酱卤肉制品是以鲜(冻)畜禽肉和可食副产品放在加有食盐、酱油(或不加)、香辛料的水中，经预煮、浸泡、烧煮、酱制(卤制)等工艺加工而成的肉制品[1]。鸡肉具有高蛋白、低脂肪和低胆固醇等特点，符合现代食品消费理念。德州扒鸡是我国传统风味肉制品的典型代表，具有香气醇厚、咸淡适中、香而不腻等特点，与河南道口烧鸡、辽宁沟帮子熏鸡和安徽符离集烧鸡并称“四大名鸡”。
风味影响扒鸡品质，它由进入口中的食物，通过刺激味觉、嗅觉、痛觉和触觉等受体而形成特定感觉，包括滋味和气味等[2-3]。滋味呈味物质是指一些可以产生酸、甜、苦、咸、鲜等感觉的非挥发性、水溶性物质，每次煮制前加入的食盐是扒鸡最主要的咸味物质，小分子肽、游离氨基酸、核苷酸及其代谢产物等其他呈味物质也对产品滋味具有重要作用。
扒鸡以卤汤为热传递介质进行煮制。起初，卤汤为清水中加入特定比例香辛料、调味料配制而成，每次煮制完成后，取样，补料，再加入经各种工艺处理的鲜鸡进行煮制，此即为一个煮制循环，卤汤多次循环利用。
关于扒鸡的研究，此前多聚焦于扒鸡加工过程基本品质变化及成品风味物质鉴定[4-6]，而对扒鸡滋味物质的研究内容较少涉及。本研究按照传统经典配方制作扒鸡，并跟踪分析卤汤循环利用后扒鸡游离氨基酸、核苷酸及其降解产物的组成与含量，科学解析德州扒鸡滋味物质的形成规律，以期为扒鸡标准化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
扒鸡由山东德州扒鸡股份有限公司提供。按照德州扒鸡传统技艺制作，将调味料、香辛料和胴体鸡肉按特定比例加入清水中，煮制后将卤汤复原配制，即一个煮制循环。起初，先每4个煮制循环后取样，卤汤循环利用12次后，每2个煮制循环后取样，共7个取样点，分别为“4、8、12、14、16、18、20”。扒鸡样品真空包装，-18 ℃贮藏备用。
Allegra 64R冷冻离心机，美国Beckman公司；1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；346-37真空泵，美国Millipore公司；T25数显型均质机，德国IKA有限公司；MiliQ超纯水系统，美国Millipore公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本Hitachi公司。
1.2 试验方法
1.2.1 扒鸡制作过程
试验中所用的扒鸡为雄性华北柴鸡(山东德州扒鸡股份有限公司饲养)，鸡龄为30 d，体重800 g左右。每个煮制过程扒鸡数量(84只)及总质量(67 kg左右)保持一致，香辛料质量固定，每次煮制后补充水分和食盐对卤汤进行复原配制，即每次煮制过程料汤比和肉汤比固定。另外，扒鸡煮制工艺固定，具体参数为升温卤煮(升温至90 ℃，20 min)→恒温卤煮(90 ℃，20 min)→高温焖煮(99 ℃，100 min)→降温焖煮(90 ℃降至80 ℃，40 min)→低温焖煮(80 ℃，90 min)。
1.2.2 游离氨基酸分析
参考KOBAYASHI等[7]、陶正清等[8]方法并稍作修改，具体方法如下：
称取4 g左右已绞碎的扒鸡样品，加入20 mL磺基水杨酸溶液(3 g/100mL)，均质(7 000 r/min，2×20 s)后于4 ℃冰箱中静置12 h，离心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，取2 mL正己烷于上清液中，混匀振荡(3 000 r/min，60 s)后取下层，最后通过0.22 μm有机滤膜过滤后检测。
1.2.3 核苷酸分析
参照DAI等[9]的方法并作适当修改，具体方法如下：
混合标准溶液的配制：分别称取10 mg的5′-二腺苷磷酸、5′-腺苷酸、5′-肌苷酸、次黄嘌呤、肌苷、5′-鸟苷酸标准品定容至10 mL，再吸取5 mL 5′-ADP、5′-AMP、5′-IMP、Hx、I、5′-GMP标准品(10 mg/mL)定容至10 mL，此时混合标准品溶液浓度为500 μg/mL，最后稀释为不同浓度梯度的混合标准品溶液。
样品制备：称取10 g左右扒鸡样品，加入30 mL HClO4(浓度为5%)，冰浴条件下均质(10 000 r/min，2×20 s)后吸取10 mL的HClO4清洗分散器，合并洗液与均质液后离心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，沉淀物用10 mL的HClO4洗涤，离心，合并2次上清液后过滤，通过KOH溶液调节pH值至5.4，0.22 μm水相滤膜过滤，最后用高效液相色谱仪检测。
