γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid， GABA)是目前研究较多的一种非蛋白氨基酸[1-2]，是中枢神经系统的主要抑制性神经递质,有降压、利尿、镇静等生理功能[3]，对神经系统疾病如癫痫、帕金森综合征、精神分裂、失眠、抑郁等有一定疗效[4]。
2017年中国生物发酵产业协会发布的《T/CBFIA 08003—2017食用植物酵素》标准要求液态食用植物酵素中GABA含量不低于0.03 mg/kg。
GABA在谷物、乳制品、酒类、泡菜制品等方面的研究应用已较为深入。果蔬汁经发酵后，GABA含量显著增加，乳酸菌发酵的西红柿汁中，GABA含量显著高于未发酵西红柿汁，且发酵结束后GABA含量仍在增加[5]；椰枣泥[6]、马齿苋[7]、葛根汁[8]等经发酵后，GABA含量亦有所提高。但目前仍缺乏对发酵果蔬汁中GABA产生来源的探究。
微生物主要利用GABA旁路来合成GABA(图1)。葡萄糖通过柠檬酸循环(TCA循环)代谢为α-酮戊二酸，并通过谷氨酸脱氢酶转化为谷氨酸。谷氨酸盐被谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)分解成GABA。GAD在动物、植物和微生物中均有存在。GAD所催化的L-谷氨酸(L-glutamic acid， L-Glu)脱羧生成GABA的反应，是生物GABA合成的关键，绝大多数生物合成GABA的研究都依赖该途径。
图1 GABA代谢途径 Fig.1 The metabolic pathway of GABA
除了L-Glu，谷氨酸钠(sodium glutamate, MSG)也可作为GAD的底物。此外，另一种腐胺途径(见图1)发现较晚,代谢途径复杂,有毒且价格昂贵，应用极少，难以像葡萄糖、 L-Glu和谷氨酸钠等物质作为前体直接添加在发酵液或转化液中用于GABA的生物合成。
在乳酸菌发酵果蔬汁中，因果蔬原料本身特性差异(例如GAD活性)，菌种发酵代谢特性差异以及添加物等都会影响产品中的GABA含量。本研究选取常用于发酵的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵杆菌和植物乳杆菌[9]，以荔枝、龙眼、青瓜、脐橙、苹果、梨为对象，分析不同菌种和不同果蔬原料中GABA产生的异同，并探究MSG、葡萄糖和L-Glu这3种常用底物在发酵果蔬汁中的利用情况。最后，将菌液和果汁分开单独处理并与发酵果汁做对比，以探究发酵果蔬汁中GABA的产生来源，为生产富含GABA的膳食饮品提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售青瓜、脐橙、红富士苹果、蜜梨、石硖龙眼、妃子笑荔枝，选择成熟度合适、无明显缺陷的果品；植物乳杆菌LP115(Lactobacillus plantarum)，双歧杆菌 LYD 10DCU-S(Bifidobacterium)，嗜酸乳杆菌LYO 10DCU-S(Lactobacillus acidophilus)，副干酪乳杆菌 LYO 50DCU-NM(Lactobacillus parmesei)，杜邦·丹尼斯克公司提供；γ-氨基丁酸标准品，Sigma公司。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；SPX-150D-Z生化(恒温)培养箱，上海博讯实验有限公司医疗设备厂；752N紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HR1895榨汁机，飞利浦(中国)投资有限公司；Thermo U-3000高效液相色谱仪。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
果蔬汁制备：脐橙、龙眼、荔枝洗净并去皮去核，苹果、梨、青瓜洗净，用榨汁机分别榨汁，过100目纱布；每150 mL分装于250 mL洁净锥形瓶中，使用硅胶塞密封，将果汁迅速加热至80 ℃，水浴保温10 min后迅速冷却至40 ℃，准备接种。
