酸肉是以新鲜猪肉为原料，添加适量米粉和盐经厌氧发酵而成的一种传统的地方美食，主要分布在西南和中南地区，特别是少数民族以及汉族和少数民族混居地区。作为一种传统的猪肉保藏手段，这种厌氧发酵产酸所引发的变化，构成了酸肉特有的品质特点。特别是乳酸菌通过发酵产酸和细菌素，可改善产品的色泽、风味，并加快产品成熟[1]。由于酸肉是民间通过发酵的方式来保藏肉食品的一种方法，在发酵产酸后开始食用直到食用完毕，持续时间多达半年以上，期间以持续发酵的方式来保藏，这使酸肉长时间处于一定微生物和酸的条件下而成为一个动态体系，其持续的变化可能会影响酸肉品质。
蛋白质是肉制品的重要组成成分，其在加工和贮藏中的变化对肉制品品质起着关键性的作用，发酵肉制品的蛋白质降解与肉内源蛋白酶和发酵中微生物胞外酶等共同作用有关。微生物产酸导致内源酸性蛋白酶活性增加及微生物胞外酶产生等因素导致蛋白质降解[2-3]，生成一些多肽、小肽、氨基酸、醛、有机酸和胺类等物质，参与风味和质地的形成[4]，也是鲜味和酸味重要的特征构成成分。蛋白质降解产生的肽(特别是可溶性肽)和游离氨基酸是发酵肉制品鲜美滋味品质的重要组成，游离氨基酸组成变化还影响产品的风味[5]。此外，有报道称在肉制品发酵过程中，乳酸菌代谢产酸可促进蛋白质的降解[6]，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, CRL681)能降解肌浆蛋白和肌原纤维蛋白，特别是对肌浆蛋白的水解作用较强[7]，米酒乳杆菌可分解蛋白质产生游离氨基酸，赋予产品特有的鲜酸味[8]。鉴于此，研究酸肉在长时间发酵保藏中蛋白质的降解及对酸鲜滋味品质的影响，可为引导酸肉的合理食用、合理保藏提供有关蛋白质降解基础研究数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
新鲜猪瘦肉(背最长肌)、湖北大米、加碘食盐。大米炒至微黄后，粉碎后过20目筛。
1.2 主要试剂
H3BO3、NaOH、NaCl、MgO、KCl、三氯乙酸、乙醇、浓HCl、浓H2SO4、无水CuSO4、ZnSO4、茚三酮、亚铁氰化钾、草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和乳酸等，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
1.3 主要仪器与设备
FA2004A电子天平,上海精天电子仪器有限公司；722型可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司；L8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司；凯氏定氮装置,重庆北碚化学仪器厂；LC-20A高效液相色谱仪,日本岛津公司；XW-80A旋祸混合器,海门其林贝尔仪器制造有限公司等。
1.4 实验方法
1.4.1 酸肉制备及处理
原料肉切块，加调味料(加入质量分数为5%食盐、10%米粉、香辛料等)→揉制装坛→密封发酵→成品。即从超市购买新鲜猪瘦肉(背最长肌)，洗净沥干，切成约3 cm×5 cm×0.5 cm薄片，添加质量分数为10%米粉和5%食盐，揉制均匀，装坛，用新鲜粽叶压紧塞住坛口，水密封，20～25 ℃发酵。分别在发酵第0、20、50、80、110、140、180 天取样分析。
1.4.2 蛋白质降解指标分析
1.4.2.1 非蛋白氮(nonprotein nitrogen, NPN)[9]
刷掉附在酸肉表面的米粉并剔除可见脂肪和筋膜，称取绞碎肉样10 g于锥形瓶中，加入90 mL蒸馏水，室温振摇40 min，过滤后取25 mL滤液，加入10% TCA溶液25 mL。再次过滤后取10 mL滤液消化。凯氏定氮法测定非蛋白氮含量。
1.4.2.2 氨肽氮(aminopeptide nitrogen, AAN)[9]
准确称取5 g绞碎肉样，加入25 mL蒸馏水匀浆2 min，定容至100 mL，4 ℃下10 000×g离心20 min，上清液过滤后加入质量分数为50%的三氯乙酸使其TCA最终质量浓度为 500 g/L，过滤除去蛋白沉淀，取滤液用茚三酮比色测定，以异亮氨酸标准液绘制标准曲线。