核苷酸色谱条件优化：5′-GMP和5′-IMP分子结构相似导致其较难分离。参照孙承锋等[10]、李阳杰等[11]和邱伟强等[12]方法并稍作修改，试验选用400 μg/mL的混合标准溶液，分析比较pH值为5.5、6.5、6.8的NaH2PO4与Na2HPO4混合溶液(0.05 mol/L)与pH值为4.3、5.4、6.5的KH2PO4(0.05 mol/L)对6种核苷酸的分离效果。
HPLC主要色谱条件：色谱柱：TSK-gel ODS-80 TM(5 μm，4.6 mm×250 mm)，紫外检测波长254 nm。流动相：洗脱液A为甲醇，洗脱液B为KH2PO4缓冲液(0.05 mol/L)。甲醇与KH2PO4(0.05 mol/L)过程配比具体如下：0 min为0%/100%；11 min为10%/90%；18 min为0%/100%；23 min为0%/100%，检测时间23 min。
1.2.4 TAV和EUC的计算方法
参考CHEN等[13]方法：TAV=滋味物质的浓度/该物质的呈味阈值。TAV反映了单一化合物对整体滋味的贡献，当TAV<1时，该化合物对滋味贡献较小；当TAV>1时，该物质对滋味有显著影响。
参考YAMAGUCHI等[14]方法：EUC是衡量呈现谷氨酸单钠盐(MSG-like)滋味活性的氨基酸类(天冬氨酸，谷氨酸)与5′-核苷酸整体对食品鲜味(umami)的贡献，按照如下方程式计算：
Y=∑aibi+1 218(∑aibi)∑ajbj
(1)
式中：Y是鲜味浓度衡量(g MSG/100g)；ai为鲜味氨基酸(Glu或Asp)的浓度(g/100g)；bi为鲜味氨基酸相当于MSG的相对鲜度系数(Glu为1；Asp为0.077)；aj为呈味核苷酸(5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP)的浓度(g/100g)；bj为呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数(5′-AMP为0.18；5′-IMP为1；5′-GMP为2.3)。
1.4 数据处理
采用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)法对试验数据进行处理与分析，结果以平均值±标准差(xx±s)的形式表示，显著性水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 游离氨基酸
游离氨基酸是扒鸡主要滋味呈味物质。煮制过程中，游离氨基酸发生一系列化学反应形成扒鸡特征风味成分。由表1可知，卤汤循环利用4次后，扒鸡UAA、SAA、BAA、OAA和FAA含量分别为18.54、50.33、54.85、0.57和124.29 mg/100g，随着卤汤循环次数的增加，Glu和Asp等14种游离氨基酸含量先急剧升高后渐趋平缓，UAA、SAA和OAA含量变化趋势相似，卤汤循环利用18次后，扒鸡中各种游离核苷酸含量基本达到平衡状态(p>0.05)，扒鸡UAA、SAA和OAA含量分别为26.92、73.82和0.86 mg/100g，而BAA与FAA含量由于Arg、Lys含量升高而增加(p<0.05)。原因可能是游离氨基酸形成与降解量的比率决定其含量的高低[15]。扒鸡煮制工艺主要包括升温卤煮、恒温卤煮、高温焖煮、降温焖煮和低温焖煮等，一个煮制循环时间约为4 h。长时间高温使蛋白质发生降解反应，蛋白质初步降解为多肽后进一步产生小分子的肽类与游离氨基酸，且其降解产物游离氨基酸的含量随着时间的延长呈现明显增长趋势[16-17]。在相同煮制工艺下，蛋白质的降解量可认为是相同的。扒鸡在煮制过程中主要发生两种传质现象：一是卤汤溶解物渗入扒鸡；二是扒鸡中蛋白质降解为小分子的蛋白质、多肽和氨基酸等进入卤汤[18-19]。另外，游离氨基酸可通过Maillard反应生成小分子质量的醛、酮、醇类化合物及Stretcher降解产生硫醇，进一步氧化成含硫化合物，使扒鸡中氨基酸含量下降[20-21]。扒鸡和卤汤体系是一个复杂、稳定的传质体系，起初，卤汤中游离氨基酸含量较低，扒鸡中游离氨基酸较容易渗入卤汤，卤汤循环利用后，卤汤体系达到平衡状态，扒鸡中游离氨基酸渗入到卤汤中的含量减少。扒鸡游离氨基酸的含量较王南[22]试验结果低，原因可能是取样部位不同导致。
表1 卤汤循环利用过程中扒鸡游离氨基酸含量(湿基)1 单位：mg/100 g
Table 1 Free amino acid contents on braised chicken during brine recycle
注：游离氨基酸含量(xx±s)；同一行上标不同字母者为差异显著(p<0.05)。
2.2 核苷酸
2.2.1 核苷酸色谱条件优化
