微藻具备光效高，生长速度快，投入低等优点，是多种高附加值天然产物、生物活性化合物的重要来源[1]。此外，微藻可在海水、苦咸水、市政污水等非农用水中培养，减少了新鲜水消耗；也可在滩涂、盐碱地等边际土地上大规模培养，做到“不与人争粮、不与人争地”[2]。但是微藻生物量浓度低，造成收获耗能大、新鲜水消耗多，导致微藻及其油脂生产成本高。因此，优化微藻培养条件，提高微藻的油脂产率和培养操作的灵活性，对充分开发利用湛江等鞭金藻具有重要的意义。
影响微藻生长和油脂积累的因素一般包括：光、碳源、氮磷等无机成分、营养方式等。光强对微藻生长的影响可分为光限制、光饱和及光抑制。到达光饱和之前，增强光强可以促进微藻生长[2]，但是油脂积累量不高，有利于微藻生长和油脂积累的最佳光强往往是不同的[3]。氮是组成核酸和蛋白质的主要元素，与微藻初级代谢相关[4]。充足的氮可以促进微藻生长，但缺氮条件却有利于油脂积累[2]。微藻营养方式分为光自养、异养、兼养等，对其生长和油脂积累具有不同影响[5]。一般情况下，微藻在生长条件不利情况时能够大量产生油脂，作为碳和能量的储存形式[2]，但通常以较低的生物量产率为代价。油脂产率代表油脂含量和生物量综合影响，是表征微藻油脂生产能力最合适的性能指标，为提高湛江等鞭金藻开发利用的经济性，需要优化微藻培养条件，提高其油脂产率[6]。目前，微藻培养的操作模式已进行了广泛研究，主要包括分批、分批补料、连续、半连续、两步法等[5]，但这些培养操作模式均有不足之处。如两步培养需将微藻从营养丰富培养基转换到营养缺乏培养基，大规模培养时操作成本高；补料分批和连续培养常在营养充足条件下进行，微藻油脂/多糖含量未必高，往往导致下游加工成本更高。如果可以通过一步培养操作实现微藻培养和油脂积累的目标，可以降低生产成本，提高操作效率。
因此，本文以湛江等鞭金藻为研究对象，通过测定生长和生化组分变化，研究NaNO3浓度，光强和营养方式对生长和油脂积累的影响，并探究生长和氮消耗间的关系，以期为微藻油脂的商业化提供指导。
1 材料与方法
1.1 藻种和培养基
湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)来自山东省农科院生物技术中心藻种资源库，藻株用人工海水改良f/2培养基培养[7]。
1.2 分批培养实验设计
湛江等鞭金藻在500 mL的锥形瓶中培养，使用300 mL灭菌的改良f/2培养基，光周期为14∶10，日光灯管提供光照，温度控制在(25±1) ℃，通入纯空气或含CO2的空气。培养条件见表1。
表1 不同培养条件的特征
Table 1 Characteristics of different cultivation conditions
对于光自养培养，提供不同光强，无机碳作碳源(含2% CO2空气流)。对于兼养培养，用葡萄糖(0.2 g/L)和无机碳(含2% CO2空气流)作碳源；对于光异养培养，培养基中提供葡萄糖(0.2 g/L)，并添加10-6 mol/L 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU)，持续通入空气。所有通气培养中，通气比为0.2 vvm。为评估氮浓度对湛江等鞭金藻生长和油脂积累影响，以NaNO3为氮源，培养物分别接种于氮质量浓度分别为75、375和750 mg/L的改良f/2培养基中。分别选取低光强为100 μmol/(m2·s)(low light, LL)和高光强为200 μmol/(m2·s)(high light, HL)的光照，以研究光强对湛江等鞭金藻生长和油脂积累的影响。实验过程中，每天测细胞密度和培养基中氮浓度，培养结束后测干重和各生化组分含量。
1.3 微藻生长和生化成分测定
细胞个数采用显微镜直接镜检计数。微藻在6 000×g条件下离心5 min，纯化水洗涤2次，放入预干燥和称重的培养皿中，40 ℃干燥至恒重，重量分析法测干重。总脂采用BLIGH等的方法测定[8]。多糖采用苯酚硫酸法，葡萄糖为标准物质[9]。蛋白质采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白为标准[10]。采用DONG等[11]的方法将藻类生物质直接甲酯化，气相色谱分析脂肪酸甲酯组成。
