培养条件对湛江等鞭金藻生长和油脂产率的影响

董学卫1,李有志1,何庆芳2,3,于金慧2,毕玉平2*

1(广西大学 生命科学与技术学院,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西 南宁, 530004) 2(山东省农业科学院生物技术中心,山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室,农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开发实验室,山东 济南,250100) 3(美国阿肯色大学 应用科学系,美国)

为提高微藻油脂产率和优化培养条件,以湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)为研究对象,探讨了营养方式、光强和NaNO3浓度对微藻生长和产物积累的影响以及培养过程中氮消耗与微藻生长间的关系。结果表明,湛江等鞭金藻生长越快,对氮的吸收越多,兼养较光自养和光异养消耗更多的氮以满足生长需要。充足的氮源和兼养培养条件下,蛋白质积累较多;氮浓度和光强较低条件下,油脂积累较多。光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为75 mg/L、光异养条件下油脂含量最高为46%,生物量质量浓度为0.46 g/L;光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为750 mg/L、兼养培养时生物量质量浓度最高为2.20 g/L,油脂含量为32.77%。综合考虑油脂产率和节约成本等因素,湛江等鞭金藻最高油脂产率80.06 mg/(L·d),在光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为375 mg/L、兼养培养条件下获得,此时多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量也较高(30.82%),因此是生产微藻油脂的合适条件。

关键词 湛江等鞭金藻;兼养;生物量浓度;光强;油脂产率

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017766

第一作者:博士(毕玉平研究员为通讯作者,E-mail:yupingbi@vip.sina.com)。

基金项目:山东省农业科学院青年科研基金(2015YQN32);山东省现代农业产业技术体系建设专项资金(SDAIT-26-09);国家国际科技合作专项项目(2012DFA30450);泰山学者海外人才基金资助专项(tshw20091014)

收稿日期:2018-05-14,

改回日期:2018-07-31

微藻具备光效高,生长速度快,投入低等优点,是多种高附加值天然产物、生物活性化合物的重要来源[1]。此外,微藻可在海水、苦咸水、市政污水等非农用水中培养,减少了新鲜水消耗;也可在滩涂、盐碱地等边际土地上大规模培养,做到“不与人争粮、不与人争地”[2]。但是微藻生物量浓度低,造成收获耗能大、新鲜水消耗多,导致微藻及其油脂生产成本高。因此,优化微藻培养条件,提高微藻的油脂产率和培养操作的灵活性,对充分开发利用湛江等鞭金藻具有重要的意义。

影响微藻生长和油脂积累的因素一般包括:光、碳源、氮磷等无机成分、营养方式等。光强对微藻生长的影响可分为光限制、光饱和及光抑制。到达光饱和之前,增强光强可以促进微藻生长[2],但是油脂积累量不高,有利于微藻生长和油脂积累的最佳光强往往是不同的[3]。氮是组成核酸和蛋白质的主要元素,与微藻初级代谢相关[4]。充足的氮可以促进微藻生长,但缺氮条件却有利于油脂积累[2]。微藻营养方式分为光自养、异养、兼养等,对其生长和油脂积累具有不同影响[5]。一般情况下,微藻在生长条件不利情况时能够大量产生油脂,作为碳和能量的储存形式[2],但通常以较低的生物量产率为代价。油脂产率代表油脂含量和生物量综合影响,是表征微藻油脂生产能力最合适的性能指标,为提高湛江等鞭金藻开发利用的经济性,需要优化微藻培养条件,提高其油脂产率[6]。目前,微藻培养的操作模式已进行了广泛研究,主要包括分批、分批补料、连续、半连续、两步法等[5],但这些培养操作模式均有不足之处。如两步培养需将微藻从营养丰富培养基转换到营养缺乏培养基,大规模培养时操作成本高;补料分批和连续培养常在营养充足条件下进行,微藻油脂/多糖含量未必高,往往导致下游加工成本更高。如果可以通过一步培养操作实现微藻培养和油脂积累的目标,可以降低生产成本,提高操作效率。

因此,本文以湛江等鞭金藻为研究对象,通过测定生长和生化组分变化,研究NaNO3浓度,光强和营养方式对生长和油脂积累的影响,并探究生长和氮消耗间的关系,以期为微藻油脂的商业化提供指导。

