乌衣红曲是红曲发酵剂的典型代表,是红曲酒酿造中特有的糖化剂、发酵剂和生香剂[1];由该曲酿制的红曲酒出酒率高、风味复杂、氨基酸含量丰富且寒热性更为平衡[2-3],因此在传统发酵食品领域具有重要的研究价值和应用前景。目前,乌衣红曲的生产主要采用传统制备工艺,包含十余个操作工序[4];其中,发酵48 h的一次浸渍(清水浸渍,俗称过头水)和72 h的二次浸渍(石灰水浸渍,俗称过二水)构成关键质量控制点。值得注意的是,二次浸渍使用的石灰水[即Ca(OH)2水溶液]虽被生产经验证实可提高乌衣红曲品质,但其作用机制尚未建立完整的理论模型。近年,针对乌衣红曲等红曲发酵剂的研究主要聚焦于菌群结构解析[5-7]、优质菌筛选评价[8-9]、特征挥发性风味成分分析[10]以及功能性成分研究[11]等方面;在工艺优化方面,主要集中于菌种筛选、纯种制曲与菌种配比优化等方面的生产性试验与探讨[12-13];但鲜见针对浸渍环节的系统研究。
为此,本研究采用福建省大田县建忠村的传统土窑制曲技艺,在乌衣红曲发酵制备过程,分别以Ca(OH)2和NaOH水溶液进行浸渍处理,采用高通量测序技术和Spearman相关性网络分析方法,研究明确不同碱液浸渍处理对乌衣红曲真菌菌群结构与发酵性能的调控作用,以期为乌衣红曲质量控制提供理论与技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
籼米、曲青、曲母,均由福建飞红酒业有限公司提供;其中,籼米为贮存1年的陈米;曲青是以籼米为基料,经接种黑曲霉(Aspergillus niger)培养而得;曲母是以籼米为基料,经接种紫色红曲菌(Monascus purpureus)培养而得。淀粉酶测试盒,南京建成生物工程研究所;CaO、NaOH、CaCl2,国产食品级试剂;其他所用试剂为国产分析纯或化学纯。
1.2 仪器与设施
UH5300紫外可见分光光度计,日立公司;BSA224S电子天平、PB-10酸度计,德国赛多利斯股份公司;DW-86L338J超低温冰箱,海尔集团公司;CR22N高速冷冻离心机,德国艾本德股份公司;HH-2数显恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;ZWY-2102C立式双层恒温振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;GI54DW高压灭菌器,美国致微;DHG9070电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科技有限公司;GM200刀式研磨仪,德国莱驰公司。发酵窑洞-289号土窖,位于福建省大田县建设镇建忠村,由福建飞红酒业有限公司依山而建,已有100多年历史,长×宽×高为10.0 m×3.0 m×2.0 m。
1.3 实验方法
1.3.1 乌衣红曲制备工艺流程及操作要点
工艺流程,主要包括浸米、蒸饭、接种拌曲、堆置发酵、平铺发酵、一次浸渍、平铺发酵、二次浸渍、平铺发酵和出曲晾晒等工艺环节。
操作要点:1)浸米:使用陈年灿米,注入清水浸泡6～12 h,浸米程度以米粒保持完整、可指掐成粉状为宜。2)蒸饭:将浸泡的大米捞起,沥干水分,常压蒸煮15～20 min;蒸煮要求米粒表面出气均匀,米饭蒸熟蒸透,熟而不糊,透而不烂,疏松均匀。3)接种拌曲:将蒸好的米饭摊开在木板上,待温度降至(37±2)℃,以50 kg米饭:10 g曲青:100 g曲母的比例接入曲青和曲母,搅拌均匀。4)堆置发酵:将接种物料放进土窑,进行堆剁放置发酵(每堆约25 kg),使其快速升温。5)平铺发酵:当物料中心温度高于35 ℃时将其均匀平铺,厚度为4～5 cm;通过翻曲与调节土窑出风口大小以控制物料温度在30～35 ℃。6)一次浸渍:待物料发酵至48 h,将其装入竹筐,浸入清水3～5 s,取出沥干。7)平铺发酵:将物料转入土窑并均匀平铺,温度调节同上。8)二次浸渍:待物料发酵至72 h,将其装入竹筐,进行一定浓度碱液浸渍处理3～5 s,沥干水分。9)平铺发酵:操作同7)。10)出曲晾晒:发酵120 h后,将物料收集并转出土窑,置阳光下平铺晾晒至含水量10%以下,即为成曲。
