食品用金属罐作为一种常用的食品包装材料，其内壁通常使用环氧酚醛、有机溶胶等涂料来增加容器耐腐蚀性和食品储存时间[1-2]。近年来，相关研究表明食品用金属罐在高温杀菌、高温运输、货架存放等过程中内壁涂层中的游离酚等污染物会向所接触的食品或食品模拟物发生迁移[3-5]。相关研究表明苯酚可影响人和动物肝脏、肾脏功能；而双酚A可导致内分泌失调，引发癌症和肥胖；4-叔丁基苯酚、间甲基苯酚和邻甲基苯酚可抑制人类和动物的中枢神经，影响呼吸系统、皮肤以及视力，过量的游离酚不仅能造成人类和动物的内分泌系统、神经系统、免疫系统异常，还会严重干扰人类和动物的生殖和遗传功能[4-6]。因此，除总游离酚外，还应关注单个具体游离酚的风险情况。
我国GB 9685—2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》[7]规定苯酚的特定迁移限量(specific migration limit, SML)小于3 mg/kg，4-叔丁基苯酚的SML小于0.05 mg/kg，双酚A的SML小于0.6 mg/L，间甲基苯酚和邻甲基苯酚按生产需要适量添加。GB 4806.10—2016《食品安全国家标准食品接触用涂料及涂层》[10]中同样规定食品接触用涂料及涂层中游离酚的SML为3 mg/kg(以苯酚计)。此外，随着GB 31604.1—2015《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验通则》[9]的实施，更加苛刻的迁移条件可能使金属罐中游离酚迁移量存在超标的风险。另外，欧盟(EU)法规No.213/2018[8]下调了塑料中双酚A的SML，由原来的0.6 mg/kg下调为0.05 mg/kg，同时规定使用含有清漆和涂层材料的包装材料包装的婴幼儿配方食品、较大婴儿配方食品、加工谷类食品、婴儿食品、为满足婴幼儿营养需求的特殊医疗用途食品、幼儿乳基饮料或类似产品均不得检出双酚A。我国是否需要修订双酚A的迁移限量标准，以及迁移试验通则实施后，食品用金属罐中双酚A和其他游离酚的合规性及潜在风险，均需要对迁移量检测分析后进行风险评估。
目前，上述游离酚的检测方法中仅苯酚和双酚A有国家标准，其他种类的游离酚也可能存在一定的食品安全风险。国内关于食品用金属罐中除苯酚、双酚A之外其他游离酚的分析方法以及食品用金属罐中游离酚的风险调查鲜有报道。目前，游离酚的检测方法主要有滴定法[11]、高效液相色谱法[12-13]、高效液相色谱-串联质谱法[3, 14]和气相质谱法[15]等。本文基于游离酚和双酚A的国家标准测定方法，建立了针对游离苯酚、间甲基苯酚、邻甲基苯酚、双酚A、4-叔丁基苯酚等5种游离酚的超高效液相色谱法。应用此方法对食品用金属罐在特定迁移条件下的5种游离酚的迁移风险进行了系统分析，研究结果对游离酚的监管、标准修订与风险评估具有借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苯酚、4-叔丁基苯酚、双酚A、间甲基苯酚、邻甲基苯酚：纯度≥99%，德国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈：色谱纯，德国Meck公司；乙酸、乙醇、正己烷：分析纯，北京试剂公司；49种食品用金属空罐来源于相关应用企业和生产企业。
Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱(附荧光检测器)，美国Agilent公司；AL204型电子天平：(万分之一)，梅特勒一托利多仪器厂；YXQ-LS-50A全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；封罐机。
1.2 实验方法
1.2.1 样品预处理
依据GB 5009.156—2016 《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》的规定[16]，空罐用自来水冲洗后用无残留洗涤剂清洗，再用自来水反复冲洗后，用蒸馏水冲2～3次，置于烘箱中烘干。
1.2.2 迁移实验
