在氨基酸、有机酸以及抗生素等的发酵法生产中，菌体细胞膜的通透性大小对其产量有一定的影响，这其中尤以谷氨酸的生产最为重要[1]。谷氨酸产量的高低与否，在很大程度上取决于菌体细胞膜通透性的大小[2]。本研究以“生物素亚适量”型菌株为研究对象，生物素亚适量型谷氨酸生产菌具有生长速度快、不易染菌等优势，但同时存在着菌体转型周期长、产酸低的缺陷[3]。主要原因是细胞膜通透性低和相关酶活力过早下降。另外，从代谢途径来看，由于生物素的限制作用，使得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力下降，CO2固定反应减弱，菌体生长和产酸受到抑制；而如果生物素供应适量则菌体细胞膜的通透性将会极大降低，产酸将会严重下降。
超声技术主要是利用超声波能加速和控制化学反应，提高化学产率，改变反应历程和改善反应条件[4-5]。超声波作为一种声波，它具有特殊的能量作用形式，当强度超过一定值时，会使媒质的状态、组分、结构或功能发生变化，超声波所引起的空化泡崩溃时，在极短时间和极小空间产生瞬时高温和高压[6-7]，并伴有强烈的冲击波和微射流，使细胞的膜脂质双分子层结构发生改变，细胞膜短时间内局部破裂，从而改变细胞膜通透性[8-11]。当超声波应用于谷氨酸发酵时，它不仅能够加快菌体的物质交换速率，提高酶促反应速率以及增强菌体代谢强度，从而缩短发酵时间，改善生物反应条件，更重要的是能够较大提高细胞膜的通透性和选择性，即使在生物素亚适量的条件下，也能进一步提高细胞膜通透性，菌体内的谷氨酸能得以及时分泌，并由此解除高浓度谷氨酸引起的反馈调节作用[12-14]。
因此，本研究将采用超声辅助细胞转型的谷氨酸发酵工艺，提高菌体细胞膜通透性，强化代谢途径，实现谷氨酸高效生产[15]。本研究做到人为地改变细胞膜的通透性，这有利于代谢产物在细胞外的积累，使代谢按照人们希望的方向进行，是实现代谢人工调控的重要方法之一，具有实际的意义[16]。
1 材料与方法
1.1 菌种
生物素亚适量型高产菌株(谷氨酸棒状杆菌GDK-168)，由天津科技大学代谢工程研究室保藏。
1.2 培养基
1.2.1 活化斜面培养基
牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，玉米浆20.0 mL/L，琼脂25.0 g/L，pH 7.0。
1.2.2 种子培养基
口服葡萄糖25.0 g/L，玉米浆33.0 mL/L，豆饼水解液22.0 mL/L，K2HPO4·3H2O 2.2 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，蛋氨酸2.0 g/L。
1.2.3 发酵培养基
口服葡萄糖80.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.7 g/L，蛋氨酸2.0 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，FeSO4·7H2O 2.5 mg/L，VB1 0.5 mg/L，糖蜜1.0 g/L，玉米浆4.0 mL/L，豆饼水解液20.0 mL/L。
1.3 主要仪器
LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；MCGS 5 L不锈钢机械搅拌发酵罐、MCGS 30 L不锈钢机械搅拌发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；超声波发生器：邯郸市海拓机械科技有限公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；A300氨基酸分析仪：德国安米诺西斯公司。
1.4 试验方法
1.4.1 超声波辅助细胞转型的谷氨酸发酵工艺
在发酵罐中插入耐高温超声波探头，在发酵开始之前可以随罐灭菌，在发酵开始后，打开超声波控制器，在一定的条件下(本仪器固定功率500 W，频率20 kHZ，可调节不同振幅)进行不同时间和间隔时间的超声波处理，至发酵8 h停止超声。具体超声发酵装置如图1所示。
图1 超声辅助细胞转型的谷氨酸发酵装置图
Fig.1 Ultrasonic assisted cell transformation of glutamic acid fermentation device
1.4.2 单因素试验