1.3.2 碱液浸渍处理方法
1.3.2.1 不同碱液浸渍处理
在传统乌衣红曲制备的二次浸渍工序,分别采用3.5 mmol/L的Ca(OH)2溶液(pH=12.19)、7.0 mmol/L 的NaOH水溶液(pH=12.23)进行浸渍处理发酵物料,以清水和3.5 mmol/L的CaCl2水溶液处理为对照;检测各处理乌衣红曲真菌菌群结构,以及糖化酶活力、淀粉酶活力和发酵力等发酵性能相关指标。
1.3.2.2 不同浓度Ca(OH)2溶液浸渍处理
在传统乌衣红曲制备的二次浸渍工序,分别采用浓度为1.75、3.50、7.00 mmol/L的Ca(OH)2溶液(pH值分别为11.97、12.19和12.25)进行浸渍处理发酵物料,以清水为对照;检测各处理乌衣红曲糖化酶活力、淀粉酶活力和发酵力等发酵性能相关指标。
1.3.3 乌衣红曲真菌菌群结构测定
采用高通量测序方法,委托北京奥维森基因科技有限公司进行。
1.3.4 乌衣红曲发酵性能测定
糖化酶活力采用QB/T 5188—2017《酿造红曲》中的碘量法进行测定。其中糖化酶活力单位的定义为40 ℃、pH 4.6条件下,1 g绝干曲(扣除含水量,下同)1 h分解可溶性淀粉生成葡萄糖的质量(mg)为1个酶活力单位,符号为U,以mg/(g·h)表示。
淀粉酶活力和发酵力测定均按照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》进行。其中,淀粉酶活力单位的定义为35 ℃、pH 4.6条件下,1 g绝干曲1 h能液化淀粉的质量(g)为1个酶活力单位,符号为U,以g/(g·h)表示;发酵力单位的定义为30 ℃、72 h内0.5 g绝干曲利用可发酵糖类所产生的CO2质量(g)为1个单位,符号为U,以g/(0.5 g·72 h)表示。
1.3.5 乌衣红曲含水量测定
采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法进行测定。
1.4 数据处理
采用Visio 2016、DPS 6.01等软件以及Metware平台(https://cloud.metware.cn/)进行数据分析或作图;相关性分析使用Spearman等级相关系数法。
2 结果与分析
2.1 碱液浸渍处理对乌衣红曲真菌菌群结构的影响
乌衣红曲中的核心真菌(丰度>1%)主要由曲霉属(Aspergillus)、红曲霉属(Monascus)、根霉属(Rhizopus)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、塞伯林德纳氏酵母属(Cyberlindnera)、季也蒙酵母属(Meyerozyma)和米勒氏酵母属(Millerozyma)的微生物组成,总丰度达90%以上(图1);其中的曲霉属和红曲霉属应以人工接种的黑曲霉和紫色红曲菌为主,其他菌群则源于乌衣红曲开放式制曲过程的环境微生物自由定植。
图1 不同浸渍处理的乌衣红曲真菌菌群结构
Fig.1 Fungal community structure of Wuyi Hong Qu under different immersion treatments
以清水为对照,2种碱液浸渍处理后的乌衣红曲核心真菌菌群丰度发生不同程度上调或下调;其中,Ca(OH)2浸渍处理后,曲霉属和根霉属丰度分别下调17.82%和6.52%,红曲霉属、塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属、季也蒙酵母属和米勒氏酵母属的丰度分别上调2.22%、7.50%、8.39%、3.42%和1.18%;NaOH溶液浸渍处理后,曲霉属和根霉属丰度分别下调11.71%和6.67%,红曲霉属、塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属、季也蒙酵母属和米勒氏酵母属的丰度分别上调0.87%、2.03%、6.16%、4.01%和2.65%。