热凝胶(curdlan)又称凝胶多糖、可德兰胶、可得然胶等，是一种由微生物产生的胞外多糖，分子内以β-1,3-糖苷键连接而成，具有加热成胶的独特特性[1-2]，本研究采用最为贴切的热凝胶为名。热凝胶分子通常以右手三螺旋结构存在，具有热成胶性、抗脱水性及抗冻融性等特点[3]。1996年，热凝胶多糖获美国FDA批准成为一种食品添加剂[4]，现在，热凝胶多糖已广泛应用于食品工业，主要作为凝胶剂、结构改性剂、持水剂、黏合剂、增稠剂等用于果冻、肉产品、低热量食品等的制作[5-6]。WEST和SALAH等[7-10]研究了以不同原料为底物发酵生产热凝胶。本实验室对热凝胶发酵和提取工艺做了深入的研究[11-12]，分析了热凝胶合成的机理，对生产热凝胶的菌株进行了育种和筛选[13-16]。

在热凝胶提取过程中，发酵液中菌体和热凝胶都是水不溶性物质[17]，相互黏附，密度差小，粒径微小，属固-固分离，分离难度大。热凝胶可溶解在二甲亚砜[18]和NaOH溶液[19]等碱性溶剂中，提取过程中一般先将热凝胶溶于碱溶液中形成溶胶，使固-固分离转变成固-液分离，降低分离难度。碱溶后的热凝胶形成高黏度的溶胶，通过压滤等手段将胶液中的菌体分离去除，因此溶胶体系黏度的大小等流变性质是影响分离难易度的重要因素。与此同时，碱对热凝胶产品品质有损伤作用[17]，同时强碱对菌体有裂解作用，释放出杂质，因此碱溶处理方式影响产品的纯度和质量；若溶解不彻底，除菌时易堵塞过滤设备，影响分离效率。因此需要对碱溶过程中热凝胶的流变学、碱溶过程对热凝胶产品质构学的影响等开展研究。本研究主要集中于分析热凝胶溶解于碱液过程中的颗粒形态、流变学及质构学性质，探寻在不同处理方式下适用于工业提取热凝胶的方法，为热凝胶工业化提取提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

热凝胶发酵产物，实验室通风发酵所得[20]；食品级热凝胶，购自日本麒麟公司；NaOH、HCl：分析纯，上海国药集团。

1.2 仪器与设备

Haake Mars Ⅲ流变仪，美国赛默飞世尔科技；MD-NJ-5凝胶强度测定仪，临安丰源电子有限公司；TA.XT Plus质构仪，英国SMS公司；离心机，德国Sigma公司；组合式摇床，上海国强生化有限公司；HHS恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 热凝胶的处理方法

热凝胶一部分来源于实验室通风发酵所得，为发酵原液，含有土壤杆菌菌体，用于观察热凝胶溶解状态；另一部分热凝胶购自日本麒麟公司，是提取过后的食品级产品。取5 g食品级热凝胶置于500 mL锥形瓶，加入50 mL去离子水充分混匀，称取配制成实验要求碱浓度(0.2～1.0 mol/L)所需的NaOH，溶于200 mL去离子水中，待冷却后加入锥形瓶中。按照下文所述单因素实验设计条件将锥形瓶置于回旋式摇床振荡溶解，溶解后取溶胶在流变仪中进行流变学分析，剩余溶胶滴加0.5 mol/L HCl溶液搅拌中和，使pH达到7.0，热凝胶析出，8 000 r/min、10 min离心洗涤3次，收集离心物得到热凝胶湿胶，用于后续质构分析。

1.3.2 单因素试验设计

1.3.2.1 溶解时间

以实验室发酵产物为原料，取50 mL含有土壤杆菌的发酵液，8 000 r/min离心10 min得到沉淀物，将沉淀物振荡(200 r/min，30 ℃)溶解于50 mL浓度为0.25 mol/L的碱溶液中，每隔30 min取样，滴加数滴质量分数为1%的苯胺蓝和质量分数为1%中性红混合染色液，混匀染色3 min，通过光学显微镜观察热凝胶是否充分溶解。

1.3.2.2 碱处理时间

以市售热凝胶为原料，按1.1方法将热凝胶与NaOH溶液混合，配制成热凝胶质量分数为2%、NaOH终浓度为0.5 mol/L的体系，于30 ℃、200 r/min条件下分别回旋振荡0.5、1、2、4、6 h，取溶胶进行稳态流变学分析，提取所得热凝胶进行质构分析。

