麻竹笋是一种理想的绿色健康蔬菜，但因其属于生长旺盛的芽，采后如贮藏不当会导致其品质快速劣化[1]。目前麻竹笋的采后贮藏保鲜主要有物理和化学两种手段。低温贮藏是麻竹笋保鲜贮藏最常用的方法，能有效抑制麻竹笋中酶的活性，延长竹笋保鲜时间，降低竹笋老化速度[2]，但低温贮藏也只能将竹笋的保质期限延长至10～15 d左右，当贮藏时间继续延长后，竹笋品质仍然会出现快速劣变。气调贮藏也是一种重要的物理贮藏方式，虽然竹笋经气调包装可降低其褐变程度，减少水分散失[3-4]，但是麻竹笋对不同的气调处理反应不同，容易引起竹笋的气体伤害。麻竹笋的化学贮藏手段主要依托于化学保鲜剂和激素[5-10]，但化学保鲜剂和激素通常具有一定的毒性，消费者对其接受性较差[11]。因此，无毒健康的天然保鲜剂越来越受到研究人员的关注。
天然保鲜剂具有广谱、高效、无毒等特点，广泛使用在果蔬贮藏保鲜中，主要包括具有抗菌作用的天然植物提取物和微生物代谢产物，如壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、纳他霉素及乳酸链球菌素等[12]。研究表明，使用天然保鲜剂处理莲藕[13]、番茄[14]、葡萄[15]等果蔬后，在贮藏期间其失水率、氧化酶活性及腐烂率均显著下降，保质期限延长。天然保鲜剂除单独使用外，还可进行复配，而天然保鲜剂的复配使用往往具有增效作用，保鲜效果更好，同时还可降低贮藏成本。研究表明，使用复合天然保鲜剂处理双孢蘑菇[16]、板栗[17]等果蔬后，都具有较好的贮藏保鲜效果。
采用天然保鲜剂对竹笋进行保鲜处理不仅能够减少贮藏期间竹笋的失重率和木质化，使其保持良好的感官和营养品质，同时还能延长竹笋的贮藏期限，但目前的研究大多集中在单一保鲜剂的应用上[18]，而利用天然复合保鲜剂对竹笋进行贮藏保鲜的研究还鲜有报道。因此，本实验将通过筛选和复配得到一种天然复合保鲜剂，然后将麻竹笋用复配保鲜剂处理后观察其贮藏过程中的品质变化，从而探究天然复合保鲜剂对麻竹笋贮藏保鲜的影响，以期为天然复合保鲜剂在果蔬贮藏中的应用提供实验支撑。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
新鲜麻竹笋，购于重庆市北碚区天生菜市场。
壳聚糖(脱乙酰度：95.54%，相对分子质量：300 kDa，食品级)，河南通宇食品添加剂有限公司；魔芋葡甘聚糖(食品级)，湖北科玛协力魔芋实业发展有限公司；乳酸链球菌素(食品级)，洛阳奇泓生物科技有限公司；茶多酚(食品级)，真滋味食品有限公司；纳他霉素(食品级)，河南思远生物科技有限公司；乳酸钠(食品级)，上海梦荷生物科技有限公司；海藻酸钠(食品级)，河南思远生物科技有限公司；亚硫酸钠；苯甲酸钠；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；巯基乙醇(PEG)；愈创木酚；三氯乙酸；硫代巴比妥酸；2,6-二氯靛酚，草酸(试剂均为分析纯)，成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
752型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器厂；UV-2450型可见光分光光度计，日本岛津；5810高速离心机，德国Eppendorf公司；BC/BD-272SE电冰箱，青岛海尔特种冰箱有限公司；FA2004A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；101-3-5型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；TA-XT2i质构仪，英国SMS公司。
1.3 方法
1.3.1 天然保鲜剂的筛选
对壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、乳酸链球菌素(Nisin)、茶多酚、纳他霉素、乳酸钠、抗坏血酸和海藻酸钠8种天然保鲜剂进行筛选。挑选无机械损伤、无病虫害、大小均匀的带壳竹笋，用清水冲洗晾干。根据前期预实验结果，将竹笋分别在质量分数0.05%～2%的不同天然保鲜剂的水溶液中浸泡3 min，未处理样品为空白对照组。每3支竹笋为1组，置于4 ℃、相对湿度90%的环境下贮藏。以贮藏10 d后竹笋的硬度和木质素含量为评定指标，选择3种天然保鲜剂进行复配。
