随着国民经济水平提升及健康意识增强,我国乳制品消费呈现多元化趋势,奶酪作为高附加值品类需求持续增长。然而,本土市场仍面临双重制约:原制奶酪高度依赖进口,而国内生产以再制奶酪为主,原制奶酪的风味和感官品质在国内缺乏竞争力。因此,筛选优质菌株开发符合国人偏好且兼具东方特色的原制奶酪,对实现我国奶酪产业技术升级和进口替代具有重要战略意义。
红曲霉奶酪以药食同源微生物红曲霉(Monascus spp.)为核心发酵剂,其代谢产生的红曲色素、洛伐他汀等功能物质赋予产品独特价值[1]。相比欧洲霉菌奶酪(如蓝纹奶酪、白霉奶酪),该产品通过调控蛋白质水解与脂质氧化平衡,形成更契合东亚人群感官阈值的风味特征[2-3]。此外,红曲霉在传统发酵食品(如红曲腐乳等)中的风味接受度验证了市场潜力,结合功能活性物质积累特性,成为本土乳制品创新的重要方向。高血压是导致心血管疾病、肾衰竭和中风的主要危险因素,其全球疾病负担持续加重,因此研究预防和治疗方法至关重要。血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)作为肾素-血管紧张素系统与激肽释放酶-激肽系统的核心调控因子,其抑制剂开发已成为心血管疾病干预的关键方向。然而传统合成药物因肝肾毒性等副作用存在应用局限,使得兼具安全性及功效性的食源性ACE抑制肽研究备受关注,但其关键结构尚未完全了解[4]。目前研究表明,乳源性(如奶酪[5])、豆源性(如大豆[6])、水产源性(如鱼虾[7])等食品蛋白水解产物中,存在具有ACE抑制活性的生物活性肽,为新型降压功能食品开发提供了物质基础。
蛋白水解是奶酪成熟过程中的重要生化反应之一,其产生的生物活性肽具有显著功能特性。红曲霉通常具有较强的蛋白水解能力,因而具有产生大量活性肽的功能潜力。前期研究证实,红曲霉奶酪中富含分子质量小于3 kDa的短链肽,且ACE抑制肽种类丰富,具有良好降血压的潜力[8]。通常认为,胃肠道是活性多肽代谢并进一步发挥作用的重要部位,只有经过胃肠道消化之后保留下来的肽才可能在肠道中被有效吸收,从而成为可用于目标器官或组织中生理功能的生物可利用肽,表现出全身效应[9]。越来越多的证据表明,部分活性肽在摄入后可能会被消化酶降解,引发结构和功能活性的变化[10]。HELAL等[11]发现Ras奶酪经胃肠消化后,ACE抑制活性进一步提高。宋雪梅等[12]发现,牦牛硬质干酪经消化后,ACE抑制肽种类有所减少,但ACE抑制活性在消化前后无显著差异。因此,活性肽的胃肠道稳定性直接影响生物可利用度的功效表达。
目前,消化对奶酪ACE抑制活性的影响尚无明确规律。此外,对红曲霉奶酪消化前后的ACE抑制肽的活性和结构变化也鲜有研究。因此,本研究评估了胃肠道消化对红曲霉奶酪游离氨基酸、ACE抑制活性及ACE抑制肽的影响,探索了产生ACE抑制肽的关键功能蛋白及水解位点,并利用分子对接技术对特征ACE抑制肽进行作用机理解析,以期为红曲霉奶酪提供更加积极的消费前景和为降压保健食品的开发提供新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
生牛乳,光明乳业股份有限公司;商业发酵剂 FLORA、STI-13,科汉森(中国)有限公司;凝乳酶(酶活力:890 IMCU/g),北京多爱特生物科技有限公司;红曲霉菌株BC20、ZX99,实验室自筛菌株;ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl] ethanesulfonic acid,HEPES),美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
HVE-50高压蒸汽灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;HPP110奶酪成熟箱,德国MEMMERT公司;Spectramax M5酶标仪,美国 Molecular Devices 公司;Q-Exactive HFX质谱仪,美国 Thermo 公司;L-8900-1全自动氨基酸分析仪,日本 HITACHI 公司;Reprosil-pur 120 C18-AQ 液相色谱柱,德国 Dr.Maisch 公司。
1.3 方法
1.3.1 红曲霉奶酪样品制备
参照贾向飞等[8]描述的生产工艺进行红曲霉奶酪制作。成熟完成后,奶酪采用真空、低温贮藏。整个奶酪制作过程及成熟环境保持干净,防止杂菌污染。奶酪取样方法为将整个奶酪内外混合均匀后取样,一式3份。
1.3.2 红曲霉奶酪体外模拟胃肠道消化