核苷酸色谱条件优化结果如图1所示，结果表明：NaH2PO4与Na2HPO4混合溶液对核苷酸的分离效果较差；KH2PO4的pH值为5.4时，6种核苷酸很好地分离且无明显拖尾现象。
2.2.2 卤汤循环利用过程中扒鸡核苷酸测定
核苷酸及其降解产物的含量是一个动态变化过程，ADP脱去一个磷酸生成AMP，AMP脱去一个氨基生成IMP，IMP降解为Hx和I[23]。由表2可知，反复煮制4次后，5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-ADP、Hx、I和风味核苷酸含量分别为70.27、2.36、11.67、7.90、6.16、19.26和84.31 mg/100g，随着卤汤循环利用次数的增加，扒鸡核苷酸及其降解产物含量先急剧升高后渐趋平缓，风味核苷酸主要包括5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP，其变化趋势与核苷酸相似。卤汤循环利用18次后，扒鸡核苷酸及其降解产物含量趋于稳定状态(p>0.05)，5′-IMP、5′-GMP、5′-AMP、5′-ADP、Hx、I和风味核苷酸含量分别为77.55、2.79、12.25、8.22、8.54、20.18和92.60 mg/100g。原因可能是扒鸡在煮制过程中发生核苷酸的生成与降解，RNA在5-磷酸二酯酶的作用分解为核苷酸，核苷酸在磷酸单酯酶的作用下分解产生风味物质[24]，另外，扒鸡与卤汤发生传质现象。最终，扒鸡核苷酸含量趋于平衡状态。
图1 核苷酸及其降解物标准品HPLC图谱
Fig.1 HPLC chromatogram of standard nucleotides and related compounds
表2 卤汤循环利用过程中扒鸡核苷酸及其降解物含量(湿基)1 单位：mg/100 g
Table 2 Nucleotide contents on braised chicken during brine recycle
注：核苷酸含量(xx±s，n=3)；同一行上标不同字母者为差异显著(p<0.05)。
2.3 扒鸡滋味物质的呈味作用及鲜味强度评价
滋味物质对滋味的贡献与含量及其滋味阈值有密切关系[25]。扒鸡呈味5′-核苷酸与游离氨基酸的含量、滋味特性、阈值[26-27]和滋味活性值见表3。扒鸡5′-IMP的TAV值最大，为3.10，其他滋味物质的TAV值均小于1，如Lys为0.75，Glu为0.69，根据滋味活性值TAV大于1时有呈味贡献作用的原则可知扒鸡有较强的鲜味。呈苦味的Met、Ile、Leu、Val等氨基酸[28]含量均明显低于阈值，这可能对扒鸡风味具有重要意义。
表3 扒鸡滋味物质的含量(湿基)、滋味特征、阈值和 滋味活性值
Table 3 The contents (wet matter), taste attributes, taste thresholds and TAVs of taste compounds on braised chicken
续表3
注：滋味物质的含量(xx±s)；(+)代表增味，(-)代表减味。
滋味不是由单一氨基酸或核苷酸决定的，它们的相互协同作用是决定扒鸡滋味的关键因素[29-30]，卤汤循环利用过程中扒鸡呈味氨基酸与核苷酸之间的协同增鲜作用通过EUC表示。图2显示，卤汤循环利用4次后，扒鸡EUC值为1.49，随着卤汤循环利用次数的增加，扒鸡EUC值先急剧增加后渐趋平缓，卤汤循环利用16次后，扒鸡EUC值无显著变化(p>0.05)，说明卤汤循环利用16次后，扒鸡逐渐趋于稳定状态。原因可能是卤汤循环利用16次后，扒鸡游离氨基酸和核苷酸及其降解产物含量基本达到平衡状态。扒鸡EUC值为2.18 g MSG/100g(湿重)，即1g扒鸡的鲜味强度相当于0.021 8 g MSG所提供的鲜度。MSG的滋味阈值为30 mg/100mL，扒鸡EUC的TAV值为72.67，说明扒鸡有较为强烈的鲜味强度。
图2 卤汤循环利用过程中扒鸡等鲜浓度
Fig.2 Equivalent umami concentration on braised chicken during brine recycles
3 结论
本研究通过对卤汤循环利用过程扒鸡滋味物质组成与含量的跟踪分析，并结合TAV和EUC验证得知，卤汤循环利用次数显著影响扒鸡滋味物质含量，且随着循环利用次数的增加，扒鸡鲜味氨基酸、甜味氨基酸、核苷酸及其降解产物含量、等鲜浓度值先升高后渐趋平缓。虽然扒鸡游离氨基酸、核苷酸及其降解产物含量与等鲜浓度达到平衡时的卤汤利用次数有差异，但循环利用18次后，扒鸡主要滋味物质趋于稳定状态，5′-IMP是扒鸡主要的滋味呈味物质。
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