(1)超声时间对谷氨酸发酵的影响。在超声振幅为70%，间隔时间为10 min的条件下，对不同超声时间(30、40、50、60、70 s)进行研究，获取最佳超声时间。
(2)振幅对谷氨酸发酵的影响。在最佳超声时间，间隔时间为10 min的条件下，对不同超声振幅(55%、60%、65%、70%、75%)进行研究，获得最佳超声振幅。
(3)间隔时间对谷氨酸发酵的影响。在最佳超声振幅，最佳超声时间的条件下，对不同间隔时间(4、6、8、10、12 min)进行研究，确定最佳间隔时间。
1.4.3 正交试验
在单因素试验的基础上确定实验因素，超声时间、超声振幅和间隔时间的最佳值分别为50 s、65%和6 min。以OD值、谷氨酸产量和糖酸转化率为考察指标，选用L9(34)正交试验表设计3因素3水平正交试验，对超声辅谷氨酸发酵的关键影响因素进行研究。正交试验因素水平见表1。
表1 超声波辅助谷氨酸发酵正交试验因素水平表
Table 1 Orthogonal test factor level table of ultrasonic assisted glutamic acid fermentation
1.5 检测分析方法
1.5.1 谷氨酸产量及发酵参数的测定
见参考文献[17]和[18]。
1.5.2 有机酸及氨基酸的测定
使用高效液相色谱分析仪进行发酵液中有机酸的检测，应用氨基酸分析仪测定发酵液中氨基酸的含量。
1.5.3 正交试验数据分析
应用正交试验设计助手对实验结果进行极差和方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果分析
2.1.1 超声时间对谷氨酸发酵的影响
在超声振幅为70%，间隔时间为10 min的条件下，不同超声时间对谷氨酸发酵的影响如图2所示。
图2 超声时间对谷氨酸发酵的影响
Fig.2 Effect of ultrasound time on glutamic acid fermentation
可以看出随着超声时间的增加，OD值、谷氨酸产量和糖酸转化率也呈现上升趋势。当连续超声时间超过50 s后，三者开始下降，尤其是谷氨酸产量快速降低。分析可知，适当时长的超声处理可以加快菌体的酶活力，提高菌体生长速度和细胞膜的通透性，进而提高了谷氨酸的分泌和糖酸转化率[19]。但是当连续超声时间太长，势必会对菌体造成一定程度的损伤，不但会降低菌体的生长和产酸速率，而且也会出现抑制作用。选择最佳的超声时间才能达到良好的效果，因此选取50 s作为连续超声时间。
2.1.2 超声振幅对谷氨酸发酵的影响
在超声时间为50 s，间隔时间为10 min的条件下，不同超声振幅对谷氨酸发酵的影响如图3所示。可以明显的看出，在超声振幅低于65%时，OD值、谷氨酸产量和糖酸转化率不断增加，超声振幅高于65%后，三者明显下降。分析可知，超声振幅太低并不能提高菌体生长速度和产酸速率，而过高的超声振幅会对菌体产生较大的损害，降低菌体活力，不利于菌体生长和谷氨酸合成。也因此选择65%作为最佳超声振幅。
图3 超声振幅对谷氨酸发酵的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic amplitude on glutamic acid fermentation
2.1.3 间隔时间对谷氨酸发酵的影响
在超声时间为50 s，超声振幅为65%的条件下，不同超声间隔时间对谷氨酸发酵的影响如图4所示。从图中可以看出，超声时间间隔对OD值、谷氨酸产量和糖酸转化率的影响是很明显的。间隔时间(4 min)太短，也就是超声强度较大，对菌体的损害比较严重，不但没能促进菌体生长和谷氨酸分泌，反而有一定程度的抑制作用。随着间隔时间(6 min)的增加，超声强度适宜，OD值、谷氨酸产量和糖酸转化率都得到了提升。而间隔时间过长时，虽然OD值的增长少许降低，但是对细胞膜的损伤效果太低，又由于菌体自身的细胞膜修复功能，因此细胞膜的通透性并未得到提高，因此谷氨酸产量和糖酸转化率不断下降。故选择6 min作为最佳超声间隔时间。
图4 间隔时间对谷氨酸发酵的影响
Fig.4 Effect of interval time on glutamic acid fermentation
2.2 正交试验结果分析
据表1所设计的正交试验，其实验结果见表2，方差分析见表3。
表2 超声波辅助谷氨酸发酵正交试验设计及结果