绘制标准曲线：准确吸取200 μg/mL异亮氨酸标准液0、0.5、1.0、1.5、2.5、3 mL分别置于25 mL的容量瓶中，分别加水稀释至4 mL，分别加入磷酸盐缓冲液(pH值为 8.04)和茚三酮溶液(20 g/L)各1 mL，摇匀，沸水浴15 min，取出，迅速冷却至室温，加水至标线，静置15 min。570 nm测吸光值，以异亮氨酸的质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，经拟合得回归方程：y=0.033 7x-0.032 6，R2=99.32。
1.4.2.3 TCA-可溶性肽(三氯乙酸-可溶性肽)
参考VISESSANGUAN[10]的方法。称取3 g绞碎肉样，加入27 mL冰冷的50 g/L TCA溶液，高速均质(10 000 r/min,2 min)后于4 ℃静置1 h，然后采用高速冷冻离心机离心(12 100×g,15 min)，取上清液。TCA-可溶性肽含量测定采用双缩脲法，以牛血清蛋白作标准曲线，结果用μmol tyrosine/g muscle表示。
1.4.2.4 游离氨基酸
参照张苏平等的方法[11]并略作修改。准确称量1.5 g肉样置于50 mL离心管中，加入15 mL、0.02 mol/L稀HCl充分均质，超声萃取5 min，随后冷冻离心(5 000 r/min，4 ℃)10 min，收集上清液，剩余残渣按相同条件重复操作1次，合并上清液，定容至50 mL。移取2 mL定容后的上清液，加入2 mL体积分数8%的磺基水杨酸溶液，再次离心(10 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液经0.22 μm水相过滤膜过滤后，上机分析。分析条件：总时间53 min；分离柱(4.6 mm×60 mm)，洗脱液流速0.4 mL/min，柱温70 ℃，柱压11.627 MPa；反应柱流速(茚三酮及茚三酮缓冲液流速0.35 mL/min)，柱温135 ℃，柱压1.078 MPa。
1.4.3 有机酸含量的测定
参照CHEN等[12]的方法。准确称取5 g肉样，加入25 mL超纯水8 000 r/min均质2 min，超声萃取5min，10 000×g离心20 min，取上清液定容至50 mL。吸取1 mL提取液过0.22 μm水系膜，注入高效液相色谱仪。色谱条件：Kromasil C18柱(250 mm×46 mm);流动相,A相为甲醇，B相为0.05 mol/L K2HPO4(pH值为 2.8)，分流比为2∶98；柱温为30 ℃，流速为0.6 mL/min，进样量10 μL，检测器波长214 nm，根据保留时间定性，峰面积外标法定量。
绘制标准曲线：配制混合母液(草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸5 g/L，乳酸10 g/L)，用超纯水将混合母液稀释5倍得到混合有机酸标准工作液。再用超纯水将混合标准工作液配制成一系列混合标准液(乳酸0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL；其他酸：0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)。然后按上述色谱条件上机分析，以质量浓度ρ(g/L)对峰面积Y作图，得标准曲线回归方程如表1。
表1 有机酸标准曲线回归方程
Table 1 Standard curve equations for various organic acids
1.4.4 乳酸菌计数
按照《GB 4789.35—2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》，MRS培养基，涂布法平板计数。
1.4.5 感官评价
参考汤海青等[13]的方法，略加修改。邀请12位经专业培训的食品专业人员(6男、6女)，对不同发酵时段酸肉进行感官评价，包括色泽、香气、质地、滋味(蒸熟)，采用10分制。感官总得分=20%色泽+20%组织形态+30%气味+30%滋味，感官评分达到8分以上表示品质良好，可接受性高；6～7分表示尚可接受，低于5分表示不能接受。评分员在进行评价时不得相互交谈，更换样品时用纯水漱口。评分标准见表2。
表2 酸肉感官评价标准表
Table 2 Sensory evaluation standards for sour meat
1.5 数据处理
结果以平均值±标准差表示，采用Origin 8.6作图，SPSS 22.0进行单因素方差分析和相关性分析。p<0.05表示显著，p<0.01表示极显著。