依据GB 31604.1—2015《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验通则》[9]，选择相应的食品模拟物以及浸泡条件对样品进行预处理。考虑到食品用金属罐的实际使用条件，最终选定了包含蒸馏水、4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇(体积分数)和玉米油共6种食品模拟物进行迁移实验，结合罐装工艺，选择的模拟条件，如表1所示。
表1 食品类型及标准选用迁移条件
Table 1 Food type and recommended migration conditions
1.2.3 浸泡液处理
参考GB 31604.10—2016 《食品安全国家标准食品接触材料及制品 2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)迁移量的测定》[17]，水基食品模拟物浸泡液冷却后过0.22 μm膜滤，进色谱分析；玉米油模拟物冷却后取1 g±0.01 g于10 mL离心管中，加入3 mL正己烷，摇匀后加入2 mL甲醇水溶液(1∶1,体积比)萃取，涡旋振荡3 min，静置分层后用注射器吸取1 mL下层水溶液过0.22 μm滤膜后进色谱分析。每组实验平行3次，若样品浓度高出线性范围，则将浸泡液稀释适当倍数后待测。
1.2.4 标准溶液的配制
分别准确称取苯酚、双酚A、间甲基苯酚、邻甲基苯酚、4-叔丁基苯酚的标准品0.01 g(精确至0.1 mg)，除双酚A用乙腈作溶剂外，其他4种酚用水定容至100 mL容量瓶中，制成浓度为100 mg/L标准储备液。分别精确量取1.00 mL各标准储备液到10 mL容量瓶中，用水定容，制成标准混合溶液。依次精确量取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL上述混合标准溶液于10 mL的容量瓶中，用水定容至刻度，得到苯酚、间甲基苯酚、邻甲基苯酚、对叔丁基苯酚的系列混合标准工作溶液为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L。采用同样方式，分别用4%乙酸溶液和10%乙醇溶液配制同样浓度系列的游离酚标准工作液。
对于玉米油标准工作液，分别准确称取10 g(精确至0.01 g)玉米油至6个25 mL离心管中，分别移取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL上述混合标准溶液于离心管中，得到苯酚、间甲基苯酚、邻甲基苯酚、4-叔丁基苯酚、双酚A的系列标准工作溶液为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/kg。分别取上述系列标准溶液1 g ± 0.01 g于10 mL离心管中，加入3 mL正己烷，摇匀后加入2 mL甲醇水溶液(1∶1,体积比)萃取，涡旋振荡3 min，静置分层后用注射器吸取1 mL下层水溶液过0.22 μm滤膜后进色谱分析。
1.2.5 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流动相：乙腈、水，梯度洗脱见表2；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；荧光检测器：激发波长235 nm，发射波长305 nm。
表2 流动相梯度及流速
Table 2 Gradient and flow rate of mobile phase
1.2.6 方法学分析
在优化后的色谱条件下将混合标准系列工作液进样分析，各浓度平行5次，根据响应值均值与浓度梯度做标准曲线，外标法定量。以最低标准工作液浓度进样计算方法最低检出限(S/N=3)与定量限(S/N=10)。选取实验用空罐样品进行游离酚的加标实验，标准溶液的添加水平分别为0.03、0.05、0.08 mg/L，单次分析6个平行，分析方法回收率与精密度。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
参考国标中双酚A的色谱条件，分别以乙腈-水、甲醇-水为流动相分析5种游离酚的分离度。当流动相选择甲醇-水时，间甲基苯酚和邻甲基苯酚不能得到有效的分离；而流动相选择乙腈-水时，间甲基苯酚和邻甲基苯酚分离度良好。为了提高测定时效性，实验采用梯度洗脱(优化后的梯度洗脱程序见表2)，从而使5种目标物在有效分离的情况下，单次分析时间最短。其次对各游离酚的检测波长进行全扫描，结果显示当激发波长235 nm，发射波长305 nm时，灵敏度最佳，不同基质下的色谱图见图1。
