红曲糟是福建红曲酒加工主要副产物,其干基约含有35%的蛋白质、20%的淀粉、10%的纤维素等[1]。酒厂一般按照普通的饲料进行低价出售,未充分发挥原料价值。红曲糟中蛋白主要为糯米源的谷蛋白及微生物源蛋白,蛋白质量高[2],以酒糟蛋白为原料开发优质可食用蛋白或者其他添加剂已成为学者们的研究热点。有学者使用碱法与酶法相结合的方法提取黄酒糟蛋白,并提高大米酒糟蛋白的感官特性和起泡性[3]。有学者采用不同蛋白酶对黄酒糟蛋白进行酶解,并研究了黄酒糟酶解物的添加形式和添加量对黄酒发酵的影响[4]。但采用酸、碱法水解存在水解程度难控制、易产生不良风味等缺陷;而用蛋白酶法水解虽具有水解程度容易控制、营养成分的保留较好等优点[5-6],但易生成苦味氨基酸,且生产成本较高。鲜有采用微生物法酵解酒糟蛋白开发调味食品的研究报道。
米曲霉是酱油生产的常用微生物,其丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系可分解原料中的多种成分,从而形成酱油独特的色、香、味、体[7]。米曲霉3.042是传统酱油等发酵调味品的生产菌株,广泛应用于豆粕生产发酵酱油[8]、制备豆瓣[9]、黄豆酱[10]等调味品。课题组前期采用米曲霉3.042发酵红曲糟制备调味液,但其发酵液酶解率及氨氮转化率较低[11]。由于不同原料源蛋白的结构特异性,因此很有必要针对红曲糟物性筛选适宜米曲霉以提高原料利用率[12]。本研究以MDQ2-1、MDQ2-2、MDQ2-3、MJY2-5共4株自主培育的米曲霉及ACCC 30467、AS3.863、CICC 2022、7801、3.042、RIB40共6株引进收集的米曲霉等作为供试菌株,以红曲糟培养料为基质,对各菌株成曲的谷氨酰胺酶等酶的产酶活性及酿造调味液的氨基酸态氮含量等指标进行对比分析,旨在筛选出原料利用率及氨氮转化率均较高的米曲霉菌株,为红曲糟调味液的研制提供优质菌种与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与菌株
红曲糟,古田蓝溪红酒业有限公司提供,经造粒、沸腾炉热风干制,粉碎过筛80目,备用,其含水量为11.13%,粗蛋白(干基)36.42 g/100 g,酸溶性蛋白2.06 g/100 g;麸皮,市售,含水量13.05%,粗蛋白17.39 g/100 g。米曲霉菌株来源如表1所示。
表1 米曲霉菌株保藏或提供单位
Table 1 Sources and preservation institutions of Aspergillus oryzae strains
序号米曲霉菌株保藏或提供单位1MDQ2-12MDQ2-23MDQ2-34MJY2-5实验室自分离保藏5ACCC 30467上海保藏生物技术中心6AS3.8637RIB40艾礼生物科技(上海)有限公司8CICC 2022中国工业微生物菌种保藏管理中心97801山东和众康源生物科技(山东)有限公司103.042上海酿造一厂(传统酱油商业菌)
1.2 仪器与设备
DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱、LRH-160型生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;SH220f型石墨消解仪、K9840型半自动凯氏定氮仪,海能未来技术集团股份有限公司;TGL16M型台式高速冷冻离心机,上海诺顶仪器设备有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;BS110S型电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SW-CJ-2FD型超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 培养基
红曲糟培养基,按麸皮、红曲糟与水为1.0∶1.2∶1.6的配比配制,121 ℃、20 min 灭菌,待用;麦芽汁琼脂培养基,海博生物技术有限公司,用于培养曲霉生长,121 ℃、20 min 灭菌,待用;孟加拉红培养基,海博生物技术有限公司,用于曲霉生长计数,121 ℃、20 min 灭菌,待用。
1.4 试验方法
1.4.1 米曲霉的活化及孢子液制备