1.3.2.3 碱溶温度

以市售热凝胶为原料，按1.1方法将热凝胶与NaOH溶液混合，配制成热凝胶质量分数为2%、NaOH终浓度为0.5 mol/L的体系，置于恒温水浴锅中200 r/min回旋振荡2 h，水浴温度分别设置为15、20、25、30、35、40 ℃。对样品进行稳态流变学和质构分析。

1.3.2.4 碱浓度

以市售热凝胶为原料，将热凝胶与NaOH溶液混合，配制成热凝胶质量分数为2%，NaOH终浓度分别为0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.7、1 mol/L的体系，于30 ℃、200 r/min条件下回旋振荡2 h，取溶胶进行进行流变学分析，提取所得热凝胶进行质构分析。

1.3.3 热凝胶质构分析

1.3.3.1 凝胶强度测定与分析

取5 g热凝胶湿胶放在烘干并精确称重后的锡箔纸上，105 ℃烘至恒重后称量，计算湿胶与干胶重量比，分析其含水率。取15 g热凝胶湿胶，根据其含水率补充或高速离心去除部分水使其热凝胶质量分数为2%，按照国家标准GB 28304—2012[21]所述方法测定热凝胶的凝胶强度。采用MD-NJ-5凝胶强度测定仪分析凝胶强度，探头为圆柱形探头，平端面积1 cm2。样品截面积大于探头面积，穿刺模式，测试前速度1 mm/s，测试时速度为1 mm/s，测试后速度为1 mm/s，得到破裂曲线，根据负荷-时间曲线计算凝胶强度，凝胶强度按公式(1)计算：

W=F/A

(1)

式中：W，凝胶强度，g/cm2；F，凝胶破裂时曲线急剧下降拐点的力，g；A,探头末端平面面积，cm2。

1.3.3.2 凝胶样品全质构分析(texture profile analysis, TPA)

采用TA.XT plus质构分析仪的压缩模式测定热凝胶的机械性能。探头型号为P/0.5R，测试前速度1 mm/s，测试时速度为1 mm/s，测试后速度为1 mm/s，目标模式为应变，压缩形变量为50%，测试时间5 s，触发力为10 g，得到全质构曲线。实验质构分析参数[22-23]有：(1)硬度，第一次压缩循环的最大值。(2)黏性：模拟用以克服探头与样品表面间吸引力所必需的工作，是第一次循环测试曲线在横坐标下方的面积。(3)内聚性：模拟样品内部粘合力，样品经压缩变形后对再次压缩的相对抵抗力，内聚性=第二次压缩面积/第一次压缩面积。(4)弹性：变形样品去除变形力后恢复至原高度或体积的比率。(5)咀嚼性：模拟将固体样品咀嚼成可吞咽状态所需的能量，咀嚼性=硬度×内聚性×弹性。(6)回复性：变形样品在导致变形相同的速度、压力作用下的回复程度，回复性=回复面积/压缩面积。

1.3.4 溶胶流变学分析

1.3.4.1 稳态流变学分析

经过碱溶处理后得到的热凝胶溶胶，采用Haake Mars III流变仪进行稳态流变学实验。实验温度25 ℃，转子型号C60/1° Ti L，间隙d=0.052 mm，剪切速率0.1～100 1/s。通过剪切应力(τ)与剪切速率(γ)之间关系的曲线来判断流体流变模型。流体的简单流动行为可表示为[24]：

τ=τy+Kγn

(2)

式中：τ为剪切应力，Pa；τy为屈服应力张量，牛顿流体、幂律流体τy值为0，宾汉塑性流体τy大于0，只有在应力超过屈服点时，流体出现流动，在屈服前，流体实际是弹性固体；K为流体的稠度系数，数值与液体的稠度和浓度有关，K越大，流体越黏，即流动阻力越大，mPa·sn；γ为剪切速率，1/s；n为流动指数，n的大小表示流体偏离牛顿流体的程度，当n=1，流体为牛顿流体，当n>1，流体为胀塑性流体，当0<n<1，流体为假塑性流体。