1 材料与方法

1.1 藻种和培养基

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)来自山东省农科院生物技术中心藻种资源库,藻株用人工海水改良f/2培养基培养[7]

1.2 分批培养实验设计

湛江等鞭金藻在500 mL的锥形瓶中培养,使用300 mL灭菌的改良f/2培养基,光周期为14∶10,日光灯管提供光照,温度控制在(25±1) ℃,通入纯空气或含CO2的空气。培养条件见表1。

表1 不同培养条件的特征

Table 1 Characteristics of different cultivation conditions

培养方式能源碳源形式本实验中用到的碳源光自养光无机碳含2% CO2的空气,通气比0.2 vvm兼养光和有机碳无机和有机碳含2% CO2的空气,通气比0.2 vvm和 0.2 g/L的葡萄糖光异养光有机碳0.2 g/L葡萄糖, 10-6 mol/L DCMU和纯空气,通气比为 0.2 vvm

对于光自养培养,提供不同光强,无机碳作碳源(含2% CO2空气流)。对于兼养培养,用葡萄糖(0.2 g/L)和无机碳(含2% CO2空气流)作碳源;对于光异养培养,培养基中提供葡萄糖(0.2 g/L),并添加10-6 mol/L 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU),持续通入空气。所有通气培养中,通气比为0.2 vvm。为评估氮浓度对湛江等鞭金藻生长和油脂积累影响,以NaNO3为氮源,培养物分别接种于氮质量浓度分别为75、375和750 mg/L的改良f/2培养基中。分别选取低光强为100 μmol/(m2·s)(low light, LL)和高光强为200 μmol/(m2·s)(high light, HL)的光照,以研究光强对湛江等鞭金藻生长和油脂积累的影响。实验过程中,每天测细胞密度和培养基中氮浓度,培养结束后测干重和各生化组分含量。

1.3 微藻生长和生化成分测定

细胞个数采用显微镜直接镜检计数。微藻在6 000×g条件下离心5 min,纯化水洗涤2次,放入预干燥和称重的培养皿中,40 ℃干燥至恒重,重量分析法测干重。总脂采用BLIGH等的方法测定[8]。多糖采用苯酚硫酸法,葡萄糖为标准物质[9]。蛋白质采用考马斯亮蓝染色法测定,以牛血清白蛋白为标准[10]。采用DONG等[11]的方法将藻类生物质直接甲酯化,气相色谱分析脂肪酸甲酯组成。

1.4 生物量产率和油脂产率测定

生物量产率(Pbiomass)按公式(1)计算:

(1)

油脂产率(Plipid)按公式(2)计算:

(2)

1.5 氮浓度测定

通过紫外分光光度法测OD220nm[12],由标准曲线换算成NaNO3浓度,该方法原理是人工海水主要成分在紫外域具有吸收光谱。

1.6 统计学分析

所有结果以平均值±标准偏差表示。所有数据用SPSS 10(Chicago,IL,USA)中的单向ANOVA(方差分析)和Duncan多重范围试验(P<0.05)进行评估。

2 结果与分析

2.1 培养条件和营养方式对湛江等鞭金藻生物量浓度影响

如图1所示,光强分别为100和200 μmol/(m2·s)时,不同营养方式下,随NaNO3质量浓度升高(从75 mg/L升高到750 mg/L),微藻生物量浓度在逐步增大。培养9 d后,NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)光异养时生物量浓度最低为0.46 g/L,NaNO3质量浓度为750 mg/L,光强为200 μmol/(m2·s)兼养时生物量质量浓度最高为2.20 g/L。氮是合成蛋白质、核酸等生物大分子的必需元素,增加氮供应生物量浓度将增加,这与其他研究结果一致[13],也有研究证明,氮浓度较低时会导致细胞营养不足,从而影响微藻的正常生长[4]