1.3.2 天然复合保鲜剂的复配
以竹笋为试验对象，选用不同质量分数的壳聚糖、纳他霉素、茶多酚(体积比为1∶1∶1)为天然保鲜剂组分，采用3因素3水平L9(34)进行正交试验(表1)。以4 ℃、相对湿度90%条件下贮藏7 d后硬度和木质素含量作为评定指标。根据分析结果得到复合保鲜剂的最佳配比。
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Design of orthogonal experiment
1.3.3 麻竹笋的保鲜处理
将竹笋分别在15 g/L壳聚糖和复合保鲜剂水溶液(体积比为1∶1∶1的1.5%壳聚糖+0.05%纳他霉素+1.5%茶多酚)各3 L中浸泡3 min，单独用1.5%壳聚糖处理样品为实验对照组，未处理样品为空白对照组。每36支竹笋为1组，置于4 ℃、相对湿度90%的环境下贮藏。贮藏时间40 d为限，每3 d测定1次相关指标。
1.3.4 测定项目
1.3.4.1 呼吸强度的测定
参考张彩珍[19]的方法。呼吸强度以每千克竹笋每小时释放CO2的质量来表示，CO2·mg/(h·kg)。
呼吸强度
(1)
式中：V1 为空白滴定所用草酸体积，mL；V2为样品滴定所用草酸质量，mL；c表示草酸溶液的浓度，mol/L；m表示竹笋质量, kg；t表示时间, h；22表示测定中NaOH与CO2的质量转换数。
1.3.4.2 硬度的测定
参考杨月[20]的方法并有所改动，采用TPA测定模式，测定条件为：探头直径为5 mm；测前速度1.00 mm/s；测试速率1.00 mm/s；返回速度1.00 mm/s；触发力20.0g；测试距离为3 mm。每组样品测定5次，取平均值，硬度单位为N。
1.3.4.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定
参考杨乐[21]的方法，并按方程(2)对PAL酶活性进行计算，以每小时每克果蔬组织酶促反应体系吸光度值增加0.01为1个PAL活性单位，表示为0.01ΔOD290/(h·gmF)。
PAL活性
(2)
式中：OD1，样品管的吸光值；OD0，对照管的吸光值；V，样品提取液总体积，mL；VS，测定时所用样品提取液体积，mL；t，酶促反应时间，h；m，样品质量，g。
1.3.4.4 过氧化物酶(POD)活性的测定
参考杨乐[21]的方法，按照方程(3)对POD酶活性进行计算，以每克果蔬组织每分钟吸光度值增加1时为1个过氧化物酶活性单位，表示为ΔOD470/(min·g)。
POD活性
(3)
式中：ΔOD470，每分钟反应吸光度变化值；ΔOD470I反应混合液吸光度终止值；ΔOD4701，反应混合液吸光度初始值；tF，反应终止时间，min;t1，反应初始时间，min;V,样品提取液总体积，mL;VS，测定时所取样品提取液体积，mL;m，样品质量，g。
1.3.4.5 木质素含量的测定
参考申德省[22]的方法进行测定，木质素含量按照方程(4)进行计算。
木质素含量
(4)
式中：M1，样品质量，g；M2，坩埚质量，g；M3，烘干后样品与坩埚的质量，g。
1.3.4.6 VC含量的测定
称取5 g竹笋，放入研钵中加入2%草酸溶液10 mL，研磨匀浆后，转入100 mL容量瓶中，冲洗研钵并将洗液一并转入，最后用2%草酸定容。取滤液10 mL于三角瓶中，用已标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色，并在30 s内不褪色为止，重复3次，以2%草酸作空白，VC含量按公式(5)计算。
(5)
式中：W，100 g样品中Vc质量，mg；V，滴定样品时消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积，mL；V0，滴定空白时消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积，mL；A，1 mL 2,6-二氯靛酚溶液溶液相当于抗坏血酸标准溶液的质量，mg；M，样品质量，g；T1，样品溶液定容后的总体积，mL；T2，滴定时吸取样品溶液的体积，mL。
