原糖参照宋茜[21]采用DNS法进行测定。
1.4.4.4 全氮的测定
酱醪全氮含量采用自动凯式定氮仪进行测定,步骤如下:将适当稀释后的酱油样品(10 mL)注入消化管,然后加入0.2 g CuSO4和3.0 g K2SO4,最后加入10 mL浓硫酸,放入石墨消解仪中进行消化处理160 min后得到清澈透明的消化液。待消化液降至室温后,立即采用自动凯式定氮装置进行蒸馏操作,随后用0.1 mol/L盐酸标准溶液进行滴定,直至溶液颜色转为紫红色为止,记录消耗盐酸的体积。空白以蒸馏水代替酱油样品。全氮含量的测定如公式(1)所示:
(1)
式中:V1,所测样品消耗HCl标准溶液的体积,mL;V2,空白消耗HCl标准溶液的体积,mL;C,HCl标准滴定溶液浓度,mol/L;0.014,滴定相当的氮的质量,g;m,所测样品质量,g;V3,稀释液取用的体积,mL;V4,定容体积,mL;x,样品中全氮含量,g/100 g。
1.4.4.5 pH值的测定
直接使用pH计进行测定。
1.4.5 酱油成品指标的测定
酱醪发酵结束后,将酱醪样品置于离心杯进行高速离心(12 000 r/min,30 min),随后用4层纱布过滤获得酱油头油用于成品指标测定。
1.4.5.1 可溶性无盐固形物含量的测定
根据GB/T 18186—2000《酿造酱油》中的方法进行测定。
1.4.5.2 盐度的测定
采用硝酸银滴定法[22]进行测定。吸取稀释10倍的酱油2 mL,置于250 mL三角瓶中,加入30 mL蒸馏水和铬酸钾指示剂10滴,随后用0.1 mol/L硝酸银溶液进行滴定,终点为砖红色,以蒸馏水做空白对照。
1.4.5.3 游离氨基酸的测定
酱油成品中游离氨基酸通过2,4-二硝基氟苯衍生[23]后经高效液相色谱测定,选择C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)进行分离,流动相A为50 mmol/L乙酸钠缓冲溶液,含1%(体积分数)N,N-二甲基甲酰胺,pH 6.8;流动相B为50%乙腈水溶液。流速1.2 mL/min,柱温27 ℃,检测波长UV360 nm。
通过保留时间进行定性,峰面积外标法进行定量。氨基酸的回归方程如表1所示。
表1 氨基酸回归方程
Table 1 Regression equation of amino acids
氨基酸保留时间/min回归方程相关系数天冬氨酸5.132f(x)=135 741x+2 798.52R2=0.999 5谷氨酸6.517f(x)=112 078x+882.227R2=0.999 9丝氨酸11.313f(x)=144 361x+14 844.9R2=0.999 1精氨酸14.495f(x)=306 991x-31 274.1R2=0.998 8甘氨酸14.98f(x)=181 928x-24 496.7R2=0.999 1苏氨酸16.545f(x)=106 915x+586.499R2=0.999 2脯氨酸17.239f(x)=189 327x+2 497.80R2=0.999 8丙氨酸19.855f(x)=1 545.98x-76.254 7R2=0.998 6缬氨酸23.986f(x)=112 627x+3 335.48R2=0.996 6蛋氨酸26.174f(x)=130 824x-1 891.65R2=0.999 7异亮氨酸27.793f(x)=98 277.7x-1 079.17R2=0.999 4亮氨酸28.509f(x)=133 689x-2 237.65R2=0.998 8色氨酸30.106f(x)=50 121.7x-1 669.40R2=0.998 4组氨酸32.03f(x)=125 332x+11 077.2R2=0.999 8赖氨酸35.505f(x)=188 264x+17 130.6R2=0.999 4酪氨酸35.788f(x)=2 890.56x+13.332 5R2=0.998 8
1.4.6 数据处理与统计分析
所有实验均独立重复3份进行。通过Excel 2019和Origin 2018进行数据处理和图形制作,使用SPSS通过Duncan检验确定样本之间的差异,P<0.05被认为是具有统计学上的显著差异。热图由TBtools v1.098696绘制。
2 结果与分析
2.1 亚麻籽粕与炒小麦配比对酶活力的影响