将各米曲霉甘油管接种至孟加拉红培养基平板上,于30 ℃培养箱培养3 d。将孢子接入斜面麦芽汁琼脂培养基,于30 ℃培养箱培养3 d。用接种环将斜面孢子全部剥离,并用无菌水清洗,摇匀,获得孢子悬液,取样计数,4 ℃冷藏保存孢子液[13-14]。
1.4.2 制备成曲工艺
取适量红曲糟培养料,按照1.0×106 个/g的孢子接种量,分别接入1.4.1节中制备的各曲霉孢子悬液。将接种后的培养料置于温度30 ℃、相对湿度90%的环境下,进行72 h发酵培养,完成成曲制备[13-14]。检测成曲相关指标,每处理平行3次。
1.4.3 稀态发酵工艺
取一定量的1.4.2节制备好的成曲,按固液比1∶6的比例接入质量分数为12%食盐水,置于500 mL的锥形瓶中,在45 ℃下进行酶解发酵。发酵过程每天称重补水并检测可溶性固形物的变化,发酵10 d,在可溶性固形物不再显著变化时为发酵结束[13-14]。检测调味液氨基酸态氮含量、红曲糟蛋白酶解率等指标,每处理平行3次。
1.5 检测方法
1.5.1 成曲孢子数的测定
参考SANDHYA等[15]的方法。
1.5.2 成曲水分的测定
参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,采用直接干燥法。
1.5.3 谷氨酰胺酶活性的测定
参照孙启星等[16]文献,利用谷氨酰胺酶(Glutaminase)活性检测试剂盒采用可见分光光度法检测。谷氨酰胺酶活性单位(U/g)定义为每g成曲在37 ℃下每小时催化谷氨酰胺生成1 μmol NH3-N的量。
1.5.4 酸性、中性蛋白酶的测定
参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力的测定法》,采用福林酚法。酸性蛋白酶活性单位(U/g)定义为每 g成曲在40 ℃、pH 3.0条件下水解酪蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸的量。中性蛋白酶活性单位(U/g)定义为每g成曲在40 ℃、pH 7.2条件下水解酪蛋白每分钟产生1 μg酪氨酸的量。
1.5.5 糖化酶活性的测定
参考GB 1886.174—2024《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》,采用DNS法。糖化酶活性单位(U/g)定义为每g成曲在40 ℃、pH 4.6的条件下,1 h水解可溶性淀粉的产生1 mg葡萄糖的量。
1.5.6 纤维素酶活性的测定
参考NY/T 912—2020《饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法》,采用DNS法。纤维素酶活性单位(U/g)定义为每g成曲在37 ℃、pH 5.5的条件下,每分钟从质量浓度为7.5 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖的量。
1.5.7 粗蛋白及酶解率的测定
参照GB 5009.5—2025《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,采用自动凯氏定氮法。蛋白酶解率[13-14]计算如公式(1)所示:
(1)
式中:A0,酶解发酵初始时酸溶性蛋白,g/100 g;A1,酶解发酵终点时酸溶性蛋白,g/100 g;A2,酶解发酵终点时粗蛋白,g/100 g。
1.5.8 氨基酸态氮的测定
参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》,采用酸度计法。
1.5.9 氨氮转化率的测定[13-14]
氨氮转化率的测定如公式(2)所示:
(2)
式中:B0,酶解发酵初始时氨基酸态氮,g/100 g;B1,酶解发酵终点时氨基酸态氮,g/100 g;B2,酶解发酵终点时总氮,g/100 g。
1.5.10 感官评分
由12名接受过相关培训的食品专业师生组成感官评价小组,按照感官评分标准分别从色泽(10分)、典型性(20分)、滋味(40分)及香气(30分)4个方面对调味液的感官品质进行感官评分[13-14],总分为100分,具体评分标准如表2所示。
表2 发酵液感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation criteria for fermented liquids