1.4 生物量产率和油脂产率测定
生物量产率(Pbiomass)按公式(1)计算：
(1)
油脂产率(Plipid)按公式(2)计算：
(2)
1.5 氮浓度测定
通过紫外分光光度法测OD220nm[12]，由标准曲线换算成NaNO3浓度，该方法原理是人工海水主要成分在紫外域具有吸收光谱。
1.6 统计学分析
所有结果以平均值±标准偏差表示。所有数据用SPSS 10(Chicago，IL，USA)中的单向ANOVA(方差分析)和Duncan多重范围试验(P<0.05)进行评估。
2 结果与分析
2.1 培养条件和营养方式对湛江等鞭金藻生物量浓度影响
如图1所示，光强分别为100和200 μmol/(m2·s)时，不同营养方式下，随NaNO3质量浓度升高(从75 mg/L升高到750 mg/L)，微藻生物量浓度在逐步增大。培养9 d后，NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)光异养时生物量浓度最低为0.46 g/L，NaNO3质量浓度为750 mg/L，光强为200 μmol/(m2·s)兼养时生物量质量浓度最高为2.20 g/L。氮是合成蛋白质、核酸等生物大分子的必需元素，增加氮供应生物量浓度将增加，这与其他研究结果一致[13]，也有研究证明，氮浓度较低时会导致细胞营养不足，从而影响微藻的正常生长[4]。
在相同的光强和NaNO3质量浓度条件下，兼养培养可获得最高的生物量浓度(0.78～2.2 g/L，平均为相同条件下光自养培养的1.34倍，光异养培养的2.28倍)，表明湛江等鞭金藻可同时利用CO2和葡萄糖2种碳源，并获得更高产量。兼养培养具有将有机碳和无机碳同化的优势，可将外部提供的或呼吸过程中产生的CO2进行同化[14]。特别是葡萄糖存在下，通过光合作用将有氧呼吸时释放的CO2进行再固定被证明是兼养培养条件下生物质合成的关键[15]。此外，兼养培养还可以减少自养培养时的自遮蔽问题，也可以降低异养时的成本增加问题[14]，因此兼养培养(以有机碳如葡萄糖作为补充)在微藻生物质和次生代谢产物生产中被广泛应用[16]。
在相同的NaNO3质量浓度条件下，光自养培养湛江等鞭金藻时，高光强(200 μmol/(m2·s))时生物量浓度增大，最高为1.76 g/L；光异养和兼养培养湛江等鞭金藻时，低光强(100 μmol/(m2·s))时生物量浓度高，兼养时最高为2.2 g/L，光异养时最高为0.97 g/L。光是合成ATP和NADPH所必需的因素，它驱动产生碳骨架光合作用的暗反应[4]，对微藻的生化组成和生物量有影响[17]，因此光强是微藻培养的主要限制因素之一。光强过低或过高，微藻均不能有效生长[2]。较高的光强会使光合速率逐步增加到最大点，之后逐渐降低，直到光合速率被光呼吸和光抑制平衡。本实验结果显示，增加光强提高了湛江等鞭金藻光自养时生物量浓度，RODOLFI等[18]在平板式光生物反应器中培养微拟球藻Nannochloropsis时也发现随光强增加生物量产率升高的现象。LV等[19]证明与低光强和高光强相比，光强为60 μmol/(m2·s)时，小球藻C. vulgaris生物量浓度和油脂含量均升高。
图1 不同营养方式、光强、NaNO3质量浓度对湛江等鞭金藻生物量的影响
Fig.1 Biomass production performance of I. zhanjiangensis grown on f/2 media under different trophic modes (photoautotrophic,mixotrophic and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentrations
综合分析以上结果可知，NaNO3质量浓度为750 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)、兼养培养可获得最高生物量，因此是分批培养湛江等鞭金藻时获得生物量的合适培养条件。
2.2 培养条件和营养方式对湛江等鞭金藻生化成分影响