1.3.4.2 动态流变学

在动态模式测定前，需确定样品的线性黏弹性范围，实验温度25 ℃，转子型号P60 Ti L，间隙d=1 mm，频率f=1 Hz，应变λ=0.01%～100%进行检测。确定线性黏弹区后进行动态流变学分析，采用频率扫描模式，转子型号P60 Ti L，间隙d=1 mm，应变λ根据线性黏弹区范围来选择，频率f=0.1～100 Hz。

2 结果与分析

2.1 碱处理时间对热凝胶的影响

热凝胶和菌体混合悬浊液在碱溶前，如图1-a所示，热凝胶形成晶状颗粒，颗粒聚集成团块，染色后呈暗红色，热凝胶颗粒长径约15～25 μm，短径约10～12 μm，菌体被包裹和固定在半透明的热凝胶颗粒内或表面；0.25 mol/L NaOH溶液中碱溶30 min后悬浊液中颗粒物明显变小，呈橙黄色，显微镜下可见更多游离的土壤杆菌菌体，热凝胶颗粒长径减至约2～4 μm，短径减至约1～2 μm；碱溶60 min后，显微镜下只能观察到杆状的土壤杆菌菌体，染色程度较浅，菌体呈游离状，可以判断为热凝胶颗粒完全溶解，因此碱溶时间初选为60 min，在后续的实验中利用显微镜跟踪观察热凝胶的溶解状况。

碱溶后热凝胶溶胶的稳态流变学分析结果如图2所示，碱处理0.5 h时热凝胶尚未完全溶解，样品中存在固体颗粒，相比较于处理1 h后样品，流体黏度值(η)倍增，稠度系数K高37%，流体流动性弱，流动指数n约为0.92，表现出非牛顿流体的特性。碱处理1 h后，热凝胶完全溶解，处理1～6 h的溶胶流体黏度曲线线型较为一致，与处理0.5 h黏度曲线有较明显区别，这表明热凝胶溶解前后其流变学性质会发生变化，处理1 h以上黏度曲线线型一致也从侧面说明1 h后热凝胶完全溶解。热凝胶完全溶解后，热凝胶分子间氢键不断被破坏[19]，其流体稠度系数随时间增加而线性下降，表现为流体黏度的下降，流动指数n在0.94～0.97之间，流体接近于牛顿型流体。

溶胶按方法1.1处理得到热凝胶湿胶，按1.3所述方法分析其凝胶强度，结果如图2-b中所示，在6 h以内，碱处理时间对热凝胶凝胶强度无影响。

在热凝胶的工业提取过程中，不仅要关注产品质量，同时还要考虑到工作效率及经济成本，在凝胶强度损失不大的情况下，溶胶黏度是选择碱处理时间的重要指标，黏度越低，除菌时越容易，对设备要求越低，但处理时间过长影响提取效率，因此碱溶时间建议选择2～4 h。

2.2 碱溶温度对热凝胶的影响

在不同温度下对热凝胶进行处理，其流变学结果如图3所示，溶胶黏稠度随处理温度的升高而降低，溶胶流动指数n随温度基本不变，流体接近于牛顿流体。NaOH具有强烈的氢键破坏能力，热凝胶溶解在碱溶液中以后，热凝胶分子中由氢键连接而形成的有序结构被破坏，导致了其宏观理化性质的变化，温度的升高加剧了碱液对热凝胶分子间氢键的破坏。

对热凝胶样品进行质构分析，结果如图3、图4所示。随着处理温度的提高，热凝胶的凝胶强度、硬度和咀嚼性有所下降，较低温度下碱液对热凝胶结构的破坏作用[11]较小，提高温度处理后其对热凝胶结构的破坏性加剧；弹性、内聚性和回复性变化不大，说明样品凝胶化后，在压缩未破裂时组织结构稳定；实验所测样品黏性>内聚性，热凝胶样品组织间结合力小于凝胶表面吸引力，在探头上升过程中有部分残渣黏附在探头上。

碱溶温度升高，溶胶黏度下降，有利于过滤提取，但热凝胶凝胶强度、硬度等质构性质下降，降低了热凝胶的品质，在提取成本可接受范围内应降低处理温度以保证产品质量。工业提取过程中，设备一般在室温工作或水冷降温，工作时机械摩擦会导致温度升高，为节约成本，碱溶在室温进行，若温度过高，则水冷降温控制在20～30 ℃之间。

2.3 碱浓度对热凝胶的影响

用不同浓度碱处理热凝胶，实验结果如图5所示。从图5-a、5-b可以看出，热凝胶均质后未加入NaOH时，体系中存在颗粒性物质，流变学分析时剪切力大，黏度值高，均质液属于宾汉塑性流体，屈服应力张量τy=8 Pa，需要对其施加高于τy的屈服力流体才表现出流动性。