色泽香气滋味典型性呈现出清亮带有光泽的红褐色(8～10)具有浓烈酱香味,味道舒适(25～30)鲜味感强,入口愉悦(33～40)具有红曲糟调味液典型性风格(16～20)颜色深褐或红色(4～7)酱香味香气一般(13～24)鲜味滋味感一般(16～32)典型性风格一般(9～15)黑褐色或淡红色(<4)无酱香味或糟味突出(<12)滋味感较差(<15)典型性不强(<8)
1.6 数据分析
采用R语言、DPS6.01软件进行数据分析处理,采用Origin、Excel等软件进行绘图制作。
2 结果与分析
2.1 不同曲霉成曲质量分析
由表3数据可知,从发芽率来看,各米曲霉菌株成曲发芽率均处于91.11%～97.51%,均超过90%,符合成曲制备的相关标准。其中,米曲霉MDQ2-2的发芽率最高,为97.51%;ACCC 30467和3.042的发芽率相对较低,均为91.11%。在孢子数对数值方面,不同菌株间存在一定差异,AS3.863和CICC 2022的孢子数对数值未达到成曲制备中孢子量1×109个/g(即孢子数对数值9 lg[c(个/g)])的标准,其余菌株均符合该标准要求。其中,米曲霉MJY2-5的孢子数对数值最高,与MDQ2-1、AS3.863、CICC 2022的孢子数对数值存在显著差异(P<0.05),但与MDQ2-2、MDQ2-3、ACCC 30467、RIB40、3.042、7801之间的差异未达显著水平(P>0.05)。各米曲霉菌株成曲的pH值保持在6.40～7.00,水分含量在24.28%～32.18%。
表3 不同米曲霉成曲质量分析
Table 3 Quality analysis of koji prepared with different A.oryzae strains
米曲霉发芽率/%孢子数对数值/(lg[c(个/g)])水分含量/%成曲 pH值MDQ2-194.139.29±0.16ABCbc28.306.55MDQ2-297.519.76±0.10Aab28.506.65MDQ2-393.129.93±0.21Aab27.236.47MJY2-593.2310.13±0.23Aa27.456.40ACCC 3046791.119.37±0.10Aab24.116.71AS3.86391.348.70±0.00BCcd28.346.73CICC 202292.258.60±0.17Cd32.186.90RIB4092.189.93±0.07Aab25.267.003.04291.119.93±0.13Aab26.316.47780195.349.51±0.05Aab24.286.87
注：不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01);不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
2.2 各米曲霉菌株成曲的谷氨酰胺酶活性
从图1可见,以红曲糟培养料为基料,各米曲霉菌株成曲产谷氨酰胺酶的能力有显著差异。MJY2-5产谷氨酰胺酶活性最高,可达(15.67±0.43)U/g,与其他菌株呈极显著差异(P<0.01);其次为RIB40,而7801和ACCC 30467产谷氨酰胺酶能力较低。
图1 各米曲霉菌株成曲的谷氨酰胺酶活性差异分析
Fig.1 Comparative analysis of glutaminase activity in koji prepared with different A.oryzae strains
注:不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01);不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 各米曲霉菌株成曲的酸性、中性蛋白酶活性
如图2所示,各米曲霉菌株成曲产蛋白酶活性存在显著差异。其中,米曲霉ACCC 30467的中性蛋白酶活性最高,达到了(2 831.56±22.89)U/g,与其他处理组的差异达到了极显著水平(P<0.01);MJY2-5、CICC 2022的中性蛋白酶活性较弱,分别为(1 250.90±12.05)、(1 119.25±41.68)U/g。米曲霉AS3.863的酸性蛋白酶活性最高,达(1 377.53±24.89)U/g,且与其他处理组的差异达到了极显著水平(P<0.01),RIB40、ACCC 30467和7801的酸性蛋白酶活性较低。
图2 各米曲霉菌株成曲的蛋白酶活性差异分析
