鲜切苹果是经清洗、修整、去皮、切分等加工环节，再经包装后供给消费者的一种营养、方便、新鲜的即食产品[1]。因苹果果肉较硬，营养丰富，清脆多汁，适合于加工成鲜切产品，符合现代人对果蔬产品的高营养、方便即食的要求，鲜切苹果成为餐饮业及零售业最受消费者喜爱的零食餐点之一，在美国、日本等发达国家已经实现系统化、规范化生产，在鲜切市场中占有重要地位[2]。而苹果经鲜切后，破碎细胞组织与空气直接接触，会造成苹果营养物质外渗流失和氧化变质、外观品质下降[3-5]，且易受腐败微生物及病原微生物的侵染[6-7]，因而，研究一种简单、高效、安全的保鲜方法，成为国内外鲜切苹果保鲜领域的研究趋势。
鲜切苹果保鲜的方法主要包括物理方法(低温冷藏、热处理、气调保鲜、涂膜保鲜)、化学方法(保鲜剂、化学抑制剂保鲜)、生物方法(微生物产物保鲜、生物拮抗菌保鲜、天然植物提取液保鲜)[8]。目前鲜切苹果保鲜一般采用化学方法结合低温物理方法复合保鲜，但是，化学保鲜剂大多是化学合成物质，人们对其安全性存在着担忧。随着保鲜技术的发展，天然保鲜剂因其安全、环保、卫生等优点，成为食品保鲜领域的“新宠”。研究结果证实八角茴香油、银杏叶、生姜、陈蒿、花椒、知母提取物可有效延缓鲜切苹果的货架期，对鲜切苹果具有明显的保鲜效果[9-12]。
阔叶凤尾蕨为凤尾蕨属(Pteris L.)植物，萜类化合物(倍半萜、二萜、三萜)是凤尾蕨属植物中的主要活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等药理活性[13]。萜类是一类具有独特立体结构的生物活性天然产物，可通过清除自由基从而抑制人体细胞中低密度脂蛋白氧化与活性氧产生，从而防止动脉粥样硬化[14-15]。WEI等[16]利用动物急性炎症模型，验证了萜类化合物可有效减少腹膜炎小鼠血清NO，肿瘤坏死因子，白细胞介素含量[17]。体外抑菌实验表明，萜类化合物对葡萄状球菌、埃希氏菌和沙门氏菌等具有显著抑制作用[18-19]。但是凤尾蕨属植物提取物在鲜切果蔬保鲜领域的研究鲜有报道，本实验通过探究不同浓度阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果鲜度保持与品质的影响，以期开发出一种新型、安全、高效的天然保鲜剂。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阔叶凤尾蕨(Pteris esquirolii Christ)干燥根茎，2016年12月采自云南省德宏州法帕温泉边；红富士苹果(产地山东烟台)，成熟度一致，大小均一，无病虫害，无机械伤；聚乙烯保鲜袋(160 mm×120 mm, 0.03 mm)。
平板计数培养基，青岛海博生物技术有限公司；熊果酸标准品(色谱纯，含量≥99%)，上海安普实验科技股份有限公司；乙醇、2,6-二氯酚靛酚、草酸、NaOH、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、抗坏血酸、NaCl均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
CR400/CR410 型色差计，日本Konica Minolta公司；TA-XT plus质构仪，日本岛津公司；WYT-32 手持阿贝折光仪，上海精密仪器仪表有限公司；T25基本型高剪切分散匀浆机，德国IKA公司；PL203型精密电子天平，上海梅特勒托利多；BR4i 型台式高速冷冻离心机，法国Jouan公司；SIM-F140 型制冰机，日本三洋公司；UV-2600 紫外分光光度计，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 对照品制备及标准曲线制作
配制质量浓度为1 mg/mL的熊果酸标准品母液，稀释成不同质量浓度的熊果酸溶液(10、20、40、80、120、160 μg/mL)，采用紫外分光光度法在210 nm处测定不同浓度熊果酸的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制熊果酸质量浓度和吸光度之间的标准曲线。
1.3.2 阔叶凤尾蕨中总萜的提取工艺流程
阔叶凤尾蕨中总萜化合物的提取方法采用乙醇回流提取法，称取2.0 g样品置于50 mL烧瓶中，在选定各个条件下提取阔叶凤尾蕨总萜含量，待溶液冷却后，用提取剂定容至40 mL，摇匀，静置后过滤，吸取过滤液2 mL，用提取剂定容至10 mL，在210 nm波长处测定吸光度，由总萜标准曲线方程计算样品中总萜的含量。