不同原料配比方式对制曲蛋白酶活力变化的影响如图1所示,5组大曲的中性蛋白酶均呈现先升后降的趋势(图1-a)。发酵初期(24 h)对照组(豆粕∶炒小麦=6∶4)的中性蛋白酶活力最高,为954.41 U/g,显著高于同一时期的4组。豆粕作为酱油发酵的优质氮源,其必需氨基酸比例均衡,加快蛋白酶系丰富的米曲霉生长代谢,产生的内肽酶和外肽酶可对原料蛋白持续转化,从而形成含量更高的可溶性蛋白及肽和氨基酸[24]。随着发酵的进行,中性蛋白酶活力持续升高,到42 h达到最大值。其中,亚麻籽粕∶炒小麦(7∶3)组42 h蛋白酶活力与豆粕炒小麦组无显著差异,分别为1 489.55 U/g和1 494.72 U/g,与其较高的亚麻籽粕占比有关。
a-中性蛋白酶活力;b-酸性蛋白酶活力
图1 不同原料组合中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力
Fig.1 Neutral protease and acid protease activity of different raw material combinations
注:同一时间点,不同分组小写字母表示差异显著(P<0.05)(图2同)。
成曲酸性蛋白酶活力变化与中性蛋白酶类似,随发酵的进行也呈现先升后降趋势(图1-b)。发酵42 h对照组(豆粕∶炒小麦=6∶4)的酸性蛋白酶活力最高,为754.41 U/g,其次为豆粕∶亚麻籽粕∶炒小麦(3∶3∶4)组,为705.09 U/g。各组酸性蛋白酶活力相对中性蛋白酶显著降低,这与米曲霉自身携带更多的金属蛋白酶基因数有关[24],为水解蛋白原料提供了丰富的中性蛋白酶,对酱油氨基酸态氮和全氮的提升具有重要作用。酱油发酵是由中性到偏酸性变化的过程。因此,成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶的高低决定了酿造过程中蛋白质的利用率,进而决定最终产品的风味、色泽和口感[25]。
由图2可知,糖化酶活力和纤维素酶活力也呈现着先升后降的趋势,发酵42 h后,亚麻籽粕∶炒小麦(5∶5)组的糖化酶活力和纤维素酶活力达到最高,分别为1 211.77 U/g和873.12 U/g。炒小麦含量的增加为米曲霉提供了充足的碳源。糖化酶能够分解酱油大曲原料中的淀粉质,形成葡萄糖、果糖等,为参与酱醪发酵的酵母和乳酸菌补充碳源,也可直接参与体系中美拉德和焦糖化反应,最终影响酱油的香气和颜色[26]。纤维素酶能够水解原料细胞壁的糖苷键形成较小的碳水化合物单元(葡萄糖等),有利于原料内容物的溶出,增加其他酶类与底物的接触[27]。除炒小麦底物本身含量影响外,适宜的C/N比对增强米曲霉代谢产酶能力更为重要[28]。本研究中,亚麻籽粕∶炒小麦(7∶3)组的糖化酶和纤维素酶活力峰值均高于6∶4组,说明7∶3条件下制曲效果更佳。而豆粕∶亚麻籽粕∶炒小麦(3∶3∶4)复合发酵组仅纤维素酶活力较高,其余糖化酶和蛋白酶活力均不及亚麻籽粕∶炒小麦(7∶3)组。综上所述,原料配比7∶3时制曲效果最佳。
a-糖化酶活力;b-纤维素酶活力
图2 不同原料组合糖化酶和纤维素酶活力
Fig.2 Glucoamylase and cellulase activity of different raw material combinations
2.2 亚麻籽粕与炒小麦配比对酱醪理化的影响
2.2.1 酱醪pH和总酸含量变化
在酱醪发酵过程中,通过多种微生物的协同代谢作用,原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质被不断地分解,最终转化形成氨基酸以及乳酸、乙酸等酸类化合物,导致酱醪发酵体系中的pH处于动态变化。如图3-a所示,随着发酵时间的延长,5组酱醪初期的pH均迅速下降,随后下降速度减缓,最终趋于平稳。发酵终端pH显示,亚麻籽粕∶炒小麦(6∶4)组最低(pH为5.56),亚麻籽粕∶炒小麦(7∶3)组最高(为5.83)。其余酱醪终端pH值范围为5.68～5.77,呈现偏酸性的环境。酱醪总酸含量与pH变化相反,如图3-b所示,5组酱醪发酵初期的总酸含量迅速上升,随后增速放缓,趋于平稳。这是由于发酵初期微生物分泌的各种酶类仍保持较高活性,促使原料中大分子物质持续降解,使酸类化合物增加。