Fig.2 Comparative analysis of protease activity in koji prepared with different A.oryzae strains
2.4 各米曲霉菌株成曲的糖化酶活性
如图3显示,各米曲霉菌株成曲的糖化酶产酶能力存在显著差异。米曲霉AS3.863的糖化酶活性最高,达到(2 273.41±6.31)U/g,与其他菌株相比差异极显著(P<0.01),而RIB40、CICC 2022的糖化酶活性最低。
图3 各米曲霉菌株成曲的糖化酶活性差异分析
Fig.3 Comparative analysis of glucoamylase activity in koji prepared with different A.oryzae strains
2.5 各米曲霉菌株成曲的纤维素酶活性
由图4可知,各米曲霉菌株成曲的纤维素酶活性存在显著差异。米曲霉7801、AS3.863、RIB40和3.042在产纤维素酶方面表现突出,其酶活性范围处于(127.84±2.08)～(133.60±1.22)U/g。这些高活力菌株与MDQ2-3、MDQ2-2、ACCC 30467、CICC 2022处理组相比,差异达到显著水平(P<0.05),而与其他处理组的差异更是达到极显著水平(P<0.01)。米曲霉MDQ2-1的纤维素酶活性较低,仅为(83.08±0.30)U/g。
图4 各米曲霉菌株成曲的纤维素酶活性差异分析
Fig.4 Comparative analysis of cellulase activity in koji prepared with different A.oryzae strains
2.6 各米曲霉菌株成曲的发酵调味液品质
如图5～图7的结果显示,各米曲霉菌株成曲经稀态发酵后,在调味液氨基酸态氮含量、红曲糟蛋白的酶解率及氨氮转化率方面均呈现显著差异。在氨基酸态氮含量上,米曲霉MJY2-5、AS3.863、RIB40表现突出,其发酵液氨基酸态氮含量分别为(0.27±0.02)、(0.25±0.01)、(0.25±0.01)g/100 g,显著高于MDQ2-2、MDQ2-3、ACCC 30467(P<0.05),与其他处理组相比差异更达到极显著水平(P<0.01)。红曲糟蛋白酶解率方面,米曲霉MJY2-5和RIB40位居前列,分别达到(79.68±0.15)%与(73.99±0.52)%,较其他处理组存在极显著差异(P<0.01),与米曲霉3.042相比,分别高出59.36%与47.98%。至于红曲糟蛋白的氨氮转化率,米曲霉MJY2-5以(51.33±0.83)%的数值最高,与AS3.863、RIB40存在显著差异(P<0.05),与其余处理组差异极显著(P<0.01),较商用酱油米曲霉3.042高出53.56%。
图5 各米曲霉菌株成曲的氨基酸态氮含量差异
Fig.5 Variation in amino acid nitrogen content among koji prepared with different A.oryzae strains
图6 各米曲霉菌株成曲的蛋白酶解能力差异分析
Fig.6 Differential protein hydrolysis capacity of koji prepared with different A.oryzae strains
图7 各米曲霉菌株成曲的氨氮转化能力差异分析
Fig.7 Differential amino nitrogen conversion capacity of koji prepared with different A.oryzae strains
2.7 各米曲霉菌株成曲的发酵调味液感官评价
如图8所示,不同米曲霉成曲经低盐稀态发酵后,所得发酵液的感官品质存在显著差异。米曲霉MJY2-5的综合感官评分最高,达91.68分,其发酵液呈现出红曲糟调味液的典型风格,具体表现为红褐色色泽,酱香浓,味道鲜美。该菌株与RIB40、ACCC 30467及3.042相比,感官评分差异不显著(P>0.05),与MDQ2-1、MDQ2-2、MDQ2-3及7801的差异达显著水平(P<0.05),与AS3.863、CICC 2022之间的差异则达极显著水平(P<0.01)。
图8 调味液基料的感官评定得分差异分析
Fig.8 Comparative analysis of sensory evaluation scores of seasoning liquid bases
