植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定

赵彤彤1,赵微1,王丹1,赵国芬1*,刘扬1,张和平2,包秋华2

1(内蒙古农业大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特,010018) 2(内蒙古农业大学,乳品生物技术与工程教育部重点实验室,内蒙古 呼和浩特,010018)

以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 kDa,理论等电点为5.15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白。Ser、Thr、Tyr磷酸化位点个数分别为3、3、7。蛋白质的二级结构主要构成方式为α螺旋、无规则卷曲和β折叠。将此基因连接到pET-28a(+)质粒载体中构建重组质粒pET28a-DH,并转化入大肠杆菌E.coli Transetta (DE3)中获得重组大肠杆菌。重组菌在16 ℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导16 h有可溶性表达,经Western Blot验证确定为重组羟基脂肪酸脱氢酶。通过镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶。重组酶经初步活性检测,结果显示重组酶可以转化10-羟基-顺-12-十八碳烯酸为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,本研究为进一步探明植物乳杆菌P-8转化共轭亚油酸的机制奠定了基础。

关键词 植物乳杆菌P-8;羟基脂肪酸脱氢酶;生物信息学;共轭亚油酸;重组表达

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018180

第一作者:硕士研究生(赵国芬教授为通讯作者,E-mail:guofenzhao@126.com)。

基金项目:国家自然科学基金(31560443);内蒙古自然科学基金(2017MS0306)

收稿日期:2018-07-03,

改回日期:2018-07-17

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)是多种含有共轭双键十八碳二烯酸的总称,它具有多种营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、减肥等[1-3]。目前合成CLA的方法主要有化学法和生物法2种。化学法合成的CLA产品中各种异构体形式并存,而且产品还存在溶剂残留问题[4]。生物法转化CLA产物中具有生理活性的异构体形式含量较高,产品安全性较高。目前研究表明,一些瘤胃微生物、丙酸杆菌、乳酸菌和双歧杆菌能够将亚油酸(linoleic acid,LA)转化为CLA[5]。相比于严格厌氧且生长较慢而难以用于大规模生产的瘤胃菌、具有致病性的痤疮丙酸杆菌,乳酸菌具有易大规模培养、食品级微生物等优点,所以利用乳酸菌转化CLA已经是当前的研究热点[6-7]

研究表明,大部分乳酸菌将LA转化为CLA的通路是先将LA水合为10-羟基-顺 12-十八碳烯酸(10-hydroxy-cis 12-octadecenoic acid,10-HOE),后经脱氢、双键移位、水合、脱水等多步反应而转化为CLA,需要脂肪酸水合酶(fatty acid hydratase,CLA-HY)、羟基脂肪酸脱氢酶(hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH)与乙酰乙酸脱羧酶(fatty acid isomerase,CLA-DC)组成的亚油酸异构酶系共同参与代谢过程[8]CLA-DH在亚油酸在乳酸菌的代谢中起着重要的作用,可以将10-HOE转化为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸。很多羟基脂肪酸都可以作为良好底物被转换为相应的氧代脂肪酸[9],并且很多氧代脂肪酸也被发现有独特的生理功能,例如10-氧代-顺-12-十八碳烯酸激活过氧化物酶体增生激活受体(peroxisome proliferative activated receptor, PPARg)诱导脂肪细胞分化,13-氧代-9,11-十八碳二烯酸可以改善肥胖症引起的血脂异常和肝脂肪变性等[10]

图1 部分乳酸菌中LA转化为CLA的过程

Fig.1 The process of LA conversion to CLA inLactobacillus plantarum

内蒙古是乳制品生产研发大省,植物乳杆菌P-8是源自内蒙古乌拉特中旗的优良发酵菌种,经研究表明该菌具有产生CLA的能力,但产量较小且具体机制尚不清楚[11]。本研究对植物乳杆菌P-8中的羟基脂肪酸脱氢酶基因进行了克隆和生物信息学分析,并将其在大肠杆菌中表达,经诱导表达后得到有活性的重组酶CLA-DH。为进一步研究植物乳杆菌P-8中羟基脂肪酸脱氢酶的性质和功能提供了必要条件,为提高植物乳杆菌P-8转化CLA的产量并将其应用于食品、保健品奠定了重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和载体质粒

本实验所用植物乳杆菌P-8和pET-28a(+) Vector由本实验室保藏,大肠杆菌E.coli DH5α Chemically Competent Cell购自北京天根生化科技有限公司,大肠杆菌E.coli Transetta (DE3) Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 酶和试剂