不同菌种发酵差异实验：荔枝汁制备完毕后分别接种植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和副干酪乳杆菌单一菌种，4种菌两两之间1∶1复配成混合菌种，和4种菌1∶1∶1∶1复配成混合菌种，使得初始活菌数达7.0 lg(CFU/mL)左右，采用37 ℃恒温箱静置发酵24 h，取0 h和24 h的样品进行指标测定。
不同果蔬汁发酵差异实验：6种果蔬汁接种4%的植物乳杆菌菌液，初始活菌数达7.0 lg(CFU/mL)，37 ℃恒温箱静置发酵24 h，取0 h和24 h的样品进行指标测定。
不同添加物差异实验：荔枝汁制备完毕后分别加入质量分数为1%、2%、3%的谷氨酸钠(MSG)、葡萄糖(Glucose)或L-谷氨酸(L-Glu)，并接种4%的植物乳杆菌，37 ℃恒温箱静置发酵24 h，取0 h和24 h的样品进行指标测定。
发酵果汁中产生GABA机理探究：荔枝清汁(榨汁后过100 目纱布)接种4%的植物乳杆菌于37 ℃发酵24 h；MRS液体培养基接种4%的植物乳杆菌，后用乳酸调pH值至3.32(与发酵结束后的荔枝汁相同)的荔枝汁于37 ℃放置24 h。取荔枝浊汁(榨汁后不过滤)重复上述制样步骤。
1.3.2 指标测定
活菌数：参考《GB 478935—2016食品安全国家标准 食品微生物学检验乳酸菌检验》，采用稀释平板计数法进行测定；pH值：参考《GB 10468—1989水果和蔬菜产品pH值的测定方法》，采用电位差法；GAD粗酶液的制备参考文献[10]；GAD活性测定参考文献[11]。
1.3.3 高效液相色谱法测定GABA含量
色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，样品处理及色谱条件参考文献[12]，如图2，图3所示。
图2 GABA标准品色谱图
Fig.2 The chromatogram of GABA standard
图3 GABA标准溶液的工作曲线
Fig.3 The standard curve of GABA solution
1.3.4 数据分析
采用Origin 9.0、SPSS 20.0和Excel 2007软件进行处理和分析。若无特别标明，每个数据均平行测定3次，结果表示为均值±标准偏差。采用Duncan新复极差分析法，取95%置信区间(p<0.05)；采用Pearson相关性分析，p<0.05为显著相关，p<0.01为极显著相关。
2 结果与分析
2.1 发酵菌种对荔枝果汁中GABA含量的影响
植物乳杆菌是频繁被报道的高产GABA的菌种[13]，常在泡菜[14]、米酒[15]等传统发酵果蔬、谷物制品中分离及应用。副干酪乳杆菌也有在发酵乳制品、发酵肉制品中分离及应用于产生GABA的研究[16-17]。嗜酸乳杆菌和双歧杆菌也是常用于发酵果蔬汁的菌种，但与GABA相关方面的研究很少。不同菌种发酵产生GABA的能力差异值得深入研究。
荔枝是典型的富含GABA的水果，以荔枝为对象，探究不同菌种发酵对荔枝汁中GABA含量的影响。如图4所示，各菌种在荔枝汁中增殖情况差异不大，发酵24 h后活菌数均能增加到10.0 lg(CFU/mL)左右，但不同菌种发酵的荔枝汁中GABA含量差异较大，其中植物乳杆菌发酵荔枝汁中GABA含量最高。KIM等[3]在短乳杆菌发酵的黑树莓汁和KO等[19]在黑豆乳中的研究都表明菌种发酵产生GABA与其代谢增殖能力差异无显著相关性，而与菌种中GAD活性相关。