2.8 各米曲霉菌株成曲的蛋白酶解率、氨氮转化率与各酶活性间的相关性分析
采用Spearman相关性分析法,通过R语言软件对蛋白酶解率、氨氮转化率与各酶活性间的相关性分析,结果见图9。各米曲霉成曲的蛋白酶解率、氨氮转化率均与其产谷氨酰胺酶、糖化酶活性、酸性蛋白酶和纤维素酶活性呈正相关,与中性蛋白酶均呈负相关,而只有谷氨酰胺酶、糖化酶活性存在强相关性且具有统计学意义(P<0.05,|r|>0.5)。试验结果表明,在成曲酸性蛋白酶活性>700 U/g、中性蛋白酶活性>1 000 U/g时,谷氨酰胺酶、糖化酶活性是米曲霉蛋白利用和氨氮转化的关键因子;红曲糟调味液酿造的优良曲霉菌株为米曲霉MJY2-5,该菌株所产成曲中,谷氨酰胺酶和糖化酶活性分别为15.67 U/g和1 800.20 U/g;酿造的调味液基料蛋白酶解率为79.68%,氨氮转化率为51.33%。
图9 蛋白酶解率、氨氮转化率与各酶活性相关性分析图
Fig.9 Correlation analysis between protein hydrolysis rate, amino nitrogen conversion rate and enzyme activities
3 讨论
米曲霉含有中性蛋白酶、酸性蛋白酶、谷氨酰胺酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶等丰富的酶系[17],是酱油等调味液发酵加工的主要酿造菌株[18]。不同米曲霉的酶系组成不同,因此产酶特性与原料利用程度也不同[19]。调味料鲜味成分主要来源于蛋白质经微生物酶解之后形成的氨基酸、多肽类物质,而呈鲜味的氨基酸主要是谷氨酸[20]。谷氨酸在谷蛋白中以谷氨酰胺的形式存在,谷氨酰胺不具有鲜味,但其可在谷氨酰胺酶的作用下转化为谷氨酸[21]。一直以来,米曲霉的蛋白酶作用普遍被认为是发酵酱油等调味料的关键酶[22]。本文研究结果发现,当成曲酸性蛋白酶活性>700 U/g、中性蛋白酶活性>1 000 U/g时,米曲霉产蛋白酶活性的高低对红曲糟蛋白酶解率及氨氮转化率无显著影响,而其产谷氨酰胺酶活性对发酵液氨基酸态氮含量、红曲糟蛋白酶解率及氨氮转化率有重要的作用。酒糟蛋白的水解过程是一个多酶协同作用的复杂体系,存在蛋白酶解和氨基酸转化2个阶段。在蛋白酶解阶段,酸性蛋白酶和中性蛋白酶等内切酶首先作用于酒糟蛋白,将其切割成多肽片段。当内切酶活性达到饱和时,进一步增加其用量并不能显著提升多肽的生成效率。在后续的氨基酸转化阶段,谷氨酰胺酶等外切酶发挥关键作用。这些酶能够从多肽链的末端逐步水解,释放出游离氨基酸。值得注意的是,随着外切酶活性的提高,多肽向氨基酸的转化效率显著提升。这一过程不仅解决了产物抑制问题,还间接促进了蛋白向多肽的转化能力。因此,当谷氨酰胺酶活性较高时,谷氨酰胺会尽可能多的转化成谷氨酸,提高酱油氨基酸态氮含量,并提高原料蛋白的利用率[23]。
针对不同底物,米曲霉发酵利用率也存在差异[24]。红曲糟干基含有35%左右的蛋白质、20%左右的淀粉[1]。与传统酱油生产原料大豆相比,红曲糟含有较多的谷蛋白、淀粉[11]。因此,基于红曲糟这样谷蛋白、淀粉含量较高的基料,应选择谷氨酰胺酶、糖化酶水平较高的米曲霉菌株。高产谷氨酰胺酶的米曲霉可有效促进红曲糟谷蛋白向谷氨酸的转化,从而提高蛋白酶解率及氨氮转化率[25];而产糖化酶水平较高的米曲霉能够更好地水解酒糟淀粉,不仅可以释放出被淀粉包裹的蛋白及氨基酸[26],提高酶解率及氨氮转化率,还可以提高发酵液中的糖分,有利于发酵液美拉德反应,从而提高红曲糟原料利用率及感官风味[27]。
4 结论
基于红曲糟培养料制备调味液的优良米曲霉菌株应为米曲霉MJY2-5,其成曲产孢子量为10.13 lg[c(个/g)],产酸性蛋白酶、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶、糖化酶及纤维素酶的活力分别为782.07、1 250.90、15.67、1 800.20、91.79 U/g。利用其成曲发酵得到的红曲糟调味液具有红褐色泽、浓郁酱香、鲜美滋味及红曲糟调味液典型性风格,蛋白酶解率和氨氮转化率分别达79.68%、51.33%,比米曲霉3.042提高59.36%与53.56%。
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