基于红曲霉奶酪成熟周期与功能活性动态变化的研究基础,本实验选定成熟25 d(ACE抑制活性达峰值阶段)的样品开展模拟胃肠道消化研究。消化方案参照HELAL等[11]的方法进行。实验设置未消化对照组(M1)与消化处理组(M2:胃消化后;M3:肠消化后)。对照组处理:称取5 g红曲霉奶酪样品,与45 mL去离子水混合后置于40 ℃恒温水浴振荡器中平衡30 min,经高速均质处理(3～4 min)获得均匀悬浮液。消化组处理采用三级连续消化体系:在口腔相消化阶段,将10 g奶酪与10 mL模拟唾液(含α-淀粉酶150 U/mL)于37 ℃恒温振荡器(10 r/min)中消化2 min。在胃相消化阶段,向混合液中加入80 mL模拟胃液(含胃蛋白酶2 000 U/mL),采用1 mol/L HCl溶液调节体系pH值至3.0,维持37 ℃、10 r/min振荡条件持续消化120 min。在肠相消化阶段,取胃消化产物45 mL,以1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5终止胃蛋白酶活性,加入胰蛋白酶(200 U/mL)和胰凝乳蛋白酶(20 U/mL),继续于37 ℃、10 r/min条件下持续消化120 min。各阶段消化终止后,立即将样品置于沸水浴中灭活5 min,随后冷却至室温。采用高速冷冻离心机(4 ℃、8 000×g、20 min)分离消化产物,移除上层脂质相后,依次通过Whatman No.41滤纸及0.22 μm水系微孔滤膜进行过滤。一部分样品液置于真空冷冻干燥机中制备冻干粉供生物活性测定,另外一部分放置在-20 ℃冰箱中,以便下一步进行纳升高效液相-质谱和游离氨基酸含量分析。
1.3.3 红曲霉奶酪消化过程中的游离氨基酸含量测定
参照ZHANG等[13]的方法。采用全自动氨基酸分析仪,样品经0.2 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 2.2)和50 g/L的磺基水杨酸处理后,离心。将上清液经过 0.22 μm膜过滤后,调整pH值为1.7～2.2。采用阳离子交换柱分离不同氨基酸组分及茚三酮显色法进行定性和定量检测。
1.3.4 红曲霉奶酪消化过程中的ACE抑制活性测定
参照郝欣悦等[14]描述的方法进行测定,将20 μL、0.1 U/mL的ACE吸入透明96孔板中,将40 μL 80 mmol/L HEPES缓冲液(pH 8.3)和冻干粉溶液(<3 kDa)分别添加至对照孔和样品孔中。最后向每个孔中加入50 μL预热的1 mmol/L FAPGG,立即将其混合均匀。在340 nm波长下使用酶标仪测定对照孔和样品孔的初始吸光度(A′和
在37 ℃在黑暗中保持30 min后再次进行吸光度测定(B′和
抑制活性按公式(1)计算:
ACE抑制率
(1)
式中:A,对照孔的吸光度减少值,即
样品孔的吸光度减少值,即
1.3.5 红曲霉奶酪消化前后肽谱鉴定
每个样品取4 μL,在nano-UPLC 液相系统 EASY-nLC1200进行分离后,联用配备纳升离子源的质谱仪进行数据采集。色谱分离采用100 μm ID×15 cm反相色谱柱(1.9 μm)进行。流动相采用乙腈-水-甲酸体系,其中流动相A为0.1%甲酸-98%水溶液(乙腈为2%),B相为0.1%甲酸-80%乙腈溶液(水为20%)。色谱柱以100%的A相平衡后,样品由自动进样器直接上样到色谱柱,然后经色谱柱梯度分离,流速300 nL/min,梯度时长 60 min。流动相 B比例:2%～5%持续2 min,5%～22%持续34 min,22%～45%持续20 min,45%～95%持续2 min,95%持续2 min。
质谱分析采用数据依赖性采集模式,采取正离子检测模式。一级扫描范围350～1 600 m/z,分辨率为120 k(@ 200 m/z)。二级扫描分辨率15 k。根据色谱峰峰宽,动态排除时间设置为30 s;不对单电荷离子和高于6价的离子进行二级扫描。原始数据文件使用Proteome Discoverer软件及其内置的Sequest HT搜索引擎进行搜库分析。
1.3.6 ACE抑制活性肽鉴定及毒性和致敏性预测
使用牛奶生物活性肽数据库MBPDB(http://MBPDB.nws.oregonstate.edu/)和BIOPEP(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/)对先前报道过的有ACE抑制能力的活性肽进行确认,确保100%同源性。使用ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html)和AllergenFP(http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/)数据库对筛选ACE抑制肽进行潜在的毒性和致敏性的预测。
1.3.7 分子对接
参照ZHANG等[15]的方法,使用AutoDock软件进行半柔性分子对接。ACE的晶体结构(PDB:1O8A)从RCSB蛋白数据库中下载。对接前,用软件Discovery Studio 2019从晶体结构中去除水以及删除其他配体,保留锌原子和氯原子,加氢,使用“Prepare Protein”前处理操作优化蛋白结构。利用软件Discovery Studio 2019自带程序构建及预测肽的结构,通过“Prepare Ligands”进行前处理,使用“CHARMm”力场进行能量最小化优化肽的结构。对接网格中心的坐标设置为x:43.821,y:33.61,z:44.38,大小为80×80×80,反应约束框的间距为0.375 Å。对接结果使用PyMOL软件进行可视化,相互作用力分析借助Discovery Studio 2019软件进行。