1.3.4.7 感官评分
参考蒋益红[23]的方法并有所改动，将麻竹笋的感官品质分为4个等级(如表2所示)。经调查初选和测试筛选，考试与再培训后选出30人(15男，15女)组成感官评价小组。将进行测试的麻竹笋进行编号，每人独立对麻竹笋评分后取平均值，感官评分总分值在9分(极新鲜)到0分(完全腐败)之间。
表2 感官评分标准
Table 2 Evaluation criteria of sensory
1.4 数据处理
所有实验均重复3次，每次测试均需更换样品。文中所有图表均使用Origin 9.0和Microsoft Excel进行绘制，利用SPSS 19.0对数据进行分析，并利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析。
2 结果与分析
2.1 天然保鲜剂的筛选
竹笋采收后在贮藏过程中，极易发生木质化，从而影响竹笋的品质，其硬度及木质素含量的变化是竹笋木质化的直观表现，保鲜剂对硬度及木质素的影响直接决定了竹笋的贮藏品质和贮藏期。用8种不同天然保鲜剂对麻竹笋进行处理后，观察4 ℃贮藏10 d后竹笋的硬度和木质素含量，结果如表3所示。
表3 天然保鲜剂的筛选结果
Table 3 Screening results of natural preservatives
纳他霉素对硬度升高的抑制效果最好，其次是抗坏血酸，壳聚糖、茶多酚也能抑制竹笋硬度升高；纳他霉素抑制竹笋木质化的效果也最佳，茶多酚和壳聚糖也能较好抑制竹笋木质素的积累，而抗坏血酸和乳酸钠抑制木质化的效果欠佳。因此，综合硬度和木质素的变化情况，选择纳他霉素、壳聚糖、茶多酚这3种天然保鲜剂进行复配。
2.2 天然复合保鲜剂的复配
将纳他霉素、壳聚糖、茶多酚进行复配，得到一种天然复合保鲜剂。从硬度的变化情况对天然复合保鲜剂的正交试验结果进行分析，如表4所示。从表4中的极差R可以得出RA>RB>RC>RD，所以对麻竹笋硬度升高的抑制效果大小顺序为：A、B、C，经方差分析，A因素(壳聚糖浓度)和B因素(纳他霉素浓度)的F值显著，说明壳聚糖和纳他霉素对麻竹笋硬度有显著的影响。
表4 正交试验结果-硬度分析
Table 4 Results of orthogonal experiment-Hardnessanalysis
从木质素的变化情况对天然复合保鲜剂的正交试验结果进行分析，如表5所示。
表5 正交试验结果-木质素分析
Table 5 Results of orthogonal experiment-Lignin analysis
从表5中的极差R可以得出RC>RA>RB>RD，所以对竹笋木质化抑制效果的大小顺序为：C、A、B，经方差分析，A因素(壳聚糖浓度)和C因素(茶多酚浓度)的F值显著，说明壳聚糖和茶多酚对竹笋的木质素含量有显著的影响。综合正交实验结果，并结合实际生产考虑，选择A2B2C3组合，即1.5%壳聚糖+0.05%纳他霉素+1.5%茶多酚为天然复合保鲜剂。
2.3 天然复合保鲜剂对麻竹笋贮藏品质的影响
2.3.1 对麻竹笋贮藏期间呼吸强度的影响
呼吸作用是果蔬采收后的重要生命活动，可以反映其生命活动的变化情况，其强弱与果蔬的耐贮藏性密切相关[24]。天然复合保鲜剂对麻竹笋呼吸强度的影响如图1所示。刚采收后的麻竹笋呼吸作用加强，呼吸强度较高，随后在贮藏初期因温度降低而下降，在贮藏10 d左右，对照组样品的呼吸强度又上升，而1.5%壳聚糖和天然复合保鲜剂处理组的呼吸强度在贮藏期间逐渐降低，后期基本保持稳定。天然复合保鲜剂组的呼吸强度在整个贮藏期间都低于其他组。在贮藏中后期，各处理组间存在显著差异(p<0.05)。可以看出，单独使用壳聚糖也具有良好的抑制呼吸作用的效果，因为涂膜处理阻隔了O2、CO2。而经复配后，各天然保鲜剂之间产生了一定的增效作用。
图1 天然复合保鲜剂对麻竹笋呼吸强度的影响
Fig.1 Effects of natural compound preservative on respiration intensity of bamboo shoots