以CaCl2处理的乌衣红曲真菌菌群结构与清水处理相似,除酿酒酵母属丰度比清水高1.03%以外,其他菌群丰度差均在1.0%以下。结果表明:碱液浸渍处理可上调红曲霉属、塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属、季也蒙酵母属和米勒氏酵母属菌群丰度,下调曲霉属与根霉属菌群丰度;Ca(OH)2对塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属和红曲霉属的调控效果优于NaOH。
2.2 碱液浸渍处理对乌衣红曲发酵性能的影响
如图2-a所示,Ca(OH)2及NaOH浸渍处理的乌衣红曲发酵力分别达1.11 g/(0.5 g·72 h)和1.01 g/(0.5 g·72 h),比清水处理提高19.82%(P<0.05)和8.60%;CaCl2处理的发酵力略高于清水处理,但两者之间无显著差异(P>0.05)。2种浸渍处理的乌衣红曲淀粉酶活力(图2-b)与糖化酶活力(图2-c)之间无显著差异(P>0.05),但与清水相比发生显著下降(P<0.05),其中淀粉酶活力分别下降31.86%和25.66%,糖化酶活力分别下降22.47%和15.59%,但仍高于QB/T 5188—2017《酿造红曲》和Q/DTHQ 0001S《乌衣红曲》要求;CaCl2与清水处理间的糖化酶活力和淀粉酶活力无显著差异(P>0.05)。结果表明,碱液浸渍处理上调乌衣红曲发酵力,且Ca(OH)2的调控效果更为显著;但同时碱液浸渍处理导致乌衣红曲淀粉酶和糖化酶活力发生不同程度下降。
a-发酵力;b-淀粉酶活力;c-糖化酶活力
图2 不同浸渍处理的乌衣红曲发酵性能
Fig.2 Fermentation performance of Wuyi Hong Qu under different immersion treatments
注:不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 乌衣红曲真菌菌群与发酵性能的关联性
通过Spearman相关性网络分析发现(图3),乌衣红曲发酵力与Monascus、Cyberlindnera、Saccharomyces、Meyerozyma、Millerozyma、Penicillium、Saprochaete、Saccharomycopsis和Cunninghamella的菌群呈正相关,与Aspergillus、Rhizopus、Blastobotrys、Talaromyces、Phialocephala、Debaryomyces、Knufia和Apiotrichum的菌群呈负相关。在核心真菌中,发酵力与Monascus、Cyberlindnera、Saccharomyces、Meyerozyma和Millerozyma的正相关关系较大(r≥0.6),其中与Monascus、Cyberlindnera、Saccharomyces和Millerozyma密切正相关(r=0.8);同时,发酵力与Aspergillus、Rhizopus密切负相关(|r|=0.8)。淀粉酶活力、糖化酶活力与这些菌群的相关性恰好相反。另外,3个发酵性能指标与Wickerhamomyces均无相关性。
图3 乌衣红曲发酵性能与真菌菌群间的相关性网络图
Fig.3 Correlation network diagram between fermentation performance and fungal community of Wuyi Hong Qu
注:AA-淀粉酶活力;GA-糖化酶活力;FP-发酵力;红线表示正相关;蓝线表示负相关。