1.3.8 数据处理与统计分析
所有数据均3次平行,采用SPSS 26软件对数据统计学分析,结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著。作图由Origin 2022、Excel软件、Hiplot生信分析平台(https://hiplot.com.cn/home/index.html)、指纹图谱分析(http://bioware.ucd.ie/peptigram/),在线软件MetaboAnalyst 5.0进行完成。
2 结果与分析
2.1 体外消化对红曲霉奶酪中游离氨基酸含量的影响
氨基酸作为蛋白质和肽的最终分解单位,其生物可及性与功能活性显著优于大分子肽段,更加容易被人体吸收和发挥其功能作用。为阐明红曲霉奶酪消化过程中游离氨基酸的组成变化,研究测定了不同消化阶段的氨基酸组成特征。如表1所示,测定到24种游离氨基酸,定量分析结果表明,其功能性氨基酸丰富,游离氨基酸总量随着消化进行逐渐增加,由消化前(14.27±0.81) μmol/mL上升到消化后的(23.62±1.09) μmol/mL,其中亮氨酸、苯丙氨酸等多种疏水性氨基酸总量也由(6.21±0.21) μmol/mL上升到(9.71±0.35) μmol/mL。研究表明,氨基酸的疏水性越强,ACE抑制肽的作用能力越强,这可能与疏水残基通过范德华力与ACE活性位点形成稳定疏水结合域有关[16]。在一项对ACE抑制肽结构与其活性之间的关系机制研究中发现,亮氨酸和脯氨酸在ACE抑制肽序列中呈现高频出现特征,对ACE-结合肽相互作用的稳定性有显著贡献作用[17]。此外,红曲霉标志性代谢产物GABA的含量也在消化过程中持续积累,其通过激活GABAA受体介导的血管舒张信号通路,以及抑制ACE活性形成协同降压作用[18]。综上所述,红曲霉奶酪在胃肠消化过程中通过选择性富集疏水性氨基酸及功能活性物质,提升了生物可利用性,增强了其降血压潜力。
表1 红曲霉奶酪不同消化阶段的游离氨基酸含量
Table 1 Free amino acid content of Monascuscheese in different digestion stages
氨基酸不同消化阶段游离氨基酸含量/(μmol/mL)M1M2M3磷酸丝氨酸(P-Ser)0.51±0.021.31±0.121.56±0.04牛磺酸(Tau)0.00±0.000.19±0.010.27±0.01天冬氨酸(Asp)0.35±0.020.73±0.030.97±0.15苏氨酸(Thr)0.27±0.010.45±0.040.50±0.08丝氨酸(Ser)0.42±0.080.68±0.070.69±0.06谷氨酸(Glu)1.28±0.081.67±0.181.70±0.05甘氨酸(Gly)0.55±0.021.02±0.111.06±0.02丙氨酸(Ala)0.70±0.021.26±0.141.30±0.03缬氨酸(Val)1.12±0.041.49±0.161.51±0.04半胱氨酸(Cys)0.01±0.000.05±0.010.03±0.01甲硫氨酸(Met)0.35±0.010.53±0.060.49±0.02异亮氨酸(Ile)0.63±0.020.78±0.090.76±0.03亮氨酸(Leu)1.49±0.052.21±0.242.22±0.07酪氨酸(Tyr)0.73±0.021.04±0.111.20±0.08苯丙氨酸(Phe)0.82±0.011.69±0.181.67±0.08γ-氨基丁酸(GABA)0.33±0.120.93±0.100.94±0.04鸟氨酸(Orn)0.36±0.010.56±0.070.54±0.02赖氨酸(Lys)1.78±0.041.90±0.212.16±0.04组氨酸(His)0.47±0.010.65±0.090.87±0.03精氨酸(Arg)0.04±0.010.15±0.020.34±0.01脯氨酸(Pro)0.99±0.041.15±0.111.04±0.02天冬酰胺(Asn)0.20±0.040.32±0.040.40±0.05谷氨酰胺(Gln)0.76±0.100.71±0.070.67±0.03色氨酸(Trp)0.11±0.020.50±0.060.72±0.06∑游离氨基酸总量14.27±0.8121.95±2.3223.62±1.09∑疏水氨基酸6.21±0.219.61±1.049.71±0.35
2.2 体外消化过程中红曲霉奶酪ACE抑制活性的变化
如图1所示,随着消化的进行,ACE抑制活性显著升高(P<0.05),并呈现出剂量依赖性。以5 mg/mL标准质量浓度下,ACE抑制活性从M1的55.83%升高到M2的63.22%,再到M3的71.49%。较M1分别实现了13.22%和28.04%的活性增幅。这是因为消化过程中红曲霉奶酪中原本的蛋白质和肽段会受到消化酶的作用进一步水解,从无活性或活性较低的前体释放出新的ACE抑制活性肽,同时生成更多的游离氨基酸,从而使ACE抑制活性进一步提高。在对切达奶酪消化过程中ACE抑制活性变化的研究中发现,消化促进了蛋白水解产生更多、活性更高的ACE抑制肽从而提高其活性[19]。MUSHTAQ等[20]在对Himalayan奶酪的研究中也显示出相同的趋势,其均与本研究结果具有一致性。后续将对红曲霉奶酪消化前后ACE抑制肽具体生成情况及其作用机制进行进一步探究。