在相同的光强和NaNO3质量浓度条件下,兼养培养可获得最高的生物量浓度(0.78~2.2 g/L,平均为相同条件下光自养培养的1.34倍,光异养培养的2.28倍),表明湛江等鞭金藻可同时利用CO2和葡萄糖2种碳源,并获得更高产量。兼养培养具有将有机碳和无机碳同化的优势,可将外部提供的或呼吸过程中产生的CO2进行同化[14]。特别是葡萄糖存在下,通过光合作用将有氧呼吸时释放的CO2进行再固定被证明是兼养培养条件下生物质合成的关键[15]。此外,兼养培养还可以减少自养培养时的自遮蔽问题,也可以降低异养时的成本增加问题[14],因此兼养培养(以有机碳如葡萄糖作为补充)在微藻生物质和次生代谢产物生产中被广泛应用[16]

在相同的NaNO3质量浓度条件下,光自养培养湛江等鞭金藻时,高光强(200 μmol/(m2·s))时生物量浓度增大,最高为1.76 g/L;光异养和兼养培养湛江等鞭金藻时,低光强(100 μmol/(m2·s))时生物量浓度高,兼养时最高为2.2 g/L,光异养时最高为0.97 g/L。光是合成ATP和NADPH所必需的因素,它驱动产生碳骨架光合作用的暗反应[4],对微藻的生化组成和生物量有影响[17],因此光强是微藻培养的主要限制因素之一。光强过低或过高,微藻均不能有效生长[2]。较高的光强会使光合速率逐步增加到最大点,之后逐渐降低,直到光合速率被光呼吸和光抑制平衡。本实验结果显示,增加光强提高了湛江等鞭金藻光自养时生物量浓度,RODOLFI等[18]在平板式光生物反应器中培养微拟球藻Nannochloropsis时也发现随光强增加生物量产率升高的现象。LV等[19]证明与低光强和高光强相比,光强为60 μmol/(m2·s)时,小球藻C. vulgaris生物量浓度和油脂含量均升高。

图1 不同营养方式、光强、NaNO3质量浓度对湛江等鞭金藻生物量的影响

Fig.1 Biomass production performance of I. zhanjiangensis grown on f/2 media under different trophic modes (photoautotrophic,mixotrophic and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentrations

综合分析以上结果可知,NaNO3质量浓度为750 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)、兼养培养可获得最高生物量,因此是分批培养湛江等鞭金藻时获得生物量的合适培养条件。

2.2 培养条件和营养方式对湛江等鞭金藻生化成分影响

不同培养条件和营养方式下湛江等鞭金藻生化成分见图2。

图2 不同营养方式(光自养、兼养、光异养)、光强和NaNO3质量浓度对湛江等鞭金藻生化成分的影响

Fig.2 Biochemical components of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different trophic modes (photoautotrophic, mixotrophic, and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentration

在通入CO2气体条件下(光自养和兼养),多糖含量是30%~40%;当使用葡萄糖为唯一碳源条件下(光异养),多糖含量稍低。与光自养相比,兼养和光异养条件下多糖含量下降,而总脂含量增加。最高多糖含量(50.8%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为200 μmol/(m2·s)、光自养条件下获得,最高油脂含量(46.0%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)、光异养条件下获得。兼养培养时油脂含量高于光自养培养。一般而言,兼养培养时,部分能量用于生长,其余能量以碳水化合物和油脂形式储存,使得微藻细胞肿胀,体积增大,油脂含量升高[20]。碳水化合物和油脂的数值成反比,如GOODSON等[21]和LI等[16]分别在研究C. sorokinianaChlamydomonas reinhardtii时发现,油脂合成在很大程度上依赖于淀粉降解,因为叶绿体中淀粉较少时,可以为储存油脂提供更多空间。

在相同的营养方式和光强下,NaNO3浓度越低,湛江等鞭金藻油脂和多糖含量越高;NaNO3浓度越高,蛋白质含量越高。缺氮培养是微藻油脂生产中应用最广泛的营养胁迫,氮饥饿下刺激油脂积累主要包括以下两种机制。一方面,由于大多数氨基酸合成中需要氮,所以在氮饥饿时蛋白质含量降低,并且导致细胞通常处入细胞周期的停滞期,可表达更高水平的应激标记代谢物如碳水化合物和油脂[22]。另一方面,氮饥饿条件下,微藻积累更多的油脂,也可能是将碳水化合物转化和重新分配成脂肪,从而使油脂含量增加[23]。WASE等[24]通过基于GC-MS的代谢组学和ITRAQ标记的蛋白质组学分析发现,氮饥饿时,糖酵解、TCA循环、淀粉、油脂代谢、氮同化、氨基酸代谢和氧化磷酸化所涉及的酶增强,相反,卡尔文循环、光收获复合体、乙醛酸循环、一碳代谢、戊糖磷酸途径和核糖体的酶则减少。