不同菌种发酵荔枝汁中GABA含量增加情况与各菌种的酸化能力显著相关(p<0.05)。各菌种在荔枝汁中酸化能力不同，其中植物乳杆菌酸化能力最强，能将荔枝汁的pH值从初始的6.65降3.32。荔枝果汁中初始GABA含量为1.33 mg/kg,植物乳杆菌发酵后的荔枝果汁中GABA含量最高(1.87 mg/kg)，其次是嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌。研究表明，当初始发酵pH值为3.5～5.5时，GABA的合成差异不显著，当初始发酵pH值为6.0时，GABA产量显著减少[3]。由于发酵时乳酸等有机酸的积累，使pH值下降并激活GAD开始生产GABA[20]，而厌氧条件亦可促进GAD的表达，有利于GABA的合成。而负责分解GABA的Gab T和Gab D的最适pH值约为 9.0，因此乳酸菌发酵产生的酸性环境除了可以促进GABA合成外还可抑制GABA的分解代谢[20]。
图4 不同菌种发酵荔枝汁中的GABA含量
Fig.4 The content of GABA in lychee juices fermented by different starters
将4种菌种进行两两复配研究，因菌种之间的协同作用，菌种复配发酵时，荔枝汁中活菌数、产酸量和GABA含量均比菌种单一发酵有不同程度的提高。
结合图4和图5，单一菌种发酵时产生的GABA的能力基本决定了复配时菌种产生GABA的能力，有植物乳杆菌参与的复配方案所发酵果汁中的GABA含量均排在前列，其中植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌1∶1复配发酵时表现最优。与当4种菌1∶1∶1∶1混合发酵时，GABA含量与植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌1∶1发酵无显著差异，说明4种菌混合发酵时，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌在荔枝汁中起主导作用。菌种复配发酵实验规律也与单一发酵时结果相符合，不同复配方案发酵荔枝汁中GABA增加情况与菌种产酸能力呈正相关(p<0.05)。菌种产酸能力越强，其创造的酸性条件越能刺激组织产生GABA。
图5 不同菌种复配发酵荔枝汁中的GABA含量
Fig.5 The content of GABA in lychee juices fermented by different combinations of starters
2.2 不同果蔬汁发酵前后GABA含量的变化
用前文所述在荔枝果汁中发酵表现最优的植物乳杆菌发酵不同的果蔬汁。如图6所示，不同果蔬汁中初始GABA含量差异较大，苹果汁和梨汁中GABA含量只有0.01 mg/kg左右，而荔枝汁和龙眼汁中含量最高，分别为1.33 mg/kg和1.27 mg/kg。虽然苹果汁和梨汁初始GABA含量没有达到《T/CBFIA 08003—2017食用植物酵素》标准中液态食用植物酵素中GABA含量不低于0.03 mg/kg的要求，但经植物乳杆菌发酵后苹果汁和梨汁中的GABA含量增加到0.11 mg/kg和0.14 mg/kg，远超过了标准。
图6 不同果蔬汁发酵前后GABA含量变化
Fig.6 The content of GABA in different juices before and after fermentation
发酵后各果蔬汁中GABA含量增加程度不一，增加量与果蔬汁中初始GAD活性显著相关(p<0.05)，苹果汁、梨汁、青瓜汁和橙汁中GAD活性较低，发酵后增量较不显著，而龙眼汁、荔枝汁中GAD活性高，发酵后GABA含量增加明显。
2.3 添加物对发酵荔枝汁中GABA含量的影响
葡萄糖(glucose)、谷氨酸钠(MSG)和L-谷氨酸(L-Glu)没有毒性且相对廉价易得，因而不少研究将其作为前体，直接添加在发酵液或转化液以促进GABA的合成。例如乳酸菌在枣渣中发酵时添加谷氨酸，转化率可达80%～90%[21]；在牛奶中加入谷氨酸可使GABA产量提高20%[22]；加入糖、MSG的黑豆乳中GABA含量都有不同程度的提高。如图1和图7所示，MSG、glucose、L-Glu都是GABA代谢路径中的底物，但在植物乳杆菌发酵荔枝汁中，这3种底物的转化规律不尽相同。