图1 红曲霉奶酪消化过程中ACE抑制活性变化
Fig.1 Changes of ACE inhibitory activity during the digestion of Monascus cheese
注:小写字母不同,表示同一时期不同浓度的样品之间差异显著(P<0.05);大写字母不同,表示不同时期同一浓度的样品差异显著(P<0.05)。
2.3 红曲霉奶酪在不同消化阶段乳蛋白来源肽段的产生情况
基于Nano-UPLC-MS/MS分析了红曲霉奶酪不同消化阶段乳源蛋白水解的动态特征,结果如表2所示。在样品M1、M2、M3中分别鉴定到乳蛋白来源肽1 955、1 520和1 008种,消化前后的肽谱组成发生了显著的变化。鉴定出的乳源肽的种类随着消化而减少,这是由于亲本蛋白被酶转化为低分子质量片段(<6个氨基酸残基),这些小肽可能难以离子化或产生清晰的信号,从而逃避了传统的质谱检测。β-CN和α-CN是肽段的主要来源,这与牛乳基质中酪蛋白高丰度特性及菌源蛋白酶特异性密切相关,如:PI型细胞壁蛋白酶主要水解β-CN,很少水解κ-CN,而PIII型酶可以水解αS1-CN、β-CN和κ-CN[21]。此外,与消化前相比,α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)和β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)在消化后数量有所增加,但是其他乳蛋白来源的肽数量在肠消化后有所减少。这是因为乳蛋白经消化酶处理后进一步水解,生成更多的低分子肽和游离氨基酸。研究表明,大多数ACE抑制肽的分子质量<2 kDa,低分子质量肽通常会显示出较高的ACE抑制活力[17]。这与WEI等[22]对乳饼进行体外消化研究的结果类似。
表2 红曲霉奶酪不同消化阶段乳蛋白衍生肽的产生情况
Table 2 Production of milk protein derived peptides in different digestion stages of Monascus cheese
参数鉴定到的乳蛋白衍生肽M1M2M3总乳蛋白衍生肽肽种类1 9551 5201 008αs1-CN500350263αs2-CN307334174β-CN988570385κ-CN10112882α-La11712β-Lg5812192ACE抑制肽种类755455ACE抑制肽总峰强度5.1×109±3.85×1081.07×1010±6.83×1081.38×1010±1.22×109αs1-CN141110αs2-CN1087β-CN442930κ-CN323α-La011β-Lg434
在对ACE抑制肽数量的统计中,在M1、M2、M3的样品中分别鉴定到75、54、55种有ACE抑制能力的活性肽,ACE抑制肽的总峰强度在消化过程中持续增加,一定程度上表明ACE抑制肽的生成变得更加集中,与上述ACE抑制活性的测定结果一致。许多研究表明,ACE抑制活性和肽段长度有一定关联,肽段越短,活性越强[23-24]。鉴定到的ACE抑制肽中,其主要来源为β-CN,其次是αS1-CN,少数ACE抑制肽来源于α-La和β-Lg。因此,本研究证实了消化对红曲霉奶酪的有益作用,乳蛋白的进一步水解产生了更高丰度的ACE抑制肽,增强了红曲霉奶酪的降血压潜力。
2.4 红曲霉奶酪不同消化阶段的ACE抑制肽分析
图2直观地显示了红曲霉奶酪不同消化阶段ACE抑制肽的重叠情况。在M1、M2、M3的样品中分别鉴定到12、2和2种独特的ACE抑制肽,以及36种共同存在的ACE抑制肽。这36种肽可能通过疏水作用或静电吸附作用形成非共价复合物,从而不易被消化酶降解[25],另一种可能是这部分肽在消化过程中被降解后又重新生成。图3显示了红曲霉奶酪不同消化阶段ACE抑制肽的丰度差异,其中约23种ACE抑制肽在M1样品中更丰富,M2样品中约有27种,M3样品中约有26种。M3样品中YKVPQL、LVYPFPGPIPNSLPQN、LYQEPVLGPVR、EMPFPK、VRGPFPIIV、PGPIPN等主要来源于β-CN,LDAQSAPLR、GLDIQK等来源于β-Lg,这些ACE抑制肽的功能也均经过体外或体内实验验证。总之,M3样品中的ACE抑制肽均是经胃肠道酶进一步降解保留下来的结果,对红曲霉奶酪发挥降血压功能特性具有直接作用。
图2 红曲霉奶酪不同消化阶段ACE抑制肽韦恩图
Fig.2 Venn diagram of ACE inhibitory peptides in different digestion stages of Monascus cheese
图3 红曲霉奶酪不同消化阶段的82个ACE抑制肽的聚类分析热图