相同营养方式下,氮浓度相同时,光强增加导致湛江等鞭金藻总脂含量降低,对绿色巴夫藻Pavlova lutheri和三角褐指藻Phaeodactylum. tricornutum研究中也发现了相同规律[25-26]。一般而言,光强升高时蛋白含量降低,而总脂和多糖含量增加[22]。微藻倾向于积聚油脂,而不是碳水化合物,因为积累油脂可以避免光损伤现象发生,同时油脂作为能量储存比碳水化合物更有效[2]。如HO等[27]研究发现,高光强在微藻积累中性脂(TAG)或类胡萝卜素时起刺激作用,在高光强(300 μmol/(m2·s))时,衣藻Chlamydomonas sp. JSC4油脂产率为312 mg/(L·d),油脂含量显著高于低光强(30 μmol/(m2·s))时的油脂含量。本研究结果表明,湛江等鞭金藻在光强和NaNO3浓度升高时总脂含量降低,低氮和低光强利于促进湛江等鞭金藻总脂积累。这可能是多种压力下导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加,造成脂肪酸和TAG生物合成相关的酶发生氧化损伤,使得碳流向其他储存组分,从而造成油脂含量降低[28]

2.3 培养条件和NaNO3浓度对油脂产率的影响

从表2中看出,光强为200 μmol/(m2·s)条件下,油脂产率呈现先增大后降低的趋势;光强为100 μmol/(m2·s)条件下,油脂产率逐步增大,最大油脂产率80.16 mg/(L·d)在低光强兼养时得到;但在低光强兼养培养、NaNO3质量浓度为375 mg/L时,油脂含量更高(37.40%)。综合考虑油脂含量和最终获得的生物量浓度,光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为375 mg/L兼养培养是湛江等鞭金藻大量培养生产油脂的最适培养条件,同时,较高的油脂含量利于下游处理,降低油脂生产成本。此外,与等鞭金藻Isochrysis sp. 的37.8 mg/(L·d)[19],小球藻Chlorella zofingiensis的 36.00 mg/(L·d),小球藻C. vulgaris的27.0~35.0 mg/(L·d),微拟球藻Nannochloropsis oceanica的56.91 mg/(L·d),绿球藻Chlorococcum pamirum的41.00 mg/(L·d),栅藻Scenedesmus sp.的20.70 mg/(L·d)[29]等研究结果相比,本实验中获得的油脂产率更高。

表2 不同NaNO3质量浓度营养方式和光强下湛江等鞭金藻的油脂产率

Table 2 Lipid productivity of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium with different NaNO3 concentration under different trophic modes (photoautotrophic, photoheterotrophic and mixotrophic cultivation) and light intensity

ρ(NaNO3)/(mg·L-1)油脂产率/(mg·L-1·d-1)光自养光异养兼养高光强低光强高光强低光强高光强低光强75040.89±6.2944.29±3.7623.55±1.6639.19±3.9963.43±2.3680.16±6.6237544.63±3.0037.87±2.7224.42±2.1337.57±6.1765.60±3.4980.06±3.697520.55±2.8418.97±1.8617.34±1.6123.36±1.9630.87±1.6243.24±3.50

注:高光强: 200 μmol/(m2·s);低光强: 100 μmol/(m2·s)

2.4 培养条件和营养方式对微藻生长和氮源消耗的影响

不同培养条件和营养方式下,细胞密度和氮消耗比较见图3。

▲-光异养/高光强;■-兼养/高光强;◀-光自养/高光强;▼-光异养/低光强;◆-兼养/低光强;□-光自养/低光强

图3 f/2培养基中不同培养条件下湛江等鞭金藻生长动力学和相应的氮消耗

Fig.3 Growth kinetics of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different cultivation conditions and corresponding nitrogen consumption