并且酱醪发酵初期是耐盐产酸微生物(如嗜盐四联球菌)的活跃时期[29],进一步加速总酸含量的提升。发酵后期高浓度的盐水对酶活性和微生物代谢过程的持续抑制,使得增速减缓,最终趋于平稳。亚麻籽粕∶炒小麦(6∶4)组总酸含量最高,为1.34 g/100 mL,与其拥有最低的pH值相对应。豆粕∶亚麻籽粕∶炒小麦(3∶3∶4)复合发酵组总酸含量最低,为1.20 g/100 mL。总酸作为反应酱油品质的重要指标,具有调节风味、防止腐败的作用,但酱油总酸含量过高也会导致酱油发酸而降低品质。5组酱醪终端的总酸均未超过2.5 g/100 mL,说明亚麻籽粕作为氮源不会对酱油的酸度产生影响。
a-pH值变化;b-总酸含量变化
图3 不同原料组合酱醪的pH和总酸含量变化
Fig.3 Changes in pH and total acid content of moromi with different raw material combinations
2.2.2 酱醪氨基酸态氮和全氮含量变化
氨基酸态氮是指酱油中以氨基酸形态存在的氮元素总量,是衡量酱油质量等级的直接标准。如图4-a所示,酱醪氨基酸态氮含量随发酵时间的延长呈现持续增长的趋势,其中,发酵初期(0～15 d)增长迅速,与体系中酶活力充沛有关。进入发酵后期,盐水的持续抑制使体系内酶活性降低,并且酱醪中微生物的代谢作用消耗了氨基酸态氮,使得增速减缓。发酵结束后,不同亚麻籽粕与炒小麦原料配比(5∶5、6∶4、7∶3)酱油的氨基酸态氮含量分别为0.67、0.70、0.78 g/100 mL,其中6∶4和7∶3组均达到国家对一级酱油规定的氨基酸态氮含量标准(>0.7 g/100 mL)。亚麻籽粕含量增加为微生物提供充足的氮源基础,使得酱醪终端的氨基酸态氮含量显著上升,与大曲蛋白酶活力相对应。对照组(豆粕炒小麦6∶4)终端氨基酸态氮含量为0.84 g/100 mL,复合发酵组(豆粕、亚麻籽粕、炒小麦3∶3∶4)终端氨基酸态氮为0.75 g/100 mL。亚麻籽粕酱油氨基酸态氮含量均低于豆粕发酵组,与原料本身的粗蛋白含量和蛋白组成密切相关[30-31]。酱醪全氮含量(图4-b)与氨基酸态氮含量变化趋势一致,豆粕炒小麦对照组终端全氮含量最高,为1.52 g/100 mL。其次为亚麻籽粕炒小麦7∶3组,为1.46 g/100 mL。全氮是酱油中可溶性含氮化合物的总称,包括原料溶出的蛋白质、发酵过程蛋白酶解产生的游离氨基酸、多肽氮、微生物自溶释放的核酸类水解物等,是衡量原料利用率与酱油发酵品质的重要指标之一。综上所述,亚麻籽粕与炒小麦在7∶3配比下生产的酱油具有更高的氨基酸态氮和全氮含量,酱油达到国家规定的一级标准,说明亚麻籽粕作为酱油发酵补充氮源切实可行。
a-氨基酸态氮含量变化;b-全氮含量变化
图4 不同原料组合酱醪的氨基酸态氮和全氮含量变化
Fig.4 Changes in amino acid nitrogen and total nitrogen of moromi with different raw material combinations
2.2.3 酱醪还原糖含量变化
在酱醪发酵过程中,还原糖主要来源于成熟曲料与盐水混合时释放出的大量水溶性糖,同时另一部分还原糖是由微生物分泌的糖化酶和纤维素酶等将淀粉质原料分解成的小分子糖组成[32]。如图5所示,酱醪发酵前期还原糖含量迅速上升,并且酱醪还原糖峰值随着炒小麦原料的增加而升高,特别是亚麻籽粕与炒小麦5∶5组,还原糖峰值达到2.68 g/100 mL,与其较高的糖化酶相对应。进入发酵中后期,随着耐盐微生物,尤其是酵母的生长繁殖,以及它们参与的酱醪颜色和风味形成的关键化学反应增多,还原糖的消耗速度加快,从而导致酱醪内还原糖含量逐渐减少。发酵终端各组酱油(亚麻籽粕炒小麦5∶5、6∶4、7∶3、豆粕炒小麦组、复合组)还原糖含量分别为0.86、0.64、0.68、0.53、0.58 g/100 mL。
图5 不同原料组合酱醪的还原糖含量变化
Fig.5 Changes in reducing sugar content of moromi with different raw material combinations
2.3 亚麻籽粕与炒小麦配比对酱油成品指标的影响
2.3.1 可溶性无盐固形物