图7中可看出，植物乳杆菌在荔枝汁中对MSG的利用率最高，相同添加量下，3种物质中添加MSG的发酵荔枝汁中的GABA含量最高。但随着MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趋势，这有可能是因底物的浓度的增加而触发了逆反应。在发芽糙米的GABA富集上也出现了相似的情况，当MSG含量大于2 mg/kg时，GABA含量随MSG浓度升高而下降[23]。相对于MSG和L-Glu，葡萄糖的添加对发酵荔枝汁中的GABA产量影响较小，这与荔枝汁中达到17.82 g/100g的总糖含量相关。在发酵果蔬汁中添加底物不仅要考虑对GABA含量的影响，还要考虑添加物对健康、果汁感官及消费者接受度等因素[3]，例如有研究表明在黑豆乳中加入5%的MSG后风味变得难以接受[19]。
LJ-荔枝汁；无添加LF-未添加前体物质的发酵荔枝汁
图7 不同添加物对荔枝果汁中GABA含量的影响
Fig.7 The content of GABA in fermented lychee juices after addry glncose,MSG and L-Glu
2.4 发酵荔枝汁中产GABA机理探究
植物乳杆菌发酵荔枝汁中增加的GABA包括两种来源：一是因荔枝组织对外界条件(如破碎、温度、低氧、酸度)应激代谢生成；二是植物乳杆菌在荔枝汁中代谢产生。为了探究植物乳杆菌发酵荔枝汁中GABA增加的机理，将菌液和汁分开处理并与发酵荔枝汁对比。荔枝汁接种4%植物乳杆菌并于37 ℃发酵24 h后GABA含量由1.33 mg/kg增加至1.87 mg/kg;经过调酸酸化的荔枝汁在37 ℃下储藏24 h后，GABA含量从1.33 mg/kg增加到1.38 mg/kg。添加了4%植物乳杆菌的MRS液体培养基(即图8中的纯菌液)中的GABA含量则由0 mg/kg增加到0.18 mg/kg。
图8 发酵荔枝汁中GABA含量构成图
Fig.8 The composition of GABA content in fermented lychee juice
可以发现纯菌液和酸化荔枝汁单独放置后两者共同增加的GABA含量仍显著低于发酵荔枝汁中的增加量。一是因为发酵荔枝汁中由植物乳杆菌创造的外界条件(如发酵产生的比人为添加乳酸酸化更复杂稳定的有机酸体系)更能促使荔枝组织产生GABA；二是因为植物乳杆菌在荔枝汁中有更充足的营养物质，比在MRS培养基中发酵产生更多GABA；三是因为发酵荔枝汁中因植物乳杆菌作用使得荔枝组织细胞通透性增强，使得原有荔枝汁中的GABA和因外界刺激而新产生的GABA更好地溶出，例如在乳酸菌发酵枣渣的制备中，为提高GABA的含量，对枣渣的前处理如添加淀粉酶、纤维素酶和果胶酶是必不可少的[21]，除了能使菌种更好地利用营养物质之外，也能使组织中产生的GABA更好地溶出。
酸化的荔枝浊汁放置后GABA增加量高于酸化后荔枝清汁GABA的增加量，这是因荔枝浊汁中含有更多的荔枝组织和其内GAD活性导致的。因此浊汁发酵后GABA增量显著高于清汁发酵后GABA的增量。
3 结论
乳酸菌发酵能显著提高果蔬汁中GABA含量。不同果蔬组织中原有GAD活性越高，发酵后GABA增量越多。不同发酵菌种酸化能力越强，发酵果汁中GABA增量越多。与葡萄糖和L-Glu相比，植物乳杆菌在荔枝汁中对MSG的利用率最高，但随着MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趋势，而葡萄糖的添加对发酵荔枝汁中的GABA含量几乎没有影响。植物乳杆菌不仅能在荔枝中发酵产生GABA，其创造的酸性低氧条件能刺激荔枝组织代谢产生GABA，并且能使荔枝组织细胞通透性增强，让荔枝汁中原有的GABA和因外界刺激而使荔枝组织新产生的GABA更好地溶出。通过乳酸菌发酵果蔬汁这一系列产品来满足消费者对富含GABA的膳食的需求是可靠并具有前景的。
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