Fig.3 Cluster analysis heat map of 82 ACE inhibitory peptides in different digestion stages of Monascus cheese
图4显示了红曲霉奶酪不同消化阶段ACE抑制肽在酪蛋白上的位置变化情况,包括αs1-CN(P02662)、αs2-CN(P02663)、β-CN(P02666)、κ-CN(P02668)。通过深绿色和浅绿色代表肽的高强度和低强度,颜色强度与该位置肽的峰强度成比例,宽度与该位置肽的数量成比例,虚线区域表示未检测到ACE抑制肽[26]。从图4可以看出,ACE抑制肽在酪蛋白上的覆盖率为:β-CN>αs1-CN>αs2-CN>κ-CN,并且不同消化阶段也存在着明显的差异。此外,未消化样品在αs2-CN(氨基酸位置约185～195),胃消化后样品在αs1-CN(氨基酸位置约155～165)、αs2-CN(氨基酸位置约100～110)、β-CN(氨基酸位置约145～155)、κ-CN(氨基酸位置约35～45)都表现独特的相对强度。CUI等[27]利用两步酶解法对浓缩乳蛋白水解产物进行了蛋白质组学分析发现,β-CN是水解物中肽段的主要来源,这可能与β-CN含量高与易水解有关。总之,ACE抑制肽富集情况会随消化进行有所变化,酪蛋白进一步被水解,部分ACE抑制肽的富集程度降低,同时也伴随着新的ACE抑制肽形成。
a-αs1-CN(P02662);b-αs2-CN(P02663);c-β-CN(P02666);d-κ-CN(P02668)
图4 鉴定ACE抑制肽的指纹图谱
Fig.4 Identification of the fingerprint of ACE inhibitory peptides
表3对红曲霉奶酪消化后峰强度最高的15种ACE抑制肽进行了总结,这些肽由6～11个氨基酸组成,主要来自于β-CN和αs1-CN。来源β-CN且含量最高的4个ACE抑制肽分别为NLHLPLPLL、GPFPIIV、VENLHLPLPLL和EMPFPK,根据先前的报道,除了GPFPIIV的IC50值不清楚之外,其余3个肽的IC50值分别为15、175、565.58 μmol/L[28-29]。来源于αs1-CN的3个ACE抑制肽分别是YFYPEL、YKVPQL和TTMPLW,它们的IC50值分别为8.82、22、51 μmol/L[30-32],相比于含量更高的来源于β-CN的3个ACE抑制肽,其IC50值更低,证明活性更好,但不排除是因测量方法差异造成的。造成不同ACE抑制肽活性的差异跟其特定的C末端及氨基酸组成有关,疏水性氨基酸更有利于与ACE活性位点结合,且研究发现Val等脂族氨基酸可以增强ACE抑制活性[32-33]。
表3 消化后强度最高的15种ACE抑制肽
Table 3 Top 15 ACE inhibitory peptides with the highest post-digestion intensity
氨基酸序列蛋白来源位置分子质量/Da峰强度毒性致敏性(可能)NLHLPLPLLβ-CN147～1551 023.654.17×109±3.26×108无无GPFPIIVβ-CN203～209742.452.21×109±2.54×108无有VENLHLPLPLLβ-CN145～1551 257.762.00×109±4.19×108无有EMPFPKβ-CN123～128748.378.29×108±2.33×108无有YFYPELαs1-CN159～164831.398.05×108±1.42×108无有YKVPQLαs1-CN119～124747.4470.07×108±1.33×108无有TTMPLWαs1-CN209～214748.375.72×108±1.34×108无无FALPQYαs2-CN189～194738.384.25×108±3.62×107无有YQEPVLβ-CN208～213748.394.04×108±4.07×107无有YQEPVLGPVRβ-CN208～2171 157.633.00×108±1.20×107无无VYPFPGPIPNβ-CN74～831 100.581.83×108±4.58×107无有AYFYPELαs1-CN158～164902.431.63×108±4.15×107无有GLDIQKβ-Lg25～30673.391.47×108±1.43×107无有NMAINPSKαs2-CN40～47874.451.33×108±1.86×106无有ENLHLPLPLLβ-CN146～1551 158.699.43×107±1.33×107无有
2.5 潜在抗消化ACE抑制肽筛选及分子对接
分子对接常用于研究分子之间的相互作用机制,预测配体和受体在空间中的结合位置及强度[15]。对接结果中的结合能值越低,表示受体和配体之间的结合越稳定,其相互作用越强[34]。