可溶性无盐固形物是指酱油中除水、食盐、不溶性物质外的其他物质,主要是蛋白质、氨基酸、肽、糖类、有机酸等物质,是影响风味的重要指标。如图6所示,不同原料配比(5∶5、6∶4、7∶3)成品酱油可溶性无盐固形物含量逐渐上升,分别为27.69、28.76、29.35 g/100 mL。豆粕炒小麦组成品酱油的可溶性无盐固形物含量最高,为29.74 g/100 mL,复合组(豆粕、亚麻籽粕和炒小麦3∶3∶4组)含量为28.38 g/100 mL。可溶性无盐固形物含量反应发酵过程中对蛋白质和碳水化合物等生物大分子的转化和利用程度。因此,不同配比的亚麻籽粕和炒小麦酱油中,7∶3配比下利用程度较好,与豆粕炒小麦组(对照组)无显著性差异。
图6 酱油的可溶性无盐固形物
Fig.6 Soluble without salt solid content of soy sauce
注:不同小写字母表示各原料配比间显著差异(P<0.05)(图7、图8同)。
2.3.2 盐度
食盐在酱油发酵过程中能够抑制腐败微生物、筛选优势产香菌群和调节产品的咸鲜味[33],是影响品质的一项重要指标。如图7所示,不同原料配比(5∶5、6∶4、7∶3)成品酱油盐度逐渐降低,分别为17.43、17.10、16.98 g/100 mL,与无盐固形物含量相反。豆粕炒小麦组成品酱油的盐度最低,为16.84 g/100 mL,复合组(豆粕、亚麻籽粕和炒小麦3∶3∶4组)含量最高,为17.76 g/100 mL。5组酱油的盐度无显著差异,但较初始盐水浓度均降低,主要因盐水与原料(豆粕、亚麻籽粕和炒小麦)的渗透平衡作用有关[34]。
图7 酱油的盐度
Fig.7 Salt content of soy sauce
2.3.3 游离氨基酸
在酱油发酵过程中,原料中的蛋白质受到微生物分泌的蛋白酶作用,水解形成肽,随后,通过肽酶进一步分解形成多种游离氨基酸。图8-a为5组酱油的游离氨基酸含量,不同原料配比(5∶5、6∶4、7∶3)成品酱油游离氨基酸含量逐渐上升,分别为6.19、6.48、7.54 g/100 mL。亚麻籽粕原料的增加为微生物提供更多的氮源,提高了蛋白水解形成氨基酸的上限,并且7∶3条件下的大曲具有更高的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力,在后续酱醪发酵阶段充分水解原料中蛋白质以提升游离氨基酸总量提供基础。研究发现,米曲霉的分泌型胞外酶中,天冬氨酸蛋白酶(对应酸性蛋白酶)和金属蛋白酶(对应中性蛋白酶)对原料蛋白的水解以及游离氨基酸的释放具有重要意义,是提高酱油氨基酸含量的重要贡献者[24]。豆粕炒小麦组成品酱油的游离氨基酸含量最高,为8.52 g/100 mL,与豆粕本身粗蛋白含量占比高有关。复合组(豆粕、亚麻籽粕和炒小麦3∶3∶4组)含量为7.54 g/100 mL。此外,酱油中游离氨基酸的种类对滋味的贡献度不同。如图8-b所示,5组酱油成品游离氨基酸主要以苦味氨基酸为主,占总量的61%～65%,鲜味(17%～19%)和甜味氨基酸(16%～20%)占比接近。由图8-b可知,亚麻籽粕和炒小麦7∶3条件下鲜味氨基酸占比最高,为19%,复合组(豆粕、亚麻籽粕和炒小麦3∶3∶4组)的甜味氨基酸占比最高,为20%。酱油的鲜味主要来源于谷氨酸和天冬氨酸,而具有弱疏水性的氨基酸,如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸则呈现甜味[35]。具有强疏水性侧链的亮氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸和色氨酸等主要呈现出苦味。
a-游离氨基酸含量;b-不同呈味氨基酸占比
图8 酱油的游离氨基酸含量和不同呈味氨基酸占比
Fig.8 Free amino acid content of soy sauce and percentage of different flavor presenting amino acids