a-水；b-4%乙酸；c-10%乙醇；d-玉米油;图中各峰分别为：1-苯酚；2-间甲基苯酚；3-邻甲基苯酚；4-双酚A；5-4-叔丁基苯酚
图1 食品模拟物中游离酚液相色谱图
Fig.1 Chromatogram of free phenol in food simulants
各游离酚分离度良好，水基食品模拟物(水、4%乙酸、10%乙醇)中目标峰响应值相近，而玉米油中各游离酚响应值差异较大，且4-叔丁基苯酚的检出限较高，可能对定量结果造成一定影响。该方法对于5种游离酚测定的峰型和分离度符合痕量物质的测定要求。
2.2 线性范围及检出限
用迁移试验选用的食品模拟物水、4%乙酸溶液、10%乙醇溶液(20%乙醇溶液和50%乙醇溶液由于均为乙醇水体系，故只选择10%乙醇溶液为代表)和玉米油分别配制标准工作液做标准曲线。按照设定的色谱条件将游离酚各个浓度梯度进样分析，根据各个梯度浓度及其响应值绘制标准曲线，计算检出限(以信噪比S/N=3计算)和定量限(以信噪比S/N=10计算)，结果如表3所示。在0.01～0.500 mg/L线性范围内，相关系数在0.969 5～0.999 9，检出限为0.001～0.010 mg/L。
表3 食品模拟物中游离酚的线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限
Table 3 The linear equations, R, LOD and LOQ of free phenols in food simulants
2.3 回收率和精密度
使用迁移试验选用的食品模拟物水、4%乙酸溶液、10%乙醇溶液和玉米油分别进行加标实验。分别在上述食品模拟物中添加5种游离酚的标准储备液，添加浓度水平分别为0.03、0.05、0.08 mg/L，经迁移试验方法处理后进行色谱分析，每个浓度平行6次，结果见表4。
表4 样品加标回收率和精密度(n=6)
Table 4 The average recoveries and relative standard deviations of samples(n=6)
各游离酚的回收率在70.2%～118.8%，均值为90.7%，重复测定的相对标准偏差(RSD)小于7.2%。其中，玉米油基质的重复测定RSD值高于其他基质，与其响应值较低有关。方法整体符合痕量物质的检测要求，该方法可实现食品金属包装中游离酚的迁移量的准确检测。
2.4 迁移量分析
依据不同型号、材质、涂层类型以及接触食品类型将49种食品金属包装空罐分为6个类型进行了游离酚迁移水平调查。每个类别选择不同的模拟物，单个样品平行5次分析，结果取均值，见表5。
表5 样品中游离酚特定迁移量实验结果
Table 5 SML result of free phenol of samples
注：1.nd=未检出，计算均值时设定nd=1/2 LOD；2./，表示不需考虑；3.总游离酚迁移量为5种游离酚迁移量之和。
49个样品中苯酚检出率为30.6%，迁移量最大值为0.123 mg/kg，平均值为0.014 mg/kg；双酚A检出率为89.8%，迁移量最大值为0.338 mg/kg，平均值为0.055 mg/kg；4-叔丁基苯酚检出率为28.6%，迁移量最大值为0.059 mg/kg，平均值为0.009 mg/kg；间甲基苯酚检出率为16.3%，迁移量最大值为0.035 mg/kg，平均值为0.012 mg/kg；邻甲基苯酚检出率为4.1%，只有2个阳性样品；游离酚总迁移含量最大值为0.486 mg/kg，均值为0.092 mg/kg。结果表明，除苯酚和双酚A外，其他3种游离酚类同样均有检出，也印证了不同种类的游离酚均存在一定的迁移风险。所有样品中总游离酚的迁移量均在我国食品安全国家标准规定的安全限值之内，其中有2个样品的4-叔丁基苯酚迁移量超过限量值，超标率为4.1%。双酚A在所有样品中检出率和平均含量均为最高，若依照欧盟最新修订的限量值，16个样品中双酚A的迁移量超过0.05 mg/kg，超过率为32.7%。