ACE是一种锌金属蛋白酶,主要有3个催化活性位点S1、S1′和S2,S1活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523;S2包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520;S1′包含Glu162,3个位点均具备疏水性特征[35]。表4对红曲霉奶酪消化过程中连续增加且消化后强度最高的3种潜在抗消化ACE抑制肽进行了统计,其均来源于酪蛋白、分子质量<1 000 Da。低分子质量肽通常更容易与ACE活性位点相结合,因而具有更好的ACE抑制活性[36]。筛选肽与ACE对接结果的详细信息如表5和图5所示,肽TTMPLW、FALPQY和YQEPVL的结合能分别是-9.49、-7.53、-4.51 kcal/mol。肽TTMPLW的结合能最低,其结合机理主要是与ACE残基形成5个氢键,其中包括S1的Ala354、Glu384和Tyr523。肽FALPQY与ACE残基形成9个氢键,其中包括S1的Ala354和S2 的His353。肽YQEPVL与ACE残基形成6个氢键,其中包括S1的Ala354。除了氢键之外,这3种肽与ACE对接过程中的疏水作用力等其他形式作用力也会对结合产生重要作用,从而影响到肽的ACE抑制能力。此外,这几种肽与SHI等[36]和HAO等[33]报道的ACE抑制肽作用相当,均具有良好的ACE抑制活性,为红曲霉奶酪的良好降血压特性提供了基础。
a-TTMPLW-ACE;b-FALPQY-ACE;c-YQEPVL-ACE
图5 ACE分子对接构象图(PDB:1O8A)
Fig.5 ACE molecular docking conformation (PDB:1O8A)
表4 消化过程连续增加且强度高的3种ACE抑制肽
Table 4 Three ACE inhibitory peptides with continuous increase and high intensity in digestion process
氨基酸序列蛋白来源分子质量/DaM1M2M3TTMPLWαs1-CN(209～214)748.377.52×107±2.88×1063.77×108±1.14×1075.72×108±1.34×108FALPQYαs2-CN(189～194)738.383.35×107±7.38×1062.12×108±2.00×1084.25×108±3.62×108YQEPVLβ-CN(208～213)748.391.03×108±1.27×1073.58×108±1.09×1084.04×108±4.07×107
表5 筛选ACE抑制肽在ACE结合位点分子对接获得最佳位姿结合能和化学相互作用评估结果
Table 5 Screening of ACE inhibitory peptides in ACE binding site molecular docking to obtain the best position binding energy and chemical interaction evaluation results
氨基酸序列对接结合能/(kcal/mol)氢键残基氢键数量氢键长度/ÅTTMPLW-9.49ALA-354ALA-356GLU-384TYR-52321111.8,2.12.31.92.0FALPQY-7.53TYR-135SER-219HIS-353ALA-354SER-355SER-517ARG-52211121212.72.12.12.1,2.22.22.52.12.0
续表5
氨基酸序列对接结合能/(kcal/mol)氢键残基氢键数量氢键长度/ÅYQEPVL-4.51ASN-70ARG-124ALA-354TYR-394HIS-410121111.92.5,2.81.92.52.0
3 结论
本研究系统评估了体外消化对红曲霉奶酪ACE抑制肽的影响。结果表明,红曲霉奶酪在经过胃肠道消化后,ACE抑制活性显著提升(P<0.05),达到71.49%,较消化前提高了28.04%。消化过程促进了蛋白质的进一步水解,导致总游离氨基酸及疏水性氨基酸的含量增加,同时ACE抑制肽的总峰强度也显著提高。通过质谱分析和指纹图谱分析发现,ACE抑制肽主要来源于β-CN,其次为α-CN。消化后识别出的ACE抑制肽主要集中在β-CN的特定氨基酸位置。此外,筛选出的3种潜在抗消化ACE抑制肽(TTMPLW、FALPQY、YQEPVL)与ACE显示了良好的结合能力,结合能值在-4.51～-9.49 kcal/mol,具有较强的ACE抑制活性。研究结果为红曲霉奶酪作为功能性降压食品的应用提供了理论支持,表明其在降血压方面具有潜在的工业应用价值。
[1] 伍忠玲, 刘振民.红曲霉次级代谢产物及其在乳制品中的应用研究进展[J].乳业科学与技术, 2023, 46(1):47-55.WU Z L, LIU Z M.Research progress on secondary metabolites in Monascus and their application in dairy products[J].Journal of Dairy Science and Technology, 2023, 46(1):47-55.