进一步分析各种氨基酸的含量,图9为16种游离氨基酸热图聚类分析,蓝色到红色代表含量由低到高。由图9可知,亚麻籽粕炒小麦7∶3组相对5∶5和6∶4组的2种鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸含量显著升高,达到0.92、0.48 g/100 mL,与豆粕炒小麦组较为接近(0.95、0.53 g/100 mL)。鲜味作为酱油的关键味觉特点,常被描述为具有肉味、肉汤味,同时也能够增强咸味感知。亚麻籽粕炒小麦7∶3组的甜味氨基酸甘氨酸和脯氨酸含量也显著提升,达到0.27、0.32 g/100 mL,高于豆粕炒小麦发酵组。然而,亚麻籽粕炒小麦7∶3组的部分苦味氨基酸如缬氨酸和苯丙氨酸含量增加。缬氨酸作为支链氨基酸,其代谢与微生物的氮源利用密切相关。研究发现,具有更高蛋白酶活力的酱油样品缬氨酸含量升高[36],亚麻籽粕炒小麦7∶3组大曲较高的蛋白酶活性促进缬氨酸的生成。苯丙氨酸与发酵过程中米曲霉的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)的催化代谢有关[37]。苯丙氨酸作为芳香族氨基酸,也可进一步转化为苯乙醛、苯乙醇及苯乙酸等挥发性化合物,影响酱油风味呈现[38]。相对于豆粕炒小麦组,利用亚麻籽粕作为氮源进行发酵后能显著降低酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等苦味氨基酸含量。大豆蛋白的疏水核心在酶解时易释放疏水性肽段(苦味主要来源),而亚麻籽粕蛋白原料中疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸)含量相对大豆蛋白低,且氨基酸组成更为均衡[39]。因此,选择亚麻籽粕和炒小麦7∶3配比发酵酱油,能保持酱油鲜味氨基酸含量,并且降低产品酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等苦味氨基酸形成,提升酱油品质。
图9 酱油游离氨基酸聚类分析
Fig.9 Cluster analysis of free amino acids in soy sauce
3 结论与讨论
本研究通过高盐稀态工艺制备了亚麻籽粕酱油,测定了其成曲时的4种酶活性以及酱醪理化特性和成品指标,并与大豆粕酱油进行了比较。结果表明,成曲时不同配比亚麻籽粕酱油(5∶5、6∶4和7∶3)成曲中性蛋白酶活性分别为1 137.31、1 275.36、1 489.55 U/g,酸性蛋白酶活性分别为507.99、574.36、687.64 U/g,糖化酶活性分别为1 211.77、1 002.89、1 091.69 U/g,纤维素酶活性分别为873.12、785.48、824.42 U/g,原料配比7∶3的亚麻籽粕酱油的酶活力最接近大豆粕酱油。亚麻籽粕酱油在配比为7∶3时发酵品质最好,发酵90 d后全氮和氨基酸态氮含量分别为1.46、0.78 g/100 mL,达到一级酱油标准,且酸度适宜,表明以亚麻籽粕代替豆粕作为主要蛋白原料制备酱油在技术上可行。原料配比7∶3的亚麻籽粕酱油的可溶性无盐固形物、盐度与大豆粕酱油无显著差异,且亚麻籽粕酱油具有更高占比的鲜味氨基酸,酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等苦味氨基酸相对大豆粕酱油显著降低。本研究为亚麻籽粕的高效利用以及亚麻籽粕酱油的开发提供了初步的数据支撑以及科学依据。未来将基于风味感官组学与多元统计分析,解析亚麻籽粕原料调控酱油挥发性化合物形成的规律及其感官特性响应机制。
[1] 郝京京, 史海涛, 谢拉准, 等.亚麻籽与亚麻籽饼粕的营养价值及其在畜禽饲粮中的应用[J].动物营养学报, 2020, 32(9):4059-4069.HAO J J, SHI H T, XIE L Z, et al.Nutritional value of flaxseed and flaxseed meal and their application in livestock and poultry diets[J].Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(9):4059-4069.
[2] 陶薪燕, 张元庆, 程景, 等.亚麻籽饼(粕)的营养价值及其在反刍动物生产中的应用研究进展[J].中国畜牧杂志, 2022, 58(6):111-116.TAO X Y, ZHANG Y Q, CHENG J, et al.Nutritional value of flaxseed cake (meal) and its application in ruminant production[J].Chinese Journal of Animal Science, 2022, 58(6):111-116.