本实验所用限制性内切酶EcoRⅠ、限制性内切酶XhoⅠ、T4连接酶均购自于北京全式金生物技术有限公司;高保真DNA聚合酶KOD plus购自Toyobo公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司;亚油酸购自Sigma公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

利用Primer 5.0软件,根据NCBI中已知的植物乳杆菌P-8的CLA-DH序列以及pET-28a(+)载体的多克隆位点,设计了1对特异性引物(表1),由华大基因完成。

表1 引物序列

Table 1 Primers used in this study

名称序列(5’→3’)长度酶切位点DH-FCGCGGATCCATGAAAGATTTTAAAGATAA29EcoRⅠDH-RCCGCTCGAGTTACATGATACCGTCCAT-GATGTGC34XhoⅠ

注:划线部分为引入的酶切位点。

1.2.2 CLA-DH基因的扩增与序列分析

以植物乳杆菌P-8基因组为模板用高保真KOD plus酶进行PCR扩增,PCR反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,50℃退火40 s,68℃延伸1 min,30个循环;68℃保温10 min。产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,并将目的条带切胶后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收,送往华大基因进行测序。测序结果使用Blast进行确认,使用DNAstar翻译成氨基酸序列进行分析。使用Proparam对序列进行蛋白质理化性质的预测分析,使用Protscal进行蛋白质亲疏水性预测分析,使用TMHMM进行跨膜区预测分析,使用Net Phos3.1 Server进行磷酸化位点分析,使用PSLpred进行亚细胞定位分析,使用SOPMA和Predict Protein进行二级结构分析。

1.2.3 重组菌的构建

将纯化后的PCR产物和pET-28a(+)质粒分别通过EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,切胶回收后16 ℃连接过夜,将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α,涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选。挑取转化子,扩大培养后提取质粒,经菌液PCR和质粒双酶切验证后,获得重组质粒pET-28a-DH。将重组质粒pET-28a-DH转化至大肠杆菌E.coli Transetta (DE3),同时转化pET-28a(+)空质粒作为阴性对照,获得重组菌E.coli Transetta/pET-28a-DH和对照菌E.coli Transetta/pET-28a。

1.2.4 重组酶的诱导表达

挑取重组菌E.coli Transetta/pET-28a-DH和对照菌E.coli Transetta/pET-28a单菌落分别接种于20 mL LB培养基(含有50 μg/mL卡那霉素和150 μg/mL氯霉素)中37 ℃、180 r/min培养过夜,按2%接种量转接入1 L LB培养基中,37 ℃、180 r/min振荡培养至OD600为0.6,加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L,16 ℃、130 r/min诱导培养16 h。离心收集菌体并重悬于KPB缓冲液(20 mmol/L,pH值6.5)中,在冰浴中进行超声破碎,12 000 r/min离心1 h,得上清和沉淀。通过12% SDS-PAGE进行分离后,转至NC膜上,加入封闭液封闭过夜。然后用一抗(1∶2000稀释)、二抗(1∶1000稀释)先后孵育结合1 h,通过DAB显色法进行显色反应。

1.2.5 纯化重组酶

利用pET-28a(+)质粒中的his-tag标签,使用镍柱对重组酶进行纯化。将离心得到的上清加入到镍柱中,用含有不同浓度咪唑的缓冲液进行洗脱,分别收集洗脱液进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重组酶活性检测

实验室之前已成功构建有活性的植物乳杆菌P-8的脂肪酸水合酶工程菌E.coli BL21/pET-28a-HY,实验证明其能够将LA水合为10-HOE。收取1.2.4中的离心上清液作为粗制酶液进行活性检测,反应体系为1 mL,其中包含4 μg亚油酸、2 μg吐温80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL CLA-DH粗酶液,KPB缓冲液补至1 mL。对照组包含4 μg亚油酸、2 μg吐温80、0.1 mmol/L FAD、5 mmol/L NADH、200 μL CLA-HY粗酶液、200 μL pET-28a(+)空质粒粗酶液,KPB缓冲液补至1 mL。反应在37 ℃、120 r/min的条件下进行6 h后,加入5 mL正己烷充分振荡30 s,3 000×g离心5 min,吸取上层正己烷至干净试管中用N2吹干,加入2 mL 4%盐酸-甲醇溶液50 ℃水浴20 min进行甲酯化,再次萃取脂肪酸后用N2吹干,加入100 μL正己烷回溶,使用GC-MS检测分析。GC-MS条件: Finnigan Trance GC /FinniganTrance MS (美国Thermo),色谱柱: Agilent DB-WAX(30 m×0.250 mm×0.25 μm)。升温程序: 40 ℃保持0.5 min后以20℃/min的速度升至280 ℃,保持10 min。