[2] 徐杏敏, 郑远荣, 刘振民, 等.基于代谢组学研究红曲霉奶酪的代谢产物特征[J].食品工业科技, 2023, 44(21):18-29.XU X M, ZHENG Y R, LIU Z M, et al.Study on the characteristics of metabolites in Monascus cheese based on metabolomics[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(21):18-29.
[3] ZENG H, WANG Y D, HAN H Y, et al.Changes in key aroma compounds and esterase activity of Monascus-fermented cheese across a 30-day ripening period[J].Foods, 2022, 11(24):4026.
[4] 李姣, 苏继磊, 陈敏, 等.马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选[J].食品科学, 2022, 43(4):119-126.LI J, SU J L, CHEN M, et al.Hydrolysis characteristics of Pinctada fucata meat protein and screening for angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides[J].Food Science, 2022, 43(4):119-126.
[5] BORAN O S, SULEJMANI E, HAYALOGLU A A.Acceleration of proteolysis, flavour development and enhanced bioactivity in a model cheese using Kuflu cheese slurry:An optimisation study[J].Food Chemistry, 2023, 412:135495.
[6] HOU D Z, FENG Q Q, NIU Z T, et al.Promising mung bean proteins and peptides:A comprehensive review of preparation technologies, biological activities, and their potential applications[J].Food Bioscience, 2023, 55:102972.
[7] CASTA
EDA-VALBUENA D, BERENGUER-MURCIA 
, FERNANDEZ-LAFUENTE R, et al.Biological activities of peptides obtained by pepsin hydrolysis of fishery products[J].Process Biochemistry, 2022, 120:53-63.
[8] 贾向飞, 郑远荣, 刘振民, 等.红曲霉奶酪的生物活性研究及ACE抑制肽的筛选[J].食品科学, 2024, 45(5):40-48.JIA X F, ZHENG Y R, LIU Z M, et al.Determination of biological activity of Monascus cheese and screening of ACE inhibitory peptides[J].Food Science, 2024, 45(5):40-48.
[9] JOGI N, YATHISHA U G, BHAT I, et al.Antihypertensive activity of orally consumed ACE-I inhibitory peptides[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2022, 62(32):8986-8999.
[10] ABEDIN M M, CHOURASIA R, CHIRING PHUKON L, et al.Characterization of ACE inhibitory and antioxidant peptides in yak and cow milk hard chhurpi cheese of the Sikkim Himalayan region[J].Food Chemistry, 2022, 13:100231.
[11] HELAL A, CATTIVELLI A, CONTE A, et al.Effect of ripening and in vitro digestion on bioactive peptides profile in ras cheese and their biological activities[J].Biology, 2023, 12(7):948.
[12] 宋雪梅, 梁琪, 宋国顺, 等.牦牛乳硬质干酪体外消化前后ACE抑制肽分析[J].食品与发酵工业, 2020, 46(15):52-59.SONG X M, LIANG Q, SONG G S, et al.Analysis of ACE-inhibitory peptides in hard cheese made from yak milk and its hydrolysate after in vitro gastrointestinal digestion[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(15):52-59.
[13] ZHANG X, ZHENG Y R, ZHOU R, et al.Comprehensive identification of molecular profiles related to sensory and nutritional changes in Mongolian cheese during storage by untargeted metabolomics coupled with quantification of free amino acids[J].Food Chemistry, 2022, 386:132740.
[14] 郝欣悦, 李晓东, 刘璐, 等.瑞士乳杆菌对契达干酪成熟期间所产ACE抑制肽的影响及其消化稳定性[J].食品科学, 2021, 42(18):143-149.HAO X Y, LI X D, LIU L, et al.Effect of Lactobacillus helveticus on production of ACE inhibitory peptides in cheddar cheese during ripening and its digestion stability[J].Food Science, 2021, 42(18):143-149.
[15] ZHANG X, ZHENG Y R, LIU Z M, et al.Insights into characteristic metabolites and potential bioactive peptides profiles of fresh cheese fermented with three novel probiotics based metabolomics and peptidomics[J].Food Chemistry:X, 2024, 21:101147.
[16] 郭星晨, 李玉豪, 马金璞, 等.基于氨基酸描述符对血管紧张素转化酶抑制五肽定量构效关系分析[J].食品科学, 2024, 45(13):38-48.GUO X C, LI Y H, MA J P, et al.Quantitative structure-activity relationship analysis of angiotensin-converting enzyme inhibitory pentapeptides based on amino acid descriptors[J].Food Science, 2024, 45(13):38-48.