2 结果与分析
2.1 发酵对酸肉蛋白质降解的影响
2.1.1 非蛋白氮和氨肽氮在发酵中的变化
结果如图1所示，随发酵时间的延长，NPN和AAN均快速增加后保持稳定。NPN含量在发酵至80 d时迅速增长(p<0.05)，由13.96 mg/g升至23.25 mg/g，继续发酵后NPN含量增速放缓。AAN在整个发酵期间持续增加(p<0.05)，至110 d后上升趋缓。
图1 非蛋白氮和氨肽氮在发酵中的变化
Fig.1 Changes of NPN and AAN during fermentation
NPN变化趋势与马艳梅等[14]报道的羊肉火腿加工中蛋白质降解趋势相似，也和HU等[15]对鲢鱼发酵香肠的研究结果类似。AAN和NPN的增加在一定程度上促进了酸肉风味的形成，与酸肉滋味密切相关。酸肉在整个发酵阶段处于偏酸环境(pH值为4～5)，且自然发酵的优势菌群为乳酸菌[16-17]。推测酸肉发酵中AAN含量的增加可能是乳酸菌等微生物胞外酶及乳酸菌产酸诱发酸性蛋白酶活性的提高，从而使AAN含量升高。
2.1.2 TCA-可溶性肽和游离氨基酸在发酵中的变化
结果如图2所示。发酵0 d时TCA-可溶性肽为67.80 μmol Tyr/g湿基，在0～110 d时随发酵时间增加而逐渐增加(p<0.05)，随后逐渐下降。表明发酵过程中蛋白质在逐渐降解，发酵后期的波动可能与蛋白质进一步水解有关。
图2 TCA-可溶性肽和游离氨基酸在发酵中的变化
Fig.2 Changes of TCA-soluble peptides and free amino acids during fermentation
TCA-可溶性肽是构成酸肉鲜味的重要品质成分，表明发酵可提升酸肉鲜味品质，合适的发酵时间是110 d。发酵110 d和180 d时，TCA-可溶性肽含量分别为发酵0 d时的1.9倍和1.57倍。该结果与曾雪峰[18]报道发酵酸鱼TCA-可溶性肽含量比原料肉约增长了10倍有较大差距，也与戴梦婕等[19]报道发酵鲢鱼糜TCA溶解肽含量持续增加不同，可能是由于原料肉特性及发酵条件差异造成。
随着发酵时间的延长，游离氨基酸快速增加，在110 d后增长趋缓，发酵110 d和180 d时游离氨基酸总量分别为发酵0 d时的5.85倍和6.04倍。相关性分析显示，游离氨基酸含量变化和AAN及NPN呈现极显著相关性(p<0.01)。TCA-可溶性肽和游离氨基酸含量在发酵前期均呈逐渐增加的趋势，至发酵110d时，TCA-可溶性肽有所下降，而游离氨基酸保持稳定，表明长时间发酵中主要是降低了可溶性肽的含量，进而影响酸肉鲜味品质。从游离氨基酸和可溶性肽变化趋势看，发酵110 d左右酸肉品质较好。
2.2 游离氨基酸组成在发酵中变化
2.2.1 游离氨基酸组成变化
不同氨基酸呈现不同滋味特点，氨基酸的呈味与其侧链R基团疏水性有关[20]，当氨基酸疏水性较小时，主要呈甜味，如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和天冬酰胺等。当氨基酸疏水性较大时，主要呈苦味，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等；当侧链R基团为酸性基团如—COOH、—SO3H时则以酸味为主，如天冬氨酸、谷氨酸，也是鲜味的重要物质。
游离氨基酸组成在发酵中的变化结果见表3。大部分游离氨基酸含量随发酵时间延长呈升高的趋势，峰值游离氨基酸浓度多出现在发酵110～180 d，其中，呈酸鲜滋味的天冬氨酸和谷氨酸峰值浓度在发酵110 d，可能是谷氨酰胺脱氨基作用，对酸鲜味形成有利[21]。呈甜鲜滋味的氨基酸包括丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸峰值散布在发酵110～180 d，丙氨酸的持续增加对形成酸肉甜味有促进作用[22]，呈苦味的氨基酸含量多数随发酵时间延长逐渐增加。
表3 游离氨基酸在酸肉发酵中的变化(mg/100g湿基)
Table 3 Changes of free amino acids in sour meat at different fermentation time
注：结果以均值±标准差表示，n=3，同一行数据不同字母表示显著性差异(p<0.05)，下同。“*”表示主要呈苦味的氨基酸。“**”表示主要呈甜鲜味的氨基酸。“***”表示主要呈酸鲜味的氨基酸。