注:每个点代表3次重复的平均值。a, d分别为NaNO3质量浓度为75 mg/L时的生长和氮消耗曲线;b, e分别为NaNO3质量浓度为375 mg/L时的生长和氮消耗曲线;c, f分别为NaNO3质量浓度为750 mg/L时的生长和氮消耗曲线。

随培养时间延长,各组细胞密度均有不同程度增加。光异养条件下生长慢,最高细胞密度仅为52×106 cells/mL,兼养培养比光自养和光异养培养生长快,兼养和光自养培养9 d最大细胞密度分别可达到112 × 106 cells/mL和92× 106 cells/mL (图3-a~图3-c)。

氮为湛江等鞭金藻生长的限制因子,这在其他微藻中也已证实[30]。氮消耗曲线显示,NaNO3质量浓度为75和375 mg/L培养基中,光自养和光异养时,氮先后在指数阶段中期完全耗尽(图3-e,图3-f);兼养条件下,氮源的消耗主要用于生长,产生大量微藻(图3-d,图3-e,图3-f),因此兼养的氮消耗比光自养和光异养条件下快。在氮源充足(NaNO3质量浓度为750 mg/L)时,3种营养方式下氮均没有耗尽,但与NaNO3质量浓度为75和375 mg/L时的氮消耗特点一致,均是兼养最快,光异养消耗最慢,这也与生长曲线一致。NaNO3质量浓度为375 mg/L时,兼养方式培养湛江等鞭金藻,既可以获得较高的生物量和油脂产率,同时氮消耗率可达90%以上,利于培养基中营养物质的充分利用。在研究其他微藻时也发现,氮浓度能够影响氮消耗率,如GONCALVES等[31]发现小球藻C. vulgaris,月芽藻Pseudokirchneriella subcapitata,集胞藻Synechocystis salina和铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa等微藻对氮的利用率达到近90%。

2.5 湛江等鞭金藻的脂肪酸组成

在光强为100 μmol/(m2·s)兼养条件下,不同NaNO3浓度生长的微藻培养物中主要脂肪酸组成用GC分析(表3)确定。

表3 光强为100 μmol/(m2·s)兼养培养条件下不同NaNO3质量浓度时湛江等鞭金藻的脂肪酸组成

Table 3 Fatty acid compositions of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium with different nitrogen concentration under mixotrophic cultivation conditions at the light intensity of 100 μmol/(m2·s) (% of total FAME)

脂肪酸ρ(NaNO3)/(mg·L-1)75037575C14∶014.64±0.59**15.60±0.41**17.10±4.51C16∶018.11±0.88*18.81±2.5618.68±1.06C16∶131.92±2.86*32.45±3.45*33.75±4.90

续表3

脂肪酸ρ(NaNO3)/ (mg·L-1)75037575C18∶00.66±0.070.33±0.030.44±0.05C18∶12.14±0.701.98±0.132.64±0.65C18∶20.37±0.05**0.40±0.00**0.39±0.01ALA0.42±0.210.56±0.110.43±0.17GLA0.34±0.860.35±0.110.40±0.20C20∶526.45±3.47**24.74±0.71**22.00±5.39C22∶64.95±1.21**4.76±0.32*4.18±1.99SFA33.41±0.72*34.75±2.1236.22±3.47UFA66.59±3.24*65.25±1.3163.78±3.77MUFA34.06±4.94**34.43±2.36**36.39±5.70PUFA32.53±1.54**30.82±0.25**27.39±1.84

注:SFA表示饱和脂肪酸;UFA表示不饱和脂肪酸;MUFA表示单不饱和脂肪酸;PUFA表示多不饱和脂肪酸;每个点代表3次重复的平均值。均与质量浓度为75 mg/L的情况进行比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01。

不同NaNO3浓度条件下湛江等鞭金藻脂肪酸种类没有明显差异,主要脂肪酸为棕榈油酸(palmitoleic acid,16∶1)、EPA(eicosapentaenoic acid,20∶5n3)、棕榈酸(palmitic acid,16∶0)和肉豆蔻酸(myristic acid,14∶0),微量组分则包括硬脂酸(stearic acid,C18∶0),油酸(oleic acid,C18∶1)、亚油酸(linoleic acid,C18∶2)、γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,18∶3n6,GLA)、α-亚麻酸(alpha linolenic acid,18∶3n3,ALA)和docasahexaenoic acid (22∶6n3, DHA)。