[17] DING Q Z, SHEIKH A R, CHEN Q, et al.Understanding the mechanism for the structure-activity relationship of food-derived ACEI peptides[J].Food Reviews International, 2023, 39(4):1751-1769.
[18] 蒋彤, 徐慧, 贾丽娜.γ-氨基丁酸的生理功能及其在食品中的应用研究进展 [J].粮食与油脂, 2020, 33(4):23-25.JIANG T, XU H, JIA L N.Research progress on the physiological function of γ-aminobutyric acid and its application in food [J].Cereals&Oils, 2020, 33(4):23-25.
[19] HAO X Y, YANG W S, ZHU Q P, et al.Proteolysis and ACE-inhibitory peptide profile of Cheddar cheese:Effect of digestion treatment and different probiotics[J].LWT, 2021, 145:111295.
[20] MUSHTAQ M, GANI A, NOOR N, et al.Phenotypic and probiotic characterization of isolated LAB from Himalayan cheese (Kradi/Kalari) and effect of simulated gastrointestinal digestion on its bioactivity[J].LWT, 2021, 149:111669.
[21] FAN M Z, GUO T T, LI W R, et al.Isolation and identification of novel casein-derived bioactive peptides and potential functions in fermented casein with Lactobacillus helveticus[J].Food Science and Human Wellness, 2019, 8(2):156-176.
[22] WEI G Q, WANG D D, WANG T, et al.Insights into in vitro digestion properties and peptide profiling of Chinese rubing PDO cheese prepared using different acidification technology[J].Food Research International, 2022, 158:111564.
[23] BAPTISTA D P, SALGAÇO M K, SIVIERI K, et al.Use of static and dynamic in vitro models to simulate Prato cheese gastrointestinal digestion:Effect of Lactobacillus helveticus LH-B02 addition on peptides bioaccessibility[J].LWT, 2020, 134:110229.
[24] HERNNDEZ-LEDESMA B, DEL MAR CONTRERAS M, RECIO I.Antihypertensive peptides:Production, bioavailability and incorporation into foods[J].Advances in Colloid and Interface Science, 2011, 165(1):23-35.
[25] RADOSAVLJEVI
J, APOSTOLOVI D, MIHAILOVI J, et al.Digestomics of cow’s milk:Short digestion-resistant peptides of casein form functional complexes by aggregation[J].Foods, 2020, 9(11):1576.
[26] ARENA S, RENZONE G, SCALONI A.A multi-approach peptidomic analysis of hen egg white reveals novel putative bioactive molecules[J].Journal of Proteomics, 2020, 215:103646.
[27] CUI Q, SUN Y X, CHENG J J, et al.Effect of two-step enzymatic hydrolysis on the antioxidant properties and proteomics of hydrolysates of milk protein concentrate[J].Food Chemistry, 2022, 366:130711.
[28] ROBERT M C, RAZANAME A, MUTTER M, et al.Identification of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from sodium caseinate hydrolysates produced by Lactobacillus helveticus NCC 2765[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(23):6923-6931.
[29] WANG L Z, JIANG Z M, TIAN B, et al.Effects of galactose concentration on characteristics of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine casein in Maillard reaction[J].International Journal of Food Properties, 2016, 19(10):2238-2250.
[30] AMIGO L, MART
NEZ-MAQUEDA D, HERNNDEZ-LEDESMA B.In silico and in vitro analysis of multifunctionality of animal food-derived peptides[J].Foods, 2020, 9(8):991.
[31] MAENO M, YAMAMOTO N, TAKANO T.Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J].Journal of Dairy Science, 1996, 79(8):1316-1321.
[32] SOLEYMANZADEH N, MIRDAMADI S, MIRZAEI M, et al.Novel β-casein derived antioxidant and ACE-inhibitory active peptide from camel milk fermented by Leuconostoc lactis PTCC1899:Identification and molecular docking[J].International Dairy Journal, 2019, 97:201-208.
[33] HAO X Y, XIA Y, WANG Y X, et al.The addition of probiotic promotes the release of ACE-I peptide of Cheddar cheese:Peptide profile and molecular docking[J].International Dairy Journal, 2023, 137:105507.
[34] FAN Y, YU Z P, ZHAO W Z, et al.Identification and molecular mechanism of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides from Larimichthys crocea titin[J].Food Science and Human Wellness, 2020, 9(3):257-263.
[35] 周佳琪, 马春燕, 李晓晖.多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性[J].食品工业科技, 2022, 43(23):26-34.ZHOU J Q, MA C Y, LI X H.Design, synthesis and bioactivity of polypeptide ACE inhibitors[J].Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(23):26-34.
[36] SHI Y N, WEI G Q, HUANG A X.Simulated in vitro gastrointestinal digestion of traditional Chinese Rushan and Naizha cheese:Peptidome profiles and bioactivity elucidation[J].Food Research International, 2021, 142:110201.