2.2.2 呈味游离氨基酸变化特点
各呈味游离氨基酸如图4所示，主要呈酸鲜味感和甜鲜味感的氨基酸在发酵110 d时达峰值，呈苦味的氨基酸含量则随发酵时间延长逐渐增加，表明长时间发酵可能影响酸肉滋味品质，使酸、鲜、甜的滋味下降，苦味增加。
图4 呈味游离氨基酸含量在发酵中的变化
Fig.4 Changes of flavor free amino acids at different fermentation time
结合各主要呈酸鲜和甜鲜氨基酸的味觉阈值，计算其在发酵过程中的味觉强度变化，结果见表4。主要呈酸鲜味感的谷氨酸和天冬氨酸味觉强度随发酵时间延长逐渐增加后下降，发酵110 d为峰值味感强度，并主要受谷氨酸的影响；主要呈甜鲜味感的氨基酸变化不一，味觉强度以发酵后期较高，高值出现在发酵110 d，主要影响因素是丝氨酸，也受丙氨酸影响。总味感强度高值出现在发酵110 d，继续发酵，味感强度有所下降，与发酵80 d相当。表明发酵使蛋白质降解为氨肽氮，改变游离氨基酸含量及组成，提升酸、鲜和甜的滋味品质。考虑长时间发酵产生苦味氨基酸，综合考虑酸肉发酵保藏时间在80～110 d为宜。
表4 呈味游离氨基酸味觉强度在发酵中的变化
Table 4 Changes of the strength of tastes of flavor free amino acids at different fermentation time
注：味觉强度=味感物质浓度(%)/该味感物质阈值(%)[23]
2.3 发酵对酸肉中乳酸菌数及有机酸的影响
2.3.1 乳酸菌在酸肉发酵中的变化
酸肉中的乳酸菌在发酵过程中的变化情况如图5所示。随发酵进行，酸肉中乳酸菌快速增加，发酵50 d达峰值后保持稳定，发酵50 d和180 d时乳酸菌数分别为发酵0 d时的1.81倍和1.49倍。即在酸肉发酵中乳酸菌达到一定水平后会保持稳定，可能与乳酸菌自身产生的细菌素可对乳酸菌群数量消长进行调节有关[24]。
图5 乳酸菌在酸肉发酵中的变化
Fig.5 Change of lactic acid bacteria in sour pork during fermentation
2.3.2 发酵时长对酸肉中有机酸组成的影响
酸肉是通过乳酸菌厌氧发酵产酸抑制腐败菌生长繁殖以保藏猪肉的一种传统方法，这种发酵产生的有机酸的含量及组成是酸肉特征酸味的基础。实验结果如图6和表5所示，检出的有机酸包括草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸，未检出乙酸。酒石酸本底值较高，在发酵中呈现先升后降的趋势，占总有机酸组成比从发酵0 d时的81.24%逐渐降至发酵180 d时的57.46%，是酸肉主要的有机酸。乳酸则随发酵时间延长逐渐增加至发酵80 d后保持稳定，乳酸含量占比从发酵0 d时的15.12%逐渐增至发酵180 d时的38.79%。该研究结果与王雪锋等[25]报道酒石酸是臭鳜鱼发酵中含量最高的有机酸相吻合。动物性食品含有较高的酒石酸，约在2%～3%[25-26]。发酵80d时酸肉总有机酸达峰值浓度，为5913.66 mg/100 g湿基，酒石酸和乳酸分别占比62.12%和29.37%。总有机酸含量较高，但酸肉pH值保持约4.2[16]，可能与不同有机酸酸度差异有关，酸肉中主要的酒石酸酸度仅相当于柠檬酸的0.68～0.71[23]。
图6 发酵保藏过程中酸肉中的有机酸含量
Fig.6 Content of organic acids in sour meat during fermentation preservation process 注：柠檬酸在50、80、110及180 d时未检出，以平均数±SD作图，不同大写字母表示同种有机酸在不同发酵时间下含量在0.05水平上差异显著；不同小写字母表示相同发酵时间下不同种类有机 酸含量在0.05水平上差异显著。
随发酵进行，草酸、酒石酸及琥珀酸呈先增后降趋势，峰值含量出现在发酵80～110 d。柠檬酸则在发酵20 d后含量降低或未检出。有机酸含量的波动与发酵过程中微生物代谢活动密切相关，也会影响酸肉酸味特征，并对酸肉质地、触觉、口感发生重要影响，并诱导肌球蛋白和胶原蛋白等改变[27]。经对各发酵时段有机酸味觉强度进行分析(表5)，琥珀酸、酒石酸和草酸味觉强度高值出现在发酵80～110 d，乳酸味觉强度高值出现在发酵80 ～180 d；总味感强度呈先升后降趋势，高值出现在发酵80～110 d。发酵前期(<80 d)由于酒石酸本底值较高，酸味感主要受酒石酸影响。发酵80～110 d时，除柠檬酸外，各有机酸味感强度均达高值，此时酸肉的酸味感受受各种有机酸综合作用，味感层次和强度均最强。继续发酵乳酸味感强度占比增加,酸味感会变得尖利。