2.3.2 对麻竹笋贮藏期间PAL和POD活性的影响
竹笋采收后易发生纤维木质化，其中PAL起着关键作用，PAL催化苯丙氨酸脱氢基形成肉桂酸，由肉桂酸在一系列酶促反应条件下最后形成了木质素前体物质。其中PAL是限速酶，其活性变化反映了竹笋木质化的速率。天然复合保鲜剂处理对麻竹笋PAL活性的影响如图2所示，对照组麻竹笋的PAL活性持续升高，在第18天达到最大值，而处理组呈先上升后缓慢下降的趋势，1.5%壳聚糖处理组和天然复合保鲜剂处理组在第27天左右达到峰值。在整个贮藏期间，各处理组间的PAL活性存在显著差异(p<0.05)，且天然复合保鲜剂处理组的麻竹笋PAL活性在贮藏期间一直低于1.5%壳聚糖处理组，因此，天然复合保鲜剂对PAL活性具有较好的抑制作用。
图2 天然复合保鲜剂对麻竹笋PAL活性的影响
Fig.2 Effects of natural compound preservative on the PAL activity of bamboo shoots
POD在竹笋老化中也起到重要作用，木质素前体物质在POD作用下脱氢聚合，形成聚合物木质素，导致组织老化[25]。因此，贮藏期间POD的活性变化也可以反映竹笋老化的速度。天然复合保鲜剂处理组对麻竹笋POD活性的影响如图3所示。
图3 天然复合保鲜剂对麻竹笋POD活性的影响
Fig.3 Effects of natural compound preservative on the POD activity of bamboo shoots
麻竹笋在贮藏期间的POD活性也呈先上升后缓慢下降得趋势。在0～12 d内，对照组POD活性呈现较快的增长趋势，在第12天达到峰值，而1.5%壳聚糖处理组POD活性在初期的增长速率减慢，且达到最大值的时间延长。天然复合保鲜剂组的麻竹笋在0～12 d内，POD的增长速度最慢，且在第6～9天和第12～15天保持相对稳定。天然复合保鲜剂组和1.5%壳聚糖处理组几乎都在21 d左右达到POD活性的峰值，此后POD活性呈现下降趋势。POD存在的作用可能具有双重性，一种为在逆境或衰老初期表现为保护作用，另一种则是在衰老后期表达[26]，因此，在麻竹笋贮藏初期，为抵抗低温环境POD活性均表现出升高趋势。而在贮藏后期，麻竹笋开始衰老，对照组POD活性较高，而经过保鲜剂处理的麻竹笋，POD活性则受到抑制。各处理组间存在显著差异(p<0.05)，且天然复合保鲜剂处理组的麻竹笋POD活性在贮藏期间一直低于1.5%壳聚糖处理组。因此，天然复合保鲜剂可以有效抑制POD活性，延缓麻竹笋的老化进程。
2.3.3 对麻竹笋贮藏期间木质素含量和硬度的影响
植物木质化是木质素在细胞壁积累的结果，而竹笋采收后木质化加快，木质素的含量是竹笋木质化的直接表现，木质素含量高低直接影响到竹笋的营养品质及食用口感。天然复合保鲜剂对麻竹笋木质素含量的影响如图4所示。随着贮藏时间延长，麻竹笋的木质素含量也随之增加，其中对照组增加最快，天然复合保鲜剂处理组增加最慢，各处理组间存在显著差异(p<0.05)。木质素的变化趋势与PAL变化趋势几乎保持一致，PAL是木质素生物合成过程中的关键酶，随着PAL含量的升高，木质素含量也不断增加，而经过保鲜处理后，麻竹笋的PAL活性受到抑制，使木质素的合成缺少前体物质[27]，POD可在木质素合成的最后一步中通过分解H2O2促成木质素单体聚合形成木质素，保鲜处理降低了POD活性，聚合反应程度下降[28]，因而木质素含量与空白对照组相比有所下降。而单独使用壳聚糖也具有良好的抑制木质化效果，但经复配后，各天然保鲜剂之间具有一定的增效作用，具有更佳的抑制木质化效果。
图4 天然复合保鲜剂对麻竹笋木质素含量的影响
Fig.4 Effects of natural compound preservative on lignin contents of bamboo shoots