1.3.3 阔叶凤尾蕨中总萜提取工艺的优化
采用单因素实验研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对阔叶凤尾蕨中总萜含量的影响，乙醇体积分数为：60%、70%、80%、90%、100%；料液比(g∶mL)为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取温度为：50、60、70、80、90℃；提取时间为：0.5、1.0、1.5、2、2.5 h。以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为4个因素[20]，设计3水平正交优化实验，L9(34)正交实验因素水平见表1。
表1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design
1.3.4 鲜切苹果的处理
将阔叶凤尾蕨提取物浓缩至浸膏，将浸膏用无菌蒸馏水配制为总萜含量为0.1 g/mL的供试原液，分别稀释至萜含量为2、4、8 mg/mL的阔叶凤尾蕨提取物(简称：KL)，以无菌蒸馏水为对照组(CK)，共设4个处理水平。按下述工艺流程处理鲜切苹果：苹果去皮去核后切成1cm3大小的立方体，分别用无菌蒸馏水、阔叶凤尾蕨提取物浸泡5 min，沥干，置于塑料托盘(每个托盘装约50 g苹果)，用聚乙烯保鲜膜密封包装，置于4 ℃ 贮藏。分别于0、2、4、6、8、10、12 d各取3盘样品测定各个指标，每项指标重复3次。
1.4 指标测定
1.4.1 失重率
以最初果实质量(m0)与每次测定果实质量(m1)之差占最初果实质量的百分比表示。
失重率
(1)
1.4.2 褐变值
色差计测定鲜切苹果的色度值，用褐变值BI值表示褐变程度，BI值分析方法参照姜爱丽等[21]。
1.4.3 硬度
硬度的测定参照潘秀娟等人方法加以改进[22]，利用质构仪检测鲜切苹果的硬度。TPA探头型号：P5，测前速率1.0 mm/s；测试后速率10.0 mm/s；测试速率1.0 mm/s；感应力10 g。
1.4.4 可滴定酸(titratable acid,TA)含量
采用酸碱滴定法，参照PILAR等[23]的方法，其中可滴定酸以苹果酸含量为换算系数计算。
1.4.5 抗坏血酸(Vc)含量
采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[24]。
1.4.6 可溶性固形物含量
苹果果肉经粉碎后，用手持阿贝折光仪测定鲜切苹果中可溶性固形物含量。
1.4.7 菌落总数
按GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定。
1.5 感官评定
成立10人的评定小组进行感官评定。注意每个感官评定人员在品尝苹果前都要用温水漱口，避免样品间的影响。评定人员参照评分标准进行打分，评分标准见表2，最后将评分表汇总得出结果。
表2 鲜切苹果的感官评定标准
Table 2 The standards of organoleptic investigation of fresh-cut apple
1.6 数据处理
对试验所得数据结果(每个指标重复3次)，采用Microsoft Excel 2003整理基本数据，利用Origin 75和SPSS 20.0分析软件进行数据分析。p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 总萜标准曲线建立
紫外分光光度计法测定熊果酸标准样品溶液，标准曲线方程为：y=0.011 6x+0.065 9 (R2=0.990 8)，其中y表示吸光度，x表示熊果酸浓度μg/mL，该标准曲线的适用范围为10～160 μg/mL。
2.2 提取工艺条件对阔叶凤尾蕨中总萜提取量的影响
2.2.1 乙醇浓度对阔叶凤尾蕨中总萜提取量的影响
由图1可知，阔叶凤尾蕨中总萜的含量随乙醇浓度的增加而呈上升趋势，最后趋于稳定。当乙醇浓度为90%和100%时总萜的提取率最高且两者不存在显著性差异，综合考虑提取率和实验成本，实验选用90%为最佳提取浓度。乙醇浓度影响阔叶凤尾蕨中总萜含量的原因可能与总萜化合物的极性有关，当提取溶剂的极性过大或过小都不利用总萜化合物的提取。本实验结果不同于李华等[25]研究总萜提取的乙醇最佳浓度80%，原因可能是原料不同或者原料中萜类型不完全一致，极性不同，所以提取剂浓度不同。
图1 乙醇浓度对阔叶凤尾蕨中总萜含量的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on total terpenoids content in Broadleaf Pteris