[3] NDOU S P, KIARIE E, WALSH M C, et al.Nutritive value of flaxseed meal fed to growing pigs[J].Animal Feed Science and Technology, 2018, 238:123-129.
[4] CHEN W, JIANG Y Y, WANG J P, et al.Effects of dietary flaxseed meal on production performance, egg quality, and hatchability of Huoyan geese and fatty acids profile in egg yolk and thigh meat from their offspring[J].Livestock Science, 2014, 164:102-108.
[5] NYENDE P W, WOYENGO T A.Research note:Nutritive value of cold-pressed flaxseed meal for broiler chicken[J].Poultry Science, 2024, 103(4):103535.
[6] 吕蕾, 曹凤.亚麻籽粕综合利用的初步研究[J].农产品加工, 2022(8):87-91.LYU L, CAO F.Preliminary study on comprehensive utilization of flaxseed meal[J].Agricultural Products Processing, 2022(8):87-91.
[7] XU L, WEI Z X, GUO B Z, et al.Flaxseed meal and its application in animal husbandry:A review[J].Agriculture, 2022, 12(12):2027.
[8] 王晓彤, 杨波, 杨光, 等.热处理对亚麻籽粕关键品质及营养组分的影响[J].食品与生物技术学报, 2023, 42(7):95-103.WANG X T, YANG B, YANG G, et al.Effects of heat treatment on key quality and nutritional components of flaxseed meal[J].Journal of Food and Biotechnology, 2023, 42(7):95-103.
[9] DEVANTHI P V P, GKATZIONIS K.Soy sauce fermentation:Microorganisms, aroma formation, and process modification[J].Food Research International, 2019, 120:364-374.
[10] GAO X L, ZHAO X, HU F, et al.The latest advances on soy sauce research in the past decade:Emphasis on the advances in China[J].Food Research International, 2023, 173(Pt 2):113407.
[11] 杨辉, 林嘉柏, 林佳.外生冲击下中国大豆产业安全:现状、挑战与机遇[J].大豆科学, 2022, 41(3):352-357.YANG H, LIN J B, LIN J.Analysis of China’s soybean industry safety under exogenous impact:Current situation, challenges and opportunities[J].Soybean Science, 2022, 41(3):352-357.