基于乌衣红曲真菌菌群与发酵性能间的关系,以及不同处理条件下真菌菌群结构变化,对与发酵力呈正、负相关的菌群进行统计,结果见图4。与清水相比,Ca(OH)2及NaOH两种浸渍处理下,与乌衣红曲发酵力呈正相关的菌群丰度分别上升24.80%和17.62%;与淀粉酶、糖化酶活力呈正相关的菌群相对丰度发生同等程度下降。因此,Ca(OH)2或NaOH浸渍处理上调与乌衣红曲发酵力呈正相关菌群,特别是与之密切正相关的核心真菌菌群Monascus、Cyberlindnera、Saccharomyces和Millerozyma,同时下调与之呈负相关菌群,特别是与之密切负相关(即与淀粉酶、糖化酶活力密切正相关)的核心真菌Aspergillus和Rhizopus,进而使得发酵力提高,淀粉酶、糖化酶活力下降。
图4 不同浸渍处理条件下与发酵力相关真菌菌群丰度变化
Fig.4 Changes in abundance of fungal communities related to fermentation power under different immersion treatment conditions
2.4 不同浓度Ca(OH)2溶液浸渍处理对乌衣红曲发酵性能的调控作用
如图5所示,随着Ca(OH)2溶液浓度升高,发酵力先上升后下降,其中1.75 mmol/L Ca(OH)2溶液浸渍处理的乌衣红曲发酵力显著高于其他处理(P<0.05),达1.59 g/(0.5 g·72 h),比清水处理提高20.45%;7.00 mmol/L Ca(OH)2溶液浸渍处理条件下的乌衣红曲发酵力与清水处理相当(P>0.05)。糖化酶、淀粉酶活力均随Ca(OH)2溶液浓度升高而不断下降至趋于平缓;其中1.75 mmol/L Ca(OH)2溶液浸渍处理条件下的糖化酶、淀粉酶活力与清水处理无显著差异(P>0.05)。可见,不同浓度Ca(OH)2溶液浸渍处理可以调控乌衣红曲发酵力、糖化酶和淀粉酶活力,其最佳作用浓度为1.75 mmol/L。
图5 不同浓度Ca(OH)2处理的乌衣红曲发酵性能
Fig.5 Fermentation performance of Wuyi Hong Qu treated with different concentrations of Ca(OH)2
3 讨论
3.1 乌衣红曲真菌菌群多样性成因及其对发酵性能的影响
乌衣红曲传统发酵制备工艺仅对黑曲霉(俗称曲公)和红曲霉(俗称曲母)实施人工接种,在本试验采用纯菌接种的情况下,其真菌菌群仍存在多样性,即除了曲霉属和红曲霉属以外,还包含根霉属以及酵母菌的多个菌属,这些菌群应来自开放式制曲过程的环境微生物自由定植;因此,这是传统工艺决定的微生物菌群多样性和复杂性[14]。在这些微生物中,霉菌和酵母菌是参与发酵的优势真菌菌群[4];其中,霉菌分泌的淀粉酶、糖化酶和酯化酶等关键酶系,主导了发酵过程液化、糖化和酯化等转化反应;酵母菌则是醇化反应的主要驱动力;同时它们还能提供代谢产物、菌体自溶物以及基质残留物等,共同赋予红曲酒独特的风味特征[15-16];可见,真菌菌群构成与性能是决定乌衣红曲品质的核心要素。乌衣红曲传统发酵制备工艺的环境条件,如温度、湿度和pH等,是影响菌株定植效果和繁殖能力的主要外在条件,而酵母菌活力不足导致的发酵效率低下是企业经常遇到的技术难题。
3.2 碱液浸渍处理对微生物菌群和发酵性能的调控作用
本文研究发现,碱液浸渍处理通过上调与乌衣红曲发酵力呈正相关菌群,如红曲霉属、塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属和米勒氏酵母属,同时下调与之呈负相关菌群,如曲霉属和根霉属,进而提升发酵力。这一作用路径可能涉及碱处理激发的发酵物料环境条件改变、微生物菌群演替与酶代谢功能改变等多个过程。结合前期对乌衣红曲传统发酵制备过程理化因子与菌群的跟踪监测研究结果:二次浸渍处理(即浸石灰水)降低了物料总酸和温度,增加了物料含水量;随后的发酵过程,物料温度、总酸先上升后下降,水分逐渐下降;同时,在二次浸渍处理后的12 h内,乳酸菌、红曲霉和酵母菌等菌群丰度上升,根霉、曲霉等菌群则恰好相反(待另文发表)。