湛江等鞭金藻的脂肪酸分布与FENG等[13]报道一致,主要脂肪酸是短链脂肪酸(C14-C18)和多不饱和脂肪酸组分。实验结果表明,不同NaNO3浓度培养的湛江等鞭金藻中脂肪酸分布变化具有规律性,即随着NaNO3浓度增加,MUFA和SFA水平升高而多不饱和脂肪酸水平降低。PINCHETTI等[32]研究表明,氮饥饿时脂肪酸合成过程继续进行,SFA和MUFA增加到最大值72.2%,而多不饱和脂肪酸减少到27.7%,这与本研究中观察到的脂肪酸分布一致。FENG等[13]研究发现湛江等鞭金藻中多不饱和脂肪酸是DHA,最高比例为14.9%,而在本研究发现其主要的多不饱和脂肪酸是EPA,最高比例为26.45%,可作为营养制品、功能食品和化妆品的合适来源。湛江等鞭金藻脂肪酸组成与生物柴油的最佳组成(C16∶1∶C18∶1和C14∶0比例为5∶4∶1)不同,EPA和DHA组分也会影响点火质量和氧化稳定性,因此不适用于生物柴油的开发利用[33]

3 结论

综上所述,分批培养湛江等鞭金藻时,最高油脂含量(46.00%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)光异养生长时得到,最高生物量浓度(2.20 g/L)在NaNO3质量浓度为750 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)兼养培养时获得。综合考虑油脂含量和生物量浓度,在光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为375 mg/L兼养培养时获得最佳油脂产率80.06 mg/L/d,这利于油脂下游加工,降低生产成本。此外,与已经报道的其他微藻生物量和油脂产率结果相比,本实验获得的生物量和油脂产率更高,尤其是可提高具有商业价值的不饱和脂肪酸EPA的产量,能够为湛江等鞭金藻的开发利用提供指导。

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Effects of cultivation conditions on cell growth and lipid productivity of microalgae Isochrysis zhanjiangensis

DONG Xuewei1, LI Youzhi1, HE Qingfang2,3, YU Jinhui2, BI Yuping2*

1(College of Life Science and Technology, State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Guangxi University, Nanning 530004, China) 2(Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Science, Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animal and Poultry of Shandong Province, Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai,Ministry of Agriculture, Jinan 250100, China) 3(Department of Applied Science, University of Arkansas, 72204, US)

ABSTRACT In order to improve the microalgae lipid productivity and optimize its cultivation conditions, Isochrysis zhanjiangensis was used as the research object, effects of trophic modes, light intensity, and NaNO3 concentration on the growth and lipid accumulation, as well as the relationship between nitrogen consumption and growth in the course of culture were explored. The results showed that microalgae consumed more nitrogen while it grew faster. Compared to photoautotrophic and photoheterotrophic cultivation, more nitrogen was consumed to meet the growth needs under mixotrophic cultivation condition. More protein were accumulated under the conditions of sufficient nitrogen and mixotrophic cultivation, whereas more oil accumulated under the conditions of low nitrogen concentration and light intensity. Although the highest oil content of 46% was obtained under the photoheterotrophic cultivation when the light intensity was 100 μmol/(m2·s) and NaNO3 concentration was 75 mg/L, the biomass concentration was only 0.46 g/L under the same condition. The highest biomass concentration of 2.20 g/L was obtained under the mixotrophic cultivation when the light intensity was 100 μmol/(m2·s) and NaNO3 concentration was 750 mg/L. However, the oil content was only 32.77%. Considering factors, such as lipid productivity and cost-saving, the best lipid productivity of 80.06 mg/(L·d) was obtained under the mixotrophic cultivation when the light intensity was 100 μmol/(m2·s) and NaNO3 concentration was 375 mg/L. Moreover, polyunsaturated fatty acids accounted for 30.82% of the total fatty acids contents under this condition. Therefore, this is a suitable condition for I. zhanjiangensis to produce microalgae oil as a nutritional substitute.

Key words Isochrysis zhanjiangensis; mixotrophic cultivation; biomass concentration; light intensity; lipid productivity