Table 2 Orthogonal experimental design and results of ultrasonic assisted glutamic acid fermentation
由正交试验结果和极差(R)分析可知，对于OD值的影响次序为A>B>C，即超声时间>振幅>间隔时间，最佳条件为A2B2C3，即超声时间50 s、振幅65%、间隔时间7 min；对谷氨酸产量的影响次序为B>A>C，即振幅>超声时间>间隔时间，最佳条件为A2B2C1，即超声时间50 s、振幅65%、间隔时间5 min；对糖酸转化率的影响次序为B>A>C，即振幅>超声时间>间隔时间，最佳条件为A2B2C1，即超声时间50 s、振幅65%、间隔时间5 min。另一方面，由方差分析可知，超声时间和振幅不仅对OD值有显著影响，而且对谷氨酸产量和糖酸转化率也有显著影响；而间隔时间只对OD值有影响显著。综合考虑以上实验结果，在既满足一定量OD值的同时，又能提高谷氨酸产量和糖酸转化率，因此最佳超声条件选择A2B2C1，即超声时间50 s、振幅65%、间隔时间5 min。
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
2.3 验证实验结果分析
依据正交试验所得最佳超声条件，进行3批次平行发酵验证，所得试验结果如图5所示。
A-对照发酵的OD值；C-谷氨酸产量；E-糖酸转化率;B-最佳超声条件发酵的OD值;D-谷氨酸产量;F-糖酸转化率
图5 最佳超声条件发酵与对照发酵的对比
Fig.5 Comparison between optimal ultrasonic condition fermentation and control fermentation
由图5分析可知，无论是OD值，还是谷氨酸产量和糖酸转化率，超声发酵都比对照发酵有一定程度的提升。对照发酵的开始产酸时间(即谷氨酸菌体开始完成由谷氨酸非积累型菌体向谷氨酸积累型菌体的转变)一般为4 h，而超声发酵开始能够检测到谷氨酸的时间为2 h，并且产酸速率迅速上升。同时结合镜检发现，2 h时超声发酵的部分谷氨酸菌体已经拉长、膨大成为了产酸型菌体。因此，超声发酵开始产酸的时间提前了2 h(如图6所示)。
图6 最佳超声条件下发酵对菌体转型时间和副产物的影响
Fig.6 Effect of optimal ultrasound conditions on bacterial transformation time and byproducts
超声结束时间之所以选在发酵8 h，一方面是因为谷氨酸棒状杆菌的细胞壁较厚，对细胞膜有一定的保护作用，超声时间太短，并不能起到损伤细胞膜以提高通透性的作用；另一方面，菌体自身有一定的细胞膜修复功能，因此要有足够的超声时长。8 h镜检发现，几乎所有菌体已完成谷氨酸分泌的转型，不需要对细胞膜进行更多的损伤，同时OD值也即将达到最大值，菌体的活力即将达到最高，如果继续进行超声处理，势必会对菌体造成严重损害，进而菌体活力也会下降，因此选择8 h停止超声处理。总的来看，超声发酵的OD值为82.5，较对照发酵的72.5，提高了13.8%；谷氨酸产量为168 g/L，较对照发酵的151 g/L，提高了11.3%；糖酸转化率为68.2%，较对照发酵的65.4%，提高了4.3%。
另一方面，由于菌体活力、谷氨酸产量的提高，溶解氧量的提高[20]，可知TCA循环的速率和通量也得到了提升，而由糖酵解所得的丙酮酸也会更多的进入三羧酸循环而不会过多积累[21-22]，因此由丙酮酸所产生的副产物乳酸和丙氨酸也分别由对照发酵的3.6、2.54 g/L降低至超声发酵的2.3、1.75 g/L，如图6所示。
3 结论
超声辅助细胞转型的谷氨酸发酵工艺，不但能够加快菌体生长速率，提高菌体活力，提前完成菌体转型，而且能进一步提高菌体细胞膜通透性，谷氨酸产量和糖酸转化率。本研究通过单因素试验和正交试验确定了超声辅助谷氨酸发酵的最佳条件为超声时间50 s、振幅65%、间隔时间5 min，发酵开始进行超声处理，至8 h结束。最终OD值提高13.8%，谷氨酸产量提高11.3%，糖酸转化率提高4.3%。因此，可以说超声波技术在谷氨酸发酵中的作用是明显且有效的，它能够进一步提高菌体细胞膜的通透性，加快谷氨酸分泌，实现了高效率发酵。
参考文献
[1] 姚辉. 谷氨酸棒杆菌S9114的发酵优化及生物素对谷氨酸发酵的调控[D]. 无锡：江南大学, 2013.