2 结果与分析

2.1 CLA-DH基因的扩增

在NCBI中查找到植物乳杆菌P-8的CLA-DH序列,全长861 bp。以植物乳杆菌P-8基因组为模板,PCR扩增短链脱氢酶CLA-DH基因,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到约860 bp大小的片段(图2),与预期的理论值大小相同。将PCR产物胶回收后,送往华大基因测序,测序结果使用Blast验证,结果显示得到正确的植物乳杆菌P-8中CLA-DH

M-DNA Marker; 1-CLA-DH PCR产物

图2 CLA-DH基因PCR产物电泳图

Fig.2 Electrophoresis gram of PCR product of CLA-DH

2.2 CLA-DH的生物信息学分析

经序列分析表明,CLA-DH基因序列共编码286个氨基酸(图3),其中极性氨基酸127个,非极性氨基酸132个,编码蛋白的理论分子质量为32.091 8 kDa,理论等电点为5.15。不稳定指数为25.53,属于稳定蛋白,脂肪系数为85.48。

对CLA-DH进行磷酸化位点分析,结果表明存在3个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点和7个Tyr磷酸化位点。对CLA-DH进行疏水性分析,结果表明第142位的丙氨酸疏水性最强,第201位的组氨酸亲水性最强,总平均亲水系数为-0.179,所以CLA-DH是1个亲水性蛋白。对CLA-DH进行跨膜区分析,结果表明CLA-DH不含跨膜区。对其进行细胞定位预测,结果显示CLA-DH为细胞质蛋白。对CLA-DH二级结构进行预测,发现其二级结构主要为40%左右的α-螺旋、30%左右的无规则卷曲和20%左右的β-折叠。

图3 CLA-DH的氨基酸序列

Fig.3 Amino acid sequence of CLA-DH

2.3 重组质粒的构建

将纯化后的CLA-DH基因和pET-28a(+)质粒分别经EcoRⅠ和XholI双酶切后回收酶切产物,连接后转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞,挑取转化子进行培养后提取质粒进行双酶切验证,获得大小分别为5 300 bp和860 bp的片段(图4),与理论值相符。为进一步验证阳性克隆,将酶切验证正确的质粒测序,结果显示已经插入正确的目的基因,将重组质粒保藏并命名为pET-28a-DH

M-DNA marker;1-双酶切产物

图4 重组质粒pET-28a-DH双酶切鉴定电泳图

Fig.4 Electrophoresis gram of recombined plasmid pET-28a-DH by two enzymes digestion

2.4 重组菌的构建与诱导表达

将pET-28a-DH和pET-28a(+)空质粒转化至E.coli Transetta (DE3)感受态细胞中,获得重组菌E.coli Transetta/pET-28a-DH和对照菌E.coli Transetta/pET-28a。将诱导表达后菌体用KPB缓冲液洗涤2遍。超声破碎离心后收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析和Western Blot分析。结果显示与对照菌相比,重组菌E.coli Transetta/pET-28a-DH在上清部分约38 kDa处有1条明显的目标蛋白条带(图5),与预测目标蛋白大小基本一致,表明获得CLA-DH的可溶性表达,Western Blot结果也再次验证目标蛋白成功表达。

A-诱导表达后重组菌株蛋白的SDS-PAGE;B-Western Blot检测;M-蛋白Marker;1-阴性对照全细胞;2-上清;3-沉淀

图5 诱导表达后重组菌株蛋白的SDS-PAGE和Western Blot检测

Fig.5 SDS-PAGE analysis of the proteins from recombinants induction

2.5 重组酶的纯化

粗酶液与镍柱亲和后,分别用20、40、60、80、100、200 mmol/L咪唑洗脱液进行梯度洗脱,将洗脱液进行SDS-PAGE分析,结果显示200 mmol/L咪唑洗脱液中得到大量单一的目的蛋白(图6)。