[12] FENG Y Z, CHEN Z Y, LIU N, et al.Changes in fatty acid composition and lipid profile during koji fermentation and their relationships with soy sauce flavour[J].Food Chemistry, 2014, 158:438-444.
[13] 胡锋. 酱油酿造工艺技术研究[J].食品安全导刊, 2020(24):136;138.HU F.Research on soy sauce brewing technology[J].China Food Safety Magazine, 2020(24):136;138.
[14] HOANG N X, FERNG S, TING C H, et al.Effect of initial 5 days fermentation under low salt condition on the quality of soy sauce[J].LWT, 2018, 92:234-241.
[15] 朱莉, 许长华.酱油关键风味物质及其功能与发酵工艺研究进展[J].食品与发酵工业, 2018, 44(6):287-292.ZHU L, XU C H.Research advances on the key flavor substance of soy sauce and its functions and fermentation technology[J].Food and Fermentation Industries, 2018, 44(6):287-292.
[16] GAO X L, LIU E M, YIN Y Y, et al.Enhancing activities of salt-tolerant proteases secreted by Aspergillus oryzae using atmospheric and room-temperature plasma mutagenesis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(9):2757-2764.
[17] SU P, TIAN Y F, SU G W, et al.Differences in taste and material basis of soybean and defatted soybean fermented soy sauces and influence factors[J].Journal of Food Composition and Analysis, 2024, 136:106768.
[18] SHI H Q, LI J J, ZHANG Y J, et al.Effect of wheat germination on nutritional properties and the flavor of soy sauce[J].Food Bioscience, 2022, 48:101738.
[19] GAO X L, ZHAO H F, FENG Y Z, et al.A comparative study on physicochemical properties of Chinese type soy sauces prepared using pure koji and mixed kojis[J].African Journal of Biotechnology, 2010, 9(40):6740-6747.
[20] XU G F, HAN Z, WANG S R, et al.Soy sauce residue in total mixed ration silage:Fermentation characteristics, chemical compositions, in vitro digestibility and gas production[J].Italian Journal of Animal Science, 2022, 21(1):1058-1066.
[21] 宋茜. 耐盐产酯酵母的选育及用于酱油酿造的初步研究[D]:天津:天津科技大学, 2013.SONG Q.Breeding of salt-tolerant ester-producing yeast and primary studies on using it in soy sauce fermentation[D].Tianjin:Tianjin University of Science and Technology, 2013.
[22] 张振斌. 新型减盐酱油及固态发酵工艺的开发与研究[D]:天津:天津科技大学, 2021.ZHANG Z B.Development and research of new salt-reducing soy sauce and solid-state fermentation process[D].Tianjin:Tianjin University of Science and Technology, 2021.
[23] 唐涛. 氨基酸柱前衍生化HPLC方法发展及应用[D]:南京:南京理工大学, 2006.TANG T.Development and application of HPLC method for amino acid pre column derivatization[D].Nanjing:Nanjing University of Science and Technology, 2006.
[24] 吴日帮, 陈晨, 方博文, 等.米曲霉蛋白酶基因与酶学特性研究进展[J].中国酿造, 2024, 434:8-13.WU R B, CHEN C, FANG B W, et al.Research progress on genes and enzymatic characteristics of proteases from Aspergillus oryzae[J].China Brewing, 2024, 43(4):8-13.
[25] 王宪斌, 冯霞, 刘义, 等.多菌种制曲在酱油发酵中的研究进展[J].食品与发酵科技, 2016, 52(3):60-64.WANG X B, FENG X, LIU Y, et al.Research progress of multi-strains koji in soy sauce fermentation[J].Food and Fermentation Technology, 2016, 52(3):60-64.
[26] ITO K, MATSUYAMA A.Koji molds for Japanese soy sauce brewing:Characteristics and key enzymes[J].Journal of Fungi, 2021, 7(8):658.
[27] LIN W M, SONG J J, HU W F, et al.Relationship between extracellular cellulase, pectinase and xylanase activity of isolated Aspergillus oryzae strains grown on koji and the umami-tasting amino acid content of soy sauce[J].Food Biotechnology, 2016, 30(4):278-291.