表5 酸肉发酵中有机酸味觉强度的变化
Table 5 Changes of taste the strength of tastes of organic acids at different fermentation time
注：味觉强度=味感物质浓度(%)/该味感物质阈值(%)[23]。
2.4 发酵时长对酸肉感官品质的影响
结果见表6，发酵前50 d酸肉色泽得分呈升高趋势，说明0～50 d是酸肉特有色泽形成阶段，140 d后由于肉表面或局部色泽暗淡发黄导致得分降低，组织形态得分先增加，后期由于肉块表面发糜和组织较松散得分降低，气味和滋味得分先升高并在发酵80 d时得分最高，随后明显下降。由感官总得分结果可知，发酵20～140 d酸肉样品均能被消费者接受，其中以发酵50～80 d接受度最高，20 d和110 d次之，140 d较差。至180 d时酸肉感官得分接近不可食得分，由此推测发酵140 d后酸肉品质开始劣变，这与蛋白质在微生物产酸影响下的持续降解有关。
表6 不同发酵阶段酸肉的感官评价结果
Table 6 Sensory evaluation of sour meat at different fermentation stages
酸肉发酵中感官品质、滋味气味总评分与蛋白质降解相关成分进行相关性分析，结果见表7。
表7 感官品质与滋味相关指标的相关性分析
Table 7 Correlation analysis of sensory and taste qualities
注：表中数据为Pearson相关系数。“**”表示在0.01水平(双侧)上显著相关；“*”表示在0.05水平(双侧)上显著相关。
酸肉感官品质、滋味气味品质与谷氨酸、丝氨酸、氨基酸总味感强度和乳酸含量呈正相关(p>0.05)；感官品质与总有机酸呈正相关，其中滋味气味与总有机酸含量显著呈正相关(p<0.05)；酸肉感官品质及滋味气味品质与酒石酸及总有机酸味感强度呈极显著正相关(p<0.01)。表明酸肉品质受多种因素的影响，酸味总味感强度是影响酸肉品质最重要的因素，游离氨基酸中的谷氨酸是重要的鲜味构成成分。
3 结论
随着发酵时间延长，NPN、AAN、TCA-可溶性肽和大部分游离氨基酸呈增加趋势，说明酸肉发酵过程中，蛋白质降解在一定程度上可促进风味的形成和营养品质的提高，但随着发酵时间的延长，TCA-可溶性肽含量有所下降，使酸肉鲜的品质下降，加上蛋白质持续降解可产生苦味氨基酸，可能会带来不利影响。从TCA-可溶性肽变化趋势看，酸肉采用发酵的方式保藏不宜超过110 d。
肉的滋味物质主要来源于蛋白质降解生成的肽及游离氨基酸，肽是鲜味的基础，而游离氨基酸对产品滋味及风味有一定作用，不同氨基酸由于极性差异呈现出不同的风味。酸肉发酵中酸鲜、酸甜和苦味的氨基酸均呈增加的趋势，其中，具有酸鲜和酸甜滋味的游离氨基酸高值出现在发酵110 d左右，继续发酵则逐渐下降，而苦味氨基酸则呈持续增加的趋势，从酸鲜和酸甜游离氨基酸总味感强度考虑，合适的发酵时间在80～110 d。
酸肉发酵中乳酸菌及有机酸组成成分分析显示，乳酸菌在发酵中迅速增加，发酵50 d后保持稳定的波动变化。总有机酸随发酵时间延长逐渐增加，总有机酸味感强度和含量高值出现在发酵80～110 d，主要的有机酸是酒石酸和乳酸，乳酸随发酵时间延长逐渐增加并保持在高值，表明长时间采用发酵方式保藏酸肉可改变酸味感。
感官评价显示酸肉发酵保藏50～80 d评分较高，滋味气味评价显示在发酵50～110 d最高。经与酸、鲜相关成分相关性分析显示酸肉感官品质及滋味气味品质与酒石酸及总有机酸味感强度极显著正相关(p<0.01)，滋味气味与总有机酸含量显著正相关(p<0.05)，而与蛋白质各降解产物无显著相关性。表明酸肉品质受多种因素的影响。
从本研究结果看，采用发酵的方式保藏酸肉，时间不宜超过110 d，最佳食用时段是发酵50～80 d。
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