M-蛋白Marker;1-破碎上清液;2-20 mmol/L咪唑洗脱液;3-40 mmol/L咪唑洗脱液;4-60 mmol/L咪唑洗脱液;5-80 mmol/L咪唑洗脱液;6-100 mmol/L咪唑洗脱液;7-200 mmol/L咪唑洗脱液

图6 镍柱纯化重组酶的SDS-PAGE分析

Fig.6 SDS-PAGE analysis of purification of recombinant enzymes by Ni-NTA affinity chromatography

2.6 重组酶活性检测

实验室前期已成功构建的工程菌亚油酸水合酶大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET-28a-HY。亚油酸标准品经GC检测在12.12 min出峰,加入CLA-HY粗酶液与亚油酸反应后经GC-MS检测在14.8 min出现新的产物峰,经MS碎片结果及理论断裂方式分析确定为10-HOE。同时加入CLA-HY和CLA-DH粗酶液进行反应后,经GC-MS检测在14.11 min出现新的产物峰(图7),结合MS结果及理论断裂方式(图8)分析该物质为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,证明CLA-DH能够将10-HOE转化为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸。

图7 E.coli BL21/pET-28a-HYE.coli BL21/pET-28a-DH共同反应LA的GC结果

Fig.7 GC results of LA co-reacting with E.coli BL21/pET-28a-HY and E.coli BL21/pET-28a-DH

图8 产物的MS碎片结果及理论断裂方式

Fig.8 MS fragmentation results of the product and theoretical fracture mode

3 讨论

植物乳杆菌转化LA生成CLA需要CLA-HY、CLA-DH和CLA-DC组成的亚油酸异构酶系共同参与代谢过程。植物乳杆菌P8可以转化LA生成CLA,而且基因组中也存在这3种酶,但其转化CLA能力较弱,说明可能是3种酶性质不同造成转化能力不同。CLA-DH分别催化具有内部羟基或氧代基团的脂肪酸的脱氢和氢化,是植物乳杆菌生物转化CLA过程中的关键步骤。有研究表明CLA-DH属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)家族,与其他SDRs有很大的相似性,但关于SDR家族中的羟基脂肪酸脱氢酶报道很少[8]。研究CLA-DH的酶学性质有助于探明植物乳杆菌P-8转化CLA能力较弱的原因,所以本实验克隆得到植物乳杆菌P-8中的CLA-DH基因,对其进行了生物信息学分析,并构建了CLA-DH的重组大肠杆菌,通过诱导表达得到有活性的CLA-DH重组酶,为深入研究CLA-DH的酶学性质提供了实验基础,而且为进一步提高CLA产量并将其广泛应用于食品、药品、保健品中奠定了理论基础。

参考文献

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Cloning and activity identification of hydroxy fatty acid dehydrogenase from Lactobacillus plantarum P-8

ZHAO Tongtong1,ZHAO Wei1,WANG Dan1,ZHAO Guofen1*,LIU Yang1,ZHANG Heping2,BAO Qiuhua2

1(College of Life Science,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China) 2(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Bioengineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

ABSTRACT The hydroxy fatty acid short chain dehydrogenase gene (CLA-DH) was amplified by PCR using the genomic DNA of Lactobacillus plantarum P-8 as a template. Bioinformatics analysis showed that this gene encoded 286 amino acids with a theoretical molecular mass of about 32 kDa, and a theoretical isoelectric point of 5.15. It was a hydrophilic cytoplasmic protein with no trans-membrane region. Its phosphorylation sites of serine, threonine, and tyrosine were 3, 3, and 7, respectively. The secondary structure of the protein mainly composed of α-helices, random coils, and β-sheets. The recombinant plasmid pET28a-DH was constructed by inserting CLA-DH into pET-28a(+), and then transformed into E.coli Transetta to obtain a compounded E.coli for expression. The recombinant bacteria had soluble expression at 16 ℃ after 16 h induction with 0.1 mmol/L IPTG. The results from Western Blot confirmed that the expression was recombinant CLA-DH. The purified recombinant CLA-DH was obtained by nickel column affinity chromatography. The preliminary activity assay of the recombinant CLA-DH showed that 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid could be converted into 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid, which laid a foundation for further analysis of the mechanism of transforming conjugated linoleic acid by L. plantarum P-8.

Key words Lactobacillus plantarum P-8; hydroxy fatty acid dehydrogenase; bioinformatics; conjugated linoleic acid; recombinant expression