不同培养条件和营养方式下湛江等鞭金藻生化成分见图2。
图2 不同营养方式(光自养、兼养、光异养)、光强和NaNO3质量浓度对湛江等鞭金藻生化成分的影响
Fig.2 Biochemical components of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different trophic modes (photoautotrophic, mixotrophic, and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentration
在通入CO2气体条件下(光自养和兼养)，多糖含量是30%～40%；当使用葡萄糖为唯一碳源条件下(光异养)，多糖含量稍低。与光自养相比，兼养和光异养条件下多糖含量下降，而总脂含量增加。最高多糖含量(50.8%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为200 μmol/(m2·s)、光自养条件下获得，最高油脂含量(46.0%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)、光异养条件下获得。兼养培养时油脂含量高于光自养培养。一般而言，兼养培养时，部分能量用于生长，其余能量以碳水化合物和油脂形式储存，使得微藻细胞肿胀，体积增大，油脂含量升高[20]。碳水化合物和油脂的数值成反比，如GOODSON等[21]和LI等[16]分别在研究C. sorokiniana和Chlamydomonas reinhardtii时发现，油脂合成在很大程度上依赖于淀粉降解，因为叶绿体中淀粉较少时，可以为储存油脂提供更多空间。
在相同的营养方式和光强下，NaNO3浓度越低，湛江等鞭金藻油脂和多糖含量越高；NaNO3浓度越高，蛋白质含量越高。缺氮培养是微藻油脂生产中应用最广泛的营养胁迫，氮饥饿下刺激油脂积累主要包括以下两种机制。一方面，由于大多数氨基酸合成中需要氮，所以在氮饥饿时蛋白质含量降低，并且导致细胞通常处入细胞周期的停滞期，可表达更高水平的应激标记代谢物如碳水化合物和油脂[22]。另一方面，氮饥饿条件下，微藻积累更多的油脂，也可能是将碳水化合物转化和重新分配成脂肪，从而使油脂含量增加[23]。WASE等[24]通过基于GC-MS的代谢组学和ITRAQ标记的蛋白质组学分析发现，氮饥饿时，糖酵解、TCA循环、淀粉、油脂代谢、氮同化、氨基酸代谢和氧化磷酸化所涉及的酶增强，相反，卡尔文循环、光收获复合体、乙醛酸循环、一碳代谢、戊糖磷酸途径和核糖体的酶则减少。
相同营养方式下，氮浓度相同时，光强增加导致湛江等鞭金藻总脂含量降低，对绿色巴夫藻Pavlova lutheri和三角褐指藻Phaeodactylum. tricornutum研究中也发现了相同规律[25-26]。一般而言，光强升高时蛋白含量降低，而总脂和多糖含量增加[22]。微藻倾向于积聚油脂，而不是碳水化合物，因为积累油脂可以避免光损伤现象发生，同时油脂作为能量储存比碳水化合物更有效[2]。如HO等[27]研究发现，高光强在微藻积累中性脂(TAG)或类胡萝卜素时起刺激作用，在高光强(300 μmol/(m2·s))时，衣藻Chlamydomonas sp. JSC4油脂产率为312 mg/(L·d)，油脂含量显著高于低光强(30 μmol/(m2·s))时的油脂含量。本研究结果表明，湛江等鞭金藻在光强和NaNO3浓度升高时总脂含量降低，低氮和低光强利于促进湛江等鞭金藻总脂积累。这可能是多种压力下导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，造成脂肪酸和TAG生物合成相关的酶发生氧化损伤，使得碳流向其他储存组分，从而造成油脂含量降低[28]。
2.3 培养条件和NaNO3浓度对油脂产率的影响