[28] 赵燚涛, 梁璋成, 任香芸, 等.红曲糟固态制曲对米曲霉3.042产孢子及产酶特性影响[J].福建农业学报, 2023, 38(2):238-244.ZHAO Y T, LIANG Z C, REN X Y, et al.Effects of solid-state fermentation of Hongqu rice wine grains on spore production and enzyme-production characteristics of Aspergillus oryzae 3.042[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2023, 38(2):238-244.
[29] LIU B, LI Y, CAO Z N, et al.Effect of Tetragenococcus halophilus, Zygosaccharomyces rouxii, and Torulopsis versatilis addition sequence on soy sauce fermentation[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies, 2021, 69:102662.
[30] 罗婷婷, 李晶晶, 胡海玥, 等.亚麻籽粕蛋白提取工艺优化及蛋白结构和功能特性研究[J].食品工业科技, 2025, 46(3):258-268.LUO T T, LI J J, HU H Y, et al.Optimization of flaxseed meal protein extraction process and study of protein structure and functional properties[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(3):258-268.
[31] 董阳, 李晓敏, 史玉东, 等.常见植物蛋白的分类组成和性质研究概述[J].农产品加工, 2024(2):84-92.DONG Y, LI X M, SHI Y D, et al.Classification, composition and properties of common plant proteins[J].Agricultural Products Processing, 2024(2):84-92.
[32] LI J Y, SUN C G, SHEN Z Y, et al.Untargeted metabolomic profiling of Aspergillus sojae 3.495 and Aspergillus oryzae 3.042 fermented soy sauce koji and effect on moromi fermentation flavor[J].LWT, 2023, 184:115027.
[33] SENG T H, 周斌, 侯莎, 等.盐分对广式高盐稀态酱油发酵微生物菌群结构的影响[J].食品与发酵工业, 2022, 48(1):45-54.SENG T H, ZHOU B, HOU S, et al.Effect of salt on the microbial community structure of Cantonese-style high-salt dilute soy sauce fermentation[J].Food and Fermentation Industries, 2022, 48(1):45-54.
[34] 姚玉静, 陈嘉辉, 尹文颖.固形物浓度对高盐稀态酱油滋味物质的影响[J].食品工业科技, 2017, 38(8):133-138.YAO Y J, CHEN J H, YIN W Y.Effect of solid concentration on the taste of soy sauce with high salt liquid state fermentation[J].Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(8):133-138.
[35] 冯云子, 崔春, 高献礼, 等.中式酱油与日式酱油非挥发性成分的比较[J].食品与发酵工业, 2010, 36(7):62-66.FENG Y Z, CUI C, GAO X L, et al.Comparative study on non-volatile components in traditional Chinese-type soy sauce and Japanese-type soy sauce[J].Food and Fermentation Industries, 2010, 36(7):62-66.
[36] 余洁瑜, 林礼钊, 李维新, 等.酸性蛋白酶对高盐稀态酱油发酵的影响[J].中国酿造, 2022, 41(7):185-190.YU J Y, LIN L Z, LI W X, et al.Effects of acidic protease on high-salt dilute-state soy sauce fermentation[J].China Brewing, 2022, 41(7):185-190.
[37] 赵国忠, 姚云平, 唐晓姝, 等.米曲霉机理性探索对酱油生产的启示[J].中国酿造, 2015, 34(2):104-108.ZHAO G Z, YAO Y P, TANG X S, et al.Exploring the mechanism of Aspergillus oryzae for soy sauce fermentation[J].China Brewing, 2015, 34(2):104-108.
[38] LI J Y, ZHANG M L, FENG X J, et al.Characterization of fragrant compounds in different types of high-salt liquid-state fermentation soy sauce from China[J].LWT, 2022, 169:113993.
[39] 冶梓芩, 王进英, 马桂兰, 等.不同油料蛋白品质特性对比研究[J].中国粮油学报, 2024, 39(12):97-105.YE Z Q, WANG J Y, MA G L, et al.Comparative study on protein quality characteristics of different oil crops[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2024, 39(12):97-105.