2.2.2 料液比对阔叶凤尾蕨中总萜提取量的影响
选择90%乙醇，在不同料液比下进行提取，其他条件同“1.3.2”项。由图2可知，随着料液比的减小阔叶凤尾蕨中总萜含量呈上升趋势，最后趋于稳定。当料液比为1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL)时，阔叶凤尾蕨中的总萜含量不存在显著性差异，综合考虑总萜提取率和实验成本，实验选用1∶15为最佳提取料液比。
图2 提取料液比对阔叶凤尾蕨中总萜含量的影响
Fig.2 Effect of the ratio of material to solution on total terpenoids content in Broadleaf Pteris
2.2.3 提取温度对阔叶凤尾蕨中总萜提取量的影响
选择90%乙醇，料液比为1∶15，不同提取温度下进行提取，其他条件同“1.3.2”项。
图3 提取温度对阔叶凤尾蕨中总萜含量的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on total terpenoids content in Broadleaf Pteris
由图3可知，当提取温度为70 ℃时，总萜含量最高。因提取剂沸点较低，所以温度过高不利用提取工艺的进行，而70 ℃条件下易控制且不易造成总萜化合物结构的破坏，因此，实验选用70 ℃为最佳提取温度。
2.2.4 提取时间对阔叶凤尾蕨中总萜提取量的影响
选择90%乙醇，料液比为1∶15，提取温度70 ℃，不同提取时间下进行提取，其他条件同“1.3.2”项。由图4可知，随着提取时间的增加，总萜含量呈上升趋势，直至平缓。提取时间2 h时为总萜含量最高。
图4 提取时间对阔叶凤尾蕨中总萜含量的影响
Fig.4 Effect of extraction time on total terpenoids content in Broadleaf Pteris
2.3 阔叶凤尾蕨中总萜提取工艺的优化
在单因素实验的基础上，确定出正交实验的因素水平，正交实验结果见表3。
表3 正交实验设计及结果
Table 3 Orthogonal array design and experimental results for optimal combination
利用Origin75数据处理软件采用极差分析法分析表3正交实验结果，得出：影响阔叶凤尾蕨中总萜含量的因素大小次序为乙醇浓度>料液比>提取温度>时间，最佳因素水平组合为A3B3C3D2，即阔叶凤尾蕨中总萜提取最佳工艺条件为：乙醇浓度95%、料液比1∶15、提取温度75 ℃、提取时间2 h。经实验证实，检测出该条件下提取的阔叶凤尾蕨中总萜含量为1.39%，明显高于单因素实验组。
2.4 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果保鲜效果的影响
2.4.1 不同处理对鲜切苹果失重率的影响
由图5可知，苹果鲜切后失重率增加，且所有处理组第4天时质量下降最多，产生这一结果的原因可能是前期苹果呼吸作用较强，消耗大量的营养成分，而贮藏后期，苹果的呼吸速度减缓，消耗营养物质的速率也随之减小。水处理组质量损失率整体增长最快，2、4、8 mg/mL组质量损失率在4 d后增长率减小，表明，阔叶凤尾蕨提取液处理可延缓苹果质量下降。其中，2 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组效果较好，4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组不存在显著性差异(p>0.05)，二者效果最佳。
图5 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果失重率的影响
Fig.5 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on weight loss of fresh-cut apple
2.4.2 不同处理对鲜切苹果硬度的影响