均质液流体的弹性模量G′大于黏性模量G″，随着扫描频率f增大，G′变化平缓，G″缓慢增加，体系中以弹性成分为主，表现为凝胶的特征。随着碱浓度的增高，热凝胶完全溶解,样品G″>G′，体系中以黏性成分为主，表现为液体的特征，热凝溶胶黏度不断下降，流体从宾汉塑性流体向牛顿流体转变。当碱浓度小于0.3 mol/L时，碱溶液黏度值较高，碱浓度对溶液流变学性质影响程度较大，土壤杆菌分泌的热凝胶天然构象呈三螺旋构象[25]，分子刚性大，三螺旋构象相互缔合形成凝胶晶格，表现出胶凝性。热凝胶分子在低浓度碱溶液(<0.3 mol/L)的作用下，螺旋之间的氢键被打断，热凝胶分子从三螺旋逐渐被解链成单链螺旋，分子链刚性下降，溶胶表现出黏性。当碱浓度高于0.3 mol/L时，热凝胶分子内的氢键被进一步打断，构象继续发生变化，单链螺旋构象转变成随意盘曲的松散构象，分子缔合度随碱浓度增加而降低[19]，流体黏度值降低，不同碱浓度溶胶的流变学性质基本一致，此时碱浓度的增加对溶胶流变学性质的影响趋于不变。

将经过不同浓度碱处理得到的热凝胶提取，配制成质量分数为2%的热凝胶，凝胶化后进行质构分析。热凝胶的解螺旋现象类似于蛋白质的变性过程，随着碱浓度的增加，三螺旋构象被解体，形成无规则卷曲的线性分子。当加入酸中和后，三螺旋构象得到恢复，但不能完全恢复至天然状态，因此导致凝胶强度的损失。如图6和图7所示，热凝胶凝胶强度随碱浓度的增加线性降低，强度下降幅度高于温度对强度的影响，说明碱浓度对于凝胶强度的影响要大于温度对其的影响，应尽量选择较低的碱浓度处理。

随着碱浓度的增大，热凝胶的硬度和咀嚼性都有所下降；而其弹性、内聚性和回复性变化不大，组织结构稳定。实验所测样品黏性>内聚性，组织间结合力小于凝胶表面吸引力，其各项指标变化与温度对其影响变化一致，说明无论是温度还是碱浓度，对于热凝胶凝胶内部稳定性的影响都较小。

碱浓度对热凝胶的品质和溶胶的黏度影响均较大，碱浓度高(>0.5 mol/L)时溶胶黏度低，有利于工业提取处理，但会大幅度降低热凝胶的品质，同时消耗大量的碱，造成资源浪费。碱浓度低(<0.3 mol/L)时有利于保护热凝胶，但溶胶黏度大，增加分离提取难度，降低处理效率。综合考虑处理效率、成本、产品质量等因素，工业提取选择0.3～0.5 mol/L的碱液终浓度较为合适。

3 结论

本研究考察了热凝胶提取过程中的3个主要影响因素，通过分析样品的流变学及质构学性质，选择适合工业碱溶提取热凝胶的条件。结果表明，(1)溶胶黏度随碱处理时间延长而降低，溶胶接近于牛顿型流体，凝胶强度基本不变。(2)热凝胶凝胶强度和溶胶黏度均随碱溶温度升高的而下降，较高的温度处理会降低热凝胶的品质，室温或水冷环境下可以满足工业要求。(3)随着碱浓度的增加，流体从宾汉塑性流体向牛顿流体转变。碱浓度低于0.3 mol/L时碱浓度增加溶胶流体性质变化大，碱浓度高于0.5 mol/L时碱浓度增加热凝胶品质影响变化大。

参考文献

[1] ZHANG Hong-tao, ZHU Li, LIU Deng-feng, et al. Model-based estimation of optimal dissolved oxygen profile in Agrobacterium sp. fed-batch fermentation for improvement of curdlan production under nitrogen-limited condition [J]. Biochemical Engineering Journal, 2015, 103：12-21.

[2] BACIC A, FINCHER G B, STONE B A. Chemistry, Biochemistry, and Biology of 1-3 Beta Glucans and Related Polysaccharides[M]. San Diego: Academic Press, 2009: 5-46.