不同模拟物条件下，各游离酚检出率和迁移量存在一定差异。其中，苯酚在乙醇体系中检出率较高；4-叔丁基苯酚在20%和50%的乙醇体系中检出率高于其他基质；间甲基苯酚在50%乙醇体系中的检出率高于其他基质。而双酚A在各类模拟物中(水除外)的检出率均接近100%。结合国内外对双酚A及其衍生物的研究进展，应进一步普查分析食品用金属罐中双酚A以及双酚A类衍生物的迁移水平与迁移规律[18-20]，对其进行风险评估以保证消费者安全。其他4种游离酚均有离群值，表明不同企业的食品用金属罐品质参差不齐，品质还有待标准化规范化。
在乙醇体系的模拟物中，游离酚总迁移量高于其他基质。在以水为模拟物的迁移实验中，各游离酚均未检出，GB 31064.1—2015[9]规定对于乙醇含量低于10%的食品和不含乙醇的非酸性食品应首选10%乙醇，如食品接触材料及制品与乙醇发生酯交换反应或其他理化改变时，应选择水作为模拟物，上述实验结果也表明纯水为模拟物不适合分析该类食品金属罐的迁移情况，应首选10%乙醇溶液。
将所有样品依照结构和涂层类型(仅限明确涂层的样品，共计26个)分类，分析其游离酚迁移量的差异，结果见表6。环氧酚醛类涂料涂层中总游离酚的平均迁移量高于环氧氨基和水基改性环氧树脂；环氧酚醛和环氧氨基涂层的双酚A的平均迁移量均高于水基改性环氧树脂，且环氧氨基涂料涂层中双酚A的平均迁移量最高，约为水基改性环氧树脂的3倍。不同的罐型中，三片罐的各游离酚的迁移量以及迁移总量均高于两片罐，总迁移量约为两片罐的3倍。因此，双酚A类物质、环氧酚醛类涂料涂层以及3片罐应是今后食品用金属罐中游离酚迁移的重点研究对象。
表6 不同类型食品金属包装罐中游离迁移量分析
Table 6 Analysis on the amount of free phenol migration in different types of food metal packaging cans
注：1.未检出的样品迁移量依照1/2 LOD计算；2.各游离酚迁移量为不同模拟物基质条件下的平均值；3.总游离酚迁移量为5种游离酚迁移量之和
本研究建立的方法与GB 31604.46—2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品游离酚的测定和迁移量》中总游离酚迁移量规定的滴定法相比，重点关注单个游离酚的检测分析，便于后续对具体的游离酚种类进行风险评估。由于样本量以及罐体种类较少，实验的结果可能不足以反映目前食品用金属罐中各种游离酚迁移量的风险情况，今后的分析中应进一步补充样品种类和样本量。此外，GB 9685—2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》[7]中规定苯酚的SML小于3 mg/kg，而GB 4806.10—2016《食品安全国家标准食品接触用涂料及涂层》[10]中规定食品接触用涂料及涂层中游离酚的SML为3 mg/kg(以游离苯酚计)，两者在苯酚限量和总游离酚限量上存在一定的矛盾，应在限量值上予以统一，否则会造成依据不同标准判定结果存在差异。
3 结论
本研究建立了同时测定食品用金属罐中苯酚、双酚A、间甲基苯酚、邻甲基苯酚、4-叔丁基苯酚5种游离酚的超高效液相色谱法。该方法的定量限低于国标限量要求，方法线性好，精密度和回收率符合痕量物质的检测要求。该方法操作简单，分析时间短，在15 min内完成了5种游离酚的分离和检测，为单个具体游离酚迁移量的分析检测提供了方法支撑。对49种食品金属包装罐中5种游离酚的迁移水平分析结果表明，除2个样品中4-叔丁基苯酚超过限量值之外，其他各游离酚迁移量以及总游离酚迁移量均在限量值以内，双酚A对总游离酚迁移量贡献率最大。不同食品模拟物、不同罐内壁涂层以及不同罐型条件下各游离酚的迁移量存在一定差异。在乙醇体系模拟物中游离酚迁移量高于其他基质，食品用金属罐内壁环氧酚醛类涂料涂层中游离酚的迁移量高于环氧氨基和水基改性环氧树脂，三片罐的各游离酚迁移水平以及总游离酚迁移量均高于两片罐。应重点关注不同类型的内壁涂层以及双酚A及其衍生物的迁移水平及迁移规律。本研究结果将为食品用金属罐中不同种类游离酚迁移量的测定方法以及限量标准的制修订提供方法基础与数据支撑。
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