果蔬的口感与其硬度密切相关，硬度常被作为评价果蔬品质的重要指标。麻竹笋在贮藏过程中，会因为呼吸作用和机械损伤而导致硬度上升，使竹笋丧失商品价值，同时，硬度的增加又与木质素含量的增加息息相关。因此，硬度的变化可以评价不同处理对竹笋的保鲜效果。天然复合保鲜剂对麻竹笋硬度的影响如图5所示。在贮藏前期，麻竹笋硬度迅速上升，对照组在第15天左右硬度达到最大值，1.5%壳聚糖处理组在第21天左右达到最大值，而天然复合保鲜剂处理组在第27天左右达到最大值，随后硬度开始下降。1.5%壳聚糖和天然复合保鲜剂处理组可以延迟麻竹笋硬度的升高，同时还可以降低硬度的峰值，且天然复合保鲜剂处理效果比单独使用壳聚糖的效果更好，说明天然复合保鲜剂可以在一定程度上抑制麻竹笋硬度的升高。这一结果与罗晓莉[29]研究的竹笋采后硬度变化的结果一致。
图5 天然复合保鲜剂对麻竹笋硬度的影响
Fig.5 Effect of natural compound preservative on hardness of bamboo shoots
2.3.4 对麻竹笋贮藏期间VC含量的影响
VC是一种水溶性维生素，具有较强的还原性，易被氧化。果蔬中VC含量在成熟阶段增加，在贮藏阶段易被消耗氧化分解，因此VC含量是衡量竹笋营养价值的重要指标，也是衡量贮藏保鲜效果的关键因素。天然复合保鲜剂对麻竹笋中VC含量的影响如图6所示。
图6 天然复合保鲜剂对麻竹笋Vc含量的影响
Fig.6 Effects of natural compound preservative on Vc contents of bamboo shoots
在贮藏期间，麻竹笋的VC含量均呈下降趋势，前期下降得较快，贮藏后期下降得较慢。贮藏末期，对照组VC含量下降了42.56%、1.5%壳聚糖处理组下降了39.26%、天然复合保鲜剂处理组下降了29.91%。各处理组间存在显著差异(p<0.05)，说明天然复合保鲜剂比单独壳聚糖涂膜处理更能延缓VC的降解，延长保鲜期。麻竹笋在贮藏期间中存在衰老的过程，而在此过程中机体会产生大量的活性氧，在不经过保鲜处理的情况下，麻竹笋在贮藏前期木质素大量形成，同时伴随H2O2的增加，因而活性氧含量升高导致VC被氧化，保鲜处理降低了贮藏过程中活性氧的含量，使得VC的氧化程度降低。
2.3.5 对麻竹笋贮藏期间感官品质的影响
竹笋在贮藏过程中，可能发生褐变、腐败、变质、木质化等品质劣变，从而影响其感官品质。不同处理对麻竹笋的感官品质的影响如图7所示，随着贮藏时间的延长，各处理组麻竹笋的感官评分逐渐降低，表明随着贮藏时间的延长，麻竹笋的气味、色泽及可食用性逐渐恶化。经天然复合保鲜剂处理后的麻竹笋在整个贮藏期间，虽然品质也呈下降的趋势，但与对照组相比，天然复合保鲜剂能在较大程度上使麻竹笋保持较好的感官品质。在贮藏第6天时，空白组麻竹笋感官品质降低程度几乎为天然复合保鲜剂处理组的2倍，当贮藏6 d后，对照组麻竹笋的感官品质迅速下降。麻竹笋经1.5%壳聚糖和天然复合保鲜剂处理后，在整个贮藏期间，品质变化较为平缓，天然复合保鲜剂处理后的麻竹笋感官评分值始终高于6分，在贮藏末期仍具有良好的气味、色泽和可食用性。麻竹笋经1.5%壳聚糖处理后，在贮藏前12 d品质保持较好，与天然复合保鲜剂组的品质接近，当贮藏时间超过18 d后，该处理组的麻竹笋品质下降较天然复合保鲜剂组更为剧烈，在贮藏到24 d后，1.5%壳聚糖处理组与天然复合保鲜剂组的感官品质表现出显著性差异(p<0.05)，表明天然复合保鲜剂与单一天然保鲜剂相比具有更好的保鲜效果，能够最大程度保持麻竹笋的商品价值。
图7 天然复合保鲜剂对麻竹笋感官品质的影响
Fig.7 Effects of natural compound preservative on sensory quality of bamboo shoots
3 结论
对8种天然保鲜剂筛选后进行复配，得到体积比为1∶1∶1的1.5%壳聚糖+0.05%纳他霉素+1.5%茶多酚作为一种天然复合保鲜剂。采用天然复合保鲜剂对麻竹笋进行保鲜处理后，可将麻竹笋的贮藏期限延长至36 d。在贮藏期间，天然复合保鲜剂可有效降低麻竹笋的呼吸强度，并使麻竹笋的PAL和POD酶活性显著降低，延迟酶活性峰值出现的时间，延缓麻竹笋在贮藏过程中的木质化程度，抑制麻竹笋硬度的升高，保持麻竹笋的食用品质。同时，天然复合保鲜剂能有效减慢麻竹笋中Vc的降解，在最大程度上保留麻竹笋的营养和感官品质，较好地保持麻竹笋的商品价值。
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