从表2中看出，光强为200 μmol/(m2·s)条件下，油脂产率呈现先增大后降低的趋势；光强为100 μmol/(m2·s)条件下，油脂产率逐步增大，最大油脂产率80.16 mg/(L·d)在低光强兼养时得到；但在低光强兼养培养、NaNO3质量浓度为375 mg/L时，油脂含量更高(37.40%)。综合考虑油脂含量和最终获得的生物量浓度，光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为375 mg/L兼养培养是湛江等鞭金藻大量培养生产油脂的最适培养条件，同时，较高的油脂含量利于下游处理，降低油脂生产成本。此外，与等鞭金藻Isochrysis sp. 的37.8 mg/(L·d)[19]，小球藻Chlorella zofingiensis的 36.00 mg/(L·d)，小球藻C. vulgaris的27.0～35.0 mg/(L·d)，微拟球藻Nannochloropsis oceanica的56.91 mg/(L·d)，绿球藻Chlorococcum pamirum的41.00 mg/(L·d)，栅藻Scenedesmus sp.的20.70 mg/(L·d)[29]等研究结果相比，本实验中获得的油脂产率更高。
表2 不同NaNO3质量浓度、营养方式和光强下湛江等鞭金藻的油脂产率
Table 2 Lipid productivity of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium with different NaNO3 concentration under different trophic modes (photoautotrophic, photoheterotrophic and mixotrophic cultivation) and light intensity
注：高光强: 200 μmol/(m2·s);低光强: 100 μmol/(m2·s)
2.4 培养条件和营养方式对微藻生长和氮源消耗的影响
不同培养条件和营养方式下，细胞密度和氮消耗比较见图3。
▲-光异养/高光强；■-兼养/高光强；◀-光自养/高光强；▼-光异养/低光强；◆-兼养/低光强；□-光自养/低光强
图3 f/2培养基中不同培养条件下湛江等鞭金藻生长动力学和相应的氮消耗
Fig.3 Growth kinetics of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different cultivation conditions and corresponding nitrogen consumption
注：每个点代表3次重复的平均值。a, d分别为NaNO3质量浓度为75 mg/L时的生长和氮消耗曲线；b, e分别为NaNO3质量浓度为375 mg/L时的生长和氮消耗曲线；c, f分别为NaNO3质量浓度为750 mg/L时的生长和氮消耗曲线。
随培养时间延长，各组细胞密度均有不同程度增加。光异养条件下生长慢，最高细胞密度仅为52×106 cells/mL，兼养培养比光自养和光异养培养生长快，兼养和光自养培养9 d最大细胞密度分别可达到112 × 106 cells/mL和92× 106 cells/mL (图3-a～图3-c)。
氮为湛江等鞭金藻生长的限制因子，这在其他微藻中也已证实[30]。氮消耗曲线显示，NaNO3质量浓度为75和375 mg/L培养基中，光自养和光异养时，氮先后在指数阶段中期完全耗尽(图3-e,图3-f)；兼养条件下，氮源的消耗主要用于生长，产生大量微藻(图3-d,图3-e,图3-f)，因此兼养的氮消耗比光自养和光异养条件下快。在氮源充足(NaNO3质量浓度为750 mg/L)时，3种营养方式下氮均没有耗尽，但与NaNO3质量浓度为75和375 mg/L时的氮消耗特点一致，均是兼养最快，光异养消耗最慢，这也与生长曲线一致。NaNO3质量浓度为375 mg/L时，兼养方式培养湛江等鞭金藻，既可以获得较高的生物量和油脂产率，同时氮消耗率可达90%以上，利于培养基中营养物质的充分利用。在研究其他微藻时也发现，氮浓度能够影响氮消耗率，如GONCALVES等[31]发现小球藻C. vulgaris，月芽藻Pseudokirchneriella subcapitata，集胞藻Synechocystis salina和铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa等微藻对氮的利用率达到近90%。