由图6可知，处理组和对照组鲜切苹果随着贮藏时间的延长硬度逐步下降，其中水处理组的硬度最低。贮藏前4 d，所有处理组硬度迅速下降，第6天后，2、4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨提取液处理组的硬度得到了较好地保持，硬度值下降速度减缓。这可能是因为阔叶凤尾蕨提取液在后期贮藏期间可抑制微生物数量的增加，从而减缓组织硬度下降速率[26]。其中，2 mg/mL阔叶凤尾蕨处理可有效减缓硬度的下降，4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组不存在显著性差异(p>0.05)，二者对硬度的保持效果最佳。
图6 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果硬度的影响
Fig.6 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on firmness values of fresh-cut apple
2.4.3 不同处理对鲜切苹果褐变值的影响
BI值表示鲜切苹果的褐变程度，BI值越高表示鲜切苹果的褐变程度越大，其表面颜色越深。由图7可知，不同处理组鲜切苹果的褐变程度均呈不断上升的趋势，但其褐变程度及褐变的变化速度却存在很大差异。第6天前，各处理组的褐变速度差异不大，第6天后，水处理组的褐变速度显著高于其他各处理组(p<0.05)。第12天时，2、 4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组BI值分别比水处理组低14.2%、20.5%、23.3%，说明2、4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨提取液均可减缓鲜切苹果的褐变速度，可较好保持鲜切苹果的色泽，其中，4 mg/mL效果最佳，其次为8和2 mg/mL。分析阔叶凤尾蕨可较好保持苹果色泽的原因是，其生物活性物质总萜具有抗氧化作用，可清除生物体内氧化产生的自由基，保护生物膜系统，从而发挥护色作用。
图7 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果褐变值的影响
Fig.7 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on BI values of fresh-cut apple
2.4.4 不同处理对鲜切苹果抗坏血酸(Vc)的影响
由图8可知，在4 ℃贮藏过程中各处理组样品的Vc含量均呈不断下降的趋势。2、4、8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组的Vc含量整体高于对照组(p<0.05)，且下降速度较慢，说明阔叶凤尾蕨能够有效抑制鲜切苹果中Vc在贮藏过程中的损失，减缓Vc的降低速率，可有效保持其营养成分及抗氧化能力。其中，4 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组在整个贮藏过程中效果最佳，8、2 mg/mL效果次之。贮藏第12天时，不同浓度阔叶凤尾蕨处理组间Vc含量不存在显著性差异。
图8 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果抗坏血酸 (Vc)的影响
Fig.8 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on Vc contents of fresh-cut apple
2.4.5 不同处理对鲜切苹果可溶性固形物的影响
可溶性固形物指组织细胞液内的多种营养物质及矿物质等，以糖类为主，是判断果实品质、成熟度的关键指标[27]。由图9可知，各处理组鲜切苹果在贮藏过程中其可溶性固形物含量均呈不断下降的趋势，且阔叶凤尾蕨处理组整体显著高于水处理组(p<0.05)，表明阔叶凤尾蕨可有效减少可溶性固形物的损失。其中，4 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组效果最佳，2和8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组效果次之且二者不存在显著性差异。
图9 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果可溶性固形物的 影响
Fig.9 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on soluble solid contents of fresh-cut apple
2.4.6 不同处理对鲜切苹果可滴定酸(TA)的影响