由此可以推断,碱处理后的物料环境首先适宜乳酸菌、红曲霉等菌群生长:Ca(OH)2或NaOH溶液提供的OH-中和了物料中积累的乳酸等主要有机酸,从而为乳酸菌解除或降低了代谢产物的反馈抑制效应,其糖利用能力和有机酸合成能力得以显著恢复,因此浸渍处理后的发酵过程,物料首先表现出总酸快速累积的现象,继而为耐酸性强的酵母菌和红曲霉属菌群提供增殖环境[17-18],根霉和曲霉属菌群则相对被抑制。期间,除了酸度的影响以外,温度、水分也必然是影响菌群演替的重要外在因素。如浸渍后的发酵初期,物料水分高且温度恢复至常温,此时对兼性厌氧型乳酸菌生长有利;随着发酵进程推进,物料含水量降低使得其透气性增强,需氧型酵母菌和红曲霉获得有利增殖条件;当微生物繁殖产生的生物热累积引起物料温度逐步攀升和水分进一步下降,耐温、需氧型红曲霉对不利条件的抵抗力明显优于其他菌株[19],从而可以继续保持其生长生态位。因此,碱液浸渍处理的作用实质是以其激发的乌衣红曲发酵体系酸度变化为主导,温度、水分等非生物因素协同驱动的微生物菌群结构演替,进而调控菌群酶代谢水平,即发酵性能变化。
但是,从本研究结果看,NaOH溶液浸渍处理对发酵力的调控效果不及Ca(OH)2,其原因可能为:在本研究设置的等OH-浓度下,Ca2+参与的调控作用优于Na+。已有研究表明,Ca2+可直接作为辅因子激活多种代谢酶,如乳酸菌中的乳酸脱氢酶[20]、红曲霉中的淀粉酶[21]等;另外,Ca2+在维持微生物细胞结构及环境适应等核心环节也发挥重要作用[22];而Na+在微生物代谢中的功能则主要涉及渗透压调节、能量转换及物质运输等过程[23]。另外,在本研究设置的等Ca2+浓度下,CaCl2不及Ca(OH)2,且其处理效果与清水无显著差异,进一步说明在本研究体系中OH-为主导调控因子,Ca2+主要发挥辅助性功能。即Ca(OH)2通过“酸根中和Ca2+供给”协同作用,有效调控发酵过程乌衣红曲真菌菌群,进而显著影响其发酵性能。
3.3 Ca(OH)2处理对红曲发酵剂及红曲酒行业的意义
碱处理是农产品加工中常用的方法,其中Ca(OH)2具有成本低、操作简单等优点,成为生产常用的碱处理剂[24]。目前,基于Ca(OH)2中Ca2+对含淀粉原料加工适性改善方面的作用,已有大量研究[25-27];另有部分研究基于OH-的化学特性,在农产品采后保鲜、酸度调节等方面起到独特效果[28]。本文Ca(OH)2在乌衣红曲发酵性能调控方面发挥的显著效果,则依靠2种离子的正向协同作用。进一步试验发现,Ca(OH)2对乌衣红曲发酵性能的调控效果受其添加浓度影响很大;其中,采用1.75 mmol/L(即生产常用浓度的1/2)进行浸渍处理获得的发酵力最高,且糖化酶、淀粉酶活力未受显著影响,这有助于在确保红曲酒酿造原料利用率的同时,提升出酒率,达到节粮减损、提质增效的目的。另外,根据Ca(OH)2调控作用机制和实际生产需求,也可以通过调整Ca(OH)2溶液浸渍浓度,实现目标菌群与发酵性能的靶向调控。
4 结论
本文深入探究了不同碱液浸渍处理对乌衣红曲真菌菌群和发酵性能调控作用。结果表明,Ca(OH)2 和NaOH两种处理上调与乌衣红曲发酵力呈正相关菌群,特别是与之密切正相关的核心真菌菌群,即红曲霉属、塞伯林德纳氏酵母属、酿酒酵母属和米勒氏酵母属;下调与之呈负相关菌群,特别是与之密切负相关(即与淀粉酶、糖化酶活力密切正相关)的核心真菌,即曲霉属和根霉属,进而使得发酵力提高,淀粉酶、糖化酶活力下降。进一步研究发现,采用1.75 mmol/L Ca(OH)2(生产常用浓度的1/2)处理呈现最优的综合性能指标,其中发酵力提高20.45%,同时淀粉酶、糖化酶活力未受显著影响。该研究是对传统乌衣红曲制备工艺的科学理论阐释,可为乌衣红曲质量控制以及发酵性能精准靶向调控提供基础数据。
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