[3] OKOBIRA T, MIYOSHI K, UEZU K, et al. Molecular dynamics studies of side chain effect on the beta-1,3-D-glucan triple helix in aqueous solution [J]. Biomacromolecules, 2008, 9(3): 783-788.

[4] JEZEQUEL V. Curdlan: A new functional beta-glucan [J]. Cereal Foods World, 1998, 43(5): 361-364.

[5] ZHAN Xiao-bei, LIN Chi-chung, ZHANG Hong-tao. Recent advances in curdlan biosynthesis, biotechnological production, and applications [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(2): 525-531.

[6] BULL A T, ELLWOOD D C, RATLEDGE C. Microbial Technology: Current States and Future Prospects[M]. London: Cambridge University Press, 1979: 422-427.

[7] WEST T P, NEMMERS B. Curdlan production by Agrobacterium sp. ATCC 31749 on an ethanol fermentation coproduct [J]. Journal of Basic Microbiology, 2008, 48(1): 65-68.

[8] BEN SALAH R, JAOUADI B, BOUAZIZ A, et al. Fermentation of date palm juice by curdlan gum production from Rhizobium radiobacter ATCC 6466: Purification, rheological and physico-chemical characterization [J]. LWT-Food Science and Technology, 2011, 44(4): 1 026-1 034.

[9] ANTEK B I, FELSKI M, FRIEHS K, et al. Production of paramylon, a β-1,3-glucan, by heterotrophic cultivation of Euglena gracilis on a synthetic medium [J]. Engineering in Life Sciences, 2009, 9(1): 23-28.

[10] SHIVAKUMAR S, VIJAYENDRA S V. Production of exopolysaccharides by Agrobacterium sp. CFR-24 using coconut water - a byproduct of food industry [J]. Lett Appl Microbiol, 2006, 42(5): 477-482.

[11] 孙永生. 微生物胞外多糖-热凝胶发酵和提取工艺的研究[D]. 无锡:江南大学, 2005.

[12] 吴剑荣,詹晓北,刘惠，等. 氨水流加用于粪产碱杆菌热凝胶发酵[J]. 生物工程学报, 2008, (6): 1 035-1 039.

[13] 张洪涛. 微生物β-1，3-葡聚糖的强化合成及最小功能单元挖掘[D]. 无锡：江南大学, 2011.

[14] 刘佳. 产热凝胶粪产碱杆菌的生理代谢研究[D].无锡: 江南大学, 2010.

[15] 路敬. 产热凝胶土壤杆菌及其ntrC突变株的生理代谢研究[D].无锡: 江南大学, 2012.

[16] 于丽珺. 土壤杆菌31749合成热凝胶的氮调控机理及高产策略研究[D].无锡: 江南大学, 2011.

[17] LI Jing, ZHU Li, ZHENG Zhi-yong, et al. A new effective process for production of curdlan oligosaccharides based on alkali-neutralization treatment and acid hydrolysis of curdlan particles in water suspension [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(19): 8 495-8 503.

[18] TADA T，TAMAI N, MATSUMOTO T, et al. Network structure of curdlan in DMSO and mixture of DMSO and water [J]. Biopolymers, 2015, 58(2): 129-137.

[19] TADA T, MATSUMOTO T, MASUDA T. Influence of alkaline concentration on molecular association structure and viscoelastic properties of curdlan aqueous systems [J]. Biopolymers, 1997, 42(4): 479-487.

[20] 王永远,叶剑,郑志永, 等. 土壤杆菌氧调控基因fnrN突变株发酵性能及基于RNA-Seq的基因表达[J]. 微生物学通报, 2017,44(10): 2 261-2 268.

[21] GB 28304—2012, 食品安全国家标准食品添加剂可得然胶[S]. 中华人民共和国卫生部, 2012.

[22] 李里特. 食品物性学[M]. 北京:中国农业出版社, 2010.

[23] RAHMAN M S, AL-FARSI S A. Instrumental texture profile analysis (TPA) of date flesh as a function of moisture content [J]. Journal of Food Engineering, 2005, 66(4): 505-511.

[24] 史铁钧,吴德峰. 高分子流变学基础[M]. 北京:化学工业出版社, 2009.

[25] BUSH C, RALAPATI S. Solution Properties of Polysaccharides[M]. Washington, D.C.: American Chemical Society, 1981: 125-147.