2.5 湛江等鞭金藻的脂肪酸组成
在光强为100 μmol/(m2·s)兼养条件下，不同NaNO3浓度生长的微藻培养物中主要脂肪酸组成用GC分析(表3)确定。
表3 光强为100 μmol/(m2·s)兼养培养条件下不同NaNO3质量浓度时湛江等鞭金藻的脂肪酸组成
Table 3 Fatty acid compositions of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium with different nitrogen concentration under mixotrophic cultivation conditions at the light intensity of 100 μmol/(m2·s) (% of total FAME)
续表3
注：SFA表示饱和脂肪酸；UFA表示不饱和脂肪酸；MUFA表示单不饱和脂肪酸；PUFA表示多不饱和脂肪酸；每个点代表3次重复的平均值。均与质量浓度为75 mg/L的情况进行比较，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
不同NaNO3浓度条件下湛江等鞭金藻脂肪酸种类没有明显差异，主要脂肪酸为棕榈油酸(palmitoleic acid，16∶1)、EPA(eicosapentaenoic acid，20∶5n3)、棕榈酸(palmitic acid，16∶0)和肉豆蔻酸(myristic acid，14∶0)，微量组分则包括硬脂酸(stearic acid，C18∶0)，油酸(oleic acid，C18∶1)、亚油酸(linoleic acid，C18∶2)、γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，18∶3n6，GLA)、α-亚麻酸(alpha linolenic acid，18∶3n3，ALA)和docasahexaenoic acid (22∶6n3, DHA)。
湛江等鞭金藻的脂肪酸分布与FENG等[13]报道一致，主要脂肪酸是短链脂肪酸(C14-C18)和多不饱和脂肪酸组分。实验结果表明，不同NaNO3浓度培养的湛江等鞭金藻中脂肪酸分布变化具有规律性，即随着NaNO3浓度增加，MUFA和SFA水平升高而多不饱和脂肪酸水平降低。PINCHETTI等[32]研究表明，氮饥饿时脂肪酸合成过程继续进行，SFA和MUFA增加到最大值72.2%，而多不饱和脂肪酸减少到27.7%，这与本研究中观察到的脂肪酸分布一致。FENG等[13]研究发现湛江等鞭金藻中多不饱和脂肪酸是DHA，最高比例为14.9%，而在本研究发现其主要的多不饱和脂肪酸是EPA，最高比例为26.45%，可作为营养制品、功能食品和化妆品的合适来源。湛江等鞭金藻脂肪酸组成与生物柴油的最佳组成(C16∶1∶C18∶1和C14∶0比例为5∶4∶1)不同，EPA和DHA组分也会影响点火质量和氧化稳定性，因此不适用于生物柴油的开发利用[33]。
3 结论
综上所述，分批培养湛江等鞭金藻时，最高油脂含量(46.00%)在NaNO3质量浓度为75 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)光异养生长时得到，最高生物量浓度(2.20 g/L)在NaNO3质量浓度为750 mg/L、光强为100 μmol/(m2·s)兼养培养时获得。综合考虑油脂含量和生物量浓度，在光强为100 μmol/(m2·s)、NaNO3质量浓度为375 mg/L兼养培养时获得最佳油脂产率80.06 mg/L/d，这利于油脂下游加工，降低生产成本。此外，与已经报道的其他微藻生物量和油脂产率结果相比，本实验获得的生物量和油脂产率更高，尤其是可提高具有商业价值的不饱和脂肪酸EPA的产量，能够为湛江等鞭金藻的开发利用提供指导。
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