可滴定酸鲜切苹果贮藏期间重要的品质指标，由图10可知，各处理组可滴定酸整体呈下降趋势，但是变化不稳定，这一现象可能是苹果个体差异所致。水处理组可滴定酸下降速率较快，且12 d时可滴定酸含量最低，比4 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组低27.27%，4和8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组间不存在显著性差异(p>0.05)，二者效果优于2 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组。
图10 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果可滴定酸的影响
Fig.10 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on TA contents of fresh-cut apple
2.4.7 不同处理对鲜切苹果菌落总数的影响
鲜切产品在切割过程中造成汁液等营养成分外流，易滋生微生物，引起产品的腐烂变质，对品质和货架期有很大的威胁[28]。由图11可知，随贮藏时间的延长，鲜切苹果的细菌总数呈级数增长趋势。在相同的贮藏时间段，水处理组的细菌总数要远远大于阔叶凤尾蕨处理组的细菌总数(p<0.05)，表明阔叶凤尾蕨可有效抑制微生物生长，其抑菌活性随着浓度的增大而增强，8 mg/mL抑菌效果最好，其次为4、2 mg/mL。细菌总数越多对人体健康的威胁越大，在贮藏第12天时，水处理的细菌总数对数达到了6.04，而阔叶凤尾蕨处理组的细菌总数对数为4.77，保证了鲜切苹果良好的品质。
图11 阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果菌落总数的影响
Fig.11 Effects of Pteris esquirolii Christ extract on total bacterial count of fresh-cut apple
2.4.8 不同处理对鲜切苹果感官品质的影响
贮藏第4天开始，水处理的鲜切红富士苹果整体感官品质较差，明显低于阔叶凤尾蕨处理组(p<0.05)。空白组在第6天时，其感官评分以低至5分，而阔叶凤尾蕨处理组感官评分为8分左右，说明阔叶凤尾蕨可较好地维持鲜切苹果的感官品质。4 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组感官品质保持最好，2和 8 mg/mL阔叶凤尾蕨处理组感官品质效果次之。从感官评价结果可以看出，在适宜的范围内，处理浓度越大，效果越好，浓度过低或过高均会影响鲜切红富士苹果的感官品质。这可能是因为不适宜的浓度对超氧阴离子及羟基自由基等的抑制能力下降，导致褐变，影响外观色泽[29]；同时阻碍了脂肪酸、氨基酸等合成次级化合物的途径，进而对产品的风味和口感产生了消极影响[30]。
图12 不同处理对鲜切苹果感官评分的影响
Fig.12 Effect of different treatments on sensory evaluation of fresh-cut apple
3 结论
阔叶凤尾蕨中总萜最佳提取工艺：提取剂为95%乙醇，料液比1∶15(g∶mL)，75 ℃下提取2 h，总萜含量为1.39 mg/g。苹果经鲜切处理后，褐变速率加快，抗坏血酸、可滴定酸等营养成分会流失，为微生物的生长提供了有利条件[1]，本研究的结果显示，不同浓度的阔叶凤尾蕨提取物对鲜切富士苹果均起到了较好的保鲜效果，其不但能抑制鲜切苹果中微生物生长，减缓褐变速率，降低失重率，减少可滴定酸含量、抗坏血酸含量、可溶性固形物的损失，还较好地保持了鲜切红富士苹果的感官品质。8 mg/mL阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果中微生物的抑制作用最佳，但4 mg/mL阔叶凤尾蕨提取物对鲜切苹果褐变值、可溶性固形物及感官品质的保持效果最佳，且4 mg/mL阔叶凤尾蕨提取物对微生物也具有显著性抑制作用(p<0.05)，综合评价结果表明，4 mg/mL阔叶凤尾蕨提取物保鲜效果最佳。因此，阔叶凤尾蕨有待开发其在鲜切水果保鲜领域更广泛的应用，同时从分子水平深入研究阔叶凤尾蕨对鲜切水果抑菌保鲜的机理，以期开发出一种新型、安全、高效的天然保鲜剂。
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