[2] 曹艳, ENOCK MPOFU,丁健,等. 初始生物素含量波动时谷氨酸发酵关键酶系的酶活变化模式[J]. 化工学报, 2012, 63(7):2 188-2 194.
[3] SUSLICK K S, PRICE G J. Applications of ultrasound to materials chemistry[J]. Mrs Bulletin, 1995, 20(4):29-34.
[4] GOH K M, LAI O M, ABAS F, et al. Effects of sonication on the extraction of free-amino acids from moromi and application to the laboratory scale rapid fermentation of soy sauce[J]. Food Chemistry, 2017, 215:200-208.
[5] 刘晓艳,丘泰球,刘石生,等. 超声对细胞膜通透性的影响及应用[J]. 应用声学, 2002, 21(2):26-29.
[6] 吕园丽,吴胜举,马艳,等. 超声对细胞膜通透性影响的研究现状[J]. 菏泽学院学报, 2007, 29(5):67-69.
[7] 王武，杨海鳞，吕霞付，等.超声波在生物发酵工程中的应用[J]. 无锡轻工大学学报, 2002(3)：322-326.
[8] 戴传云,王伯初. 低功率超声波对微生物发酵的影响[J]. 重庆大学学报, 2003, 26(2):15.
[9] RAZA A, LI F, XU X, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapa quadrispinosa using response surface methodology[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 94(Pt A):335-344.
[10] 卢群,丘泰球,刘晓艳,等. 超声物理效应影响细胞膜通透性的研究[J]. 声学技术, 2004, 23(z2):000047-48.
[11] SHI L, WANG B, YANG Y, et al. Application of low intensity ultrasound to biotechnology[J]. Journal of Chongqing University, 2002, 25：148-153.
[12] 洪晴悦,张玉. 超声波辅助提取牡丹籽毛油的工艺优化及脂肪酸组成分析[J]. 食品与发酵工业, 2018,44(3)：159-164.
[13] 高大维,雷德柱. 多波形超声波辐照对啤酒酵母细胞生长的影响[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2000, 28(7):36-39.
[14] 李柏林,储炬,李友荣,等. 在线超声波处理对庆大霉素生物合成的影响[J]. 中国抗生素杂志, 1997(4):250-253.
[15] 孟祥勇,冯东阳,毛健,等. 循环超声波辅助黄酒后发酵风味物质的变化分析[J]. 中国农业科技导报, 2015, 17(5):142-150.
[16] WANG Z, LIU F, HAILE M A, et al. Ultrasound-assisted alcohol fermentation technology[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2016，18(3)：56-67.
[17] 张金玲. 基于生物参数在线检测的谷氨酸发酵及其动力学研究[D]. 济南：齐鲁工业大学, 2014.
[18] 郜培. 基于代谢网络模型的谷氨酸发酵在线优化与控制的研究[D]. 无锡：江南大学, 2006.
[19] 陈宁. 氨基酸工艺学(高校教材)[M]. 北京：中国轻工业出版社, 2007.
[20] 白长胜,韩隽,梁恒宇,等. 谷氨酸发酵过程中溶氧控制条件优化[J]. 食品工业, 2015(4):179-181.
[21] LEE Y J, JANG J W, KIM K J, et al. TCA cycle‐independent acetate metabolism via the glyoxylate cycle in Saccharomyces cerevisiae[J].Yeast, 2011, 28(2):153-166.
[22] 付丙勇. 谷氨酸发酵过程中乳酸的生成规律与策略[J]. 发酵科技通讯, 2010, 39(3):45-47.