发酵果蔬汁是指以一种或多种新鲜果蔬、菌菇和中草药等为原料，经多种或单一乳酸菌发酵而成的果蔬汁类饮料[1]。其利用微生物发酵萃取天然蔬果原料精华，浓缩了微生物代谢生成的有机酸、功能性低聚糖、多肽等功能成分。已有研究发现，发酵果蔬汁具有调节肠道菌群、提高免疫力、消除自由基等保健功效[2]。这类产品在日本和台湾地区发展迅速，目前国内的果蔬酵素市场也开始孕育和发展，但正规的产品及相关功能研究仍然较少[3]。本实验的发酵果蔬汁样品以常年种植，产量大，易储藏的新鲜果蔬或未添加任何添加剂的干燥后的果实为主要原料，其他应季蔬果为辅料，使用先进的高纯度冻干直投式菌种，多菌株混合发酵，同时采用发酵促进技术和分步发酵技术，充分利用底物营养，富集对身体有益的发酵代谢物，酵素浓度高，含有丰富的有机酸、低聚糖、膳食纤维等。
便秘是临床上常见的消化道症状，主要表现为排便减少(<3次/周)，粪便干硬和(或)排便困难[4]。根据产生原因，可分为先天性、原发性和继发性便秘，原发性便秘即功能性便秘(functional constipation，FC)，是一类排除了器质性病变的便秘症状。肥胖是指摄入的热量远大于消耗，造成体内脂肪堆积致体质量增加。肥胖不仅影响美观，还伴随一系列病症如高胆固醇血症、高甘油三酯血症等。随着人们饮食结构改变，生活节奏加快，功能性便秘和肥胖已成为影响现代人生活质量的重要病症。目前，功能性便秘的药物治疗通常采用膨松药、渗透性泻药、粪便软化剂等[5]。但调查[6]显示，47%的患者对于药物治疗满意度差，且不同药物的副作用也为患者带来新的困扰；对于肥胖的干预方法主要有食疗、运动、药物和外科手术等，其中食疗方法被认为是安全可靠且易接受的减肥方法之一。发酵果蔬汁富含有机酸、低聚糖、膳食纤维等，功能性便秘和肥胖都被证明与膳食纤维摄入较少有关。且已有大量研究表明，膳食纤维具有改善功能性便秘和肥胖的功能[7-13]。因此，本研究旨在建立功能性便秘和肥胖的实验动物模型基础上，探究发酵果蔬汁的通便和减肥功能，为开发利用发酵果蔬汁提供科学依据，为功能性便秘和肥胖的治疗提供思路，改善肥胖人群的生活质量。
1 材料与方法
1.1 受试物
本实验所用发酵果蔬汁以17种新鲜果蔬或未添加任何添加剂的果蔬干制品或果蔬浆料为原料，采用现代生物发酵工艺制成，原料配比和膳食纤维含量分别见表1和表2。
表1 发酵果蔬汁原料配比
Table 1 Raw material ratio of fermented fruit and vegetable juice
表2 发酵果蔬汁膳食纤维含量 单位：g/100g
Table 2 The content of dietary fiber in fermented fruit and vegetable juice
1.2 试剂及仪器
盐酸洛哌丁胺，规格为2 mg×6粒，西安杨森制药有限公司，商品编码: 02000553，批准文号:国药准字H10910085；阿拉伯树胶粉、活性炭粉，北京宝瑞杰科技有限公司。
小鼠灌胃针，大鼠灌胃针，手术剪，眼科镊，直尺，1 mL注射器，电子天平(奥豪斯SPN3001F、赛多利斯BS2000S)。
1.3 实验动物及饲养条件
SPF级健康雄性ICR小鼠，体重约18～22 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号：SCXK(京)2016—0010，SPF级健康雄性SD大鼠，体重约160～200 g,由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物合格证号：SCXK(京)2011—0012。动物饲养于屏障环境中，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2012—0011。饲养环境温度(23±2) ℃，湿度50%～60%，明暗交替12 h∶12 h。
1.4 通便功能评价实验
1.4.1 实验分组及受试样品给予
小鼠适应性喂养3 d后，称量体重，按体重随机分成5组，分别为空白对照组、模型对照组和3个剂量组，每组12只。空白对照组和模型对照组经口灌胃给予蒸馏水，3个剂量组相同途径给予相应浓度的发酵果蔬汁，连续给予受试物15 d。按照以上方法饲养相同的2批动物，分别进行小肠运动实验和排便实验。各组小鼠在整个实验周期内自由饮水、进食，具体实验分组及受试样品给予见表3。
表3 实验分组及受试样品给予
Table 3 Animal grouping and interventions
1.4.2 功能性便秘模型的建立
进行小肠运动实验的动物在灌胃15 d后，各组小鼠禁食不禁水16 h后，模型对照组和3个剂量组灌胃给予盐酸洛哌丁胺(5 mg/kg BW)，空白对照组给予蒸馏水。进行排便实验的动物盐酸洛哌丁胺为10 mg/kg BW，其余处理同上。
1.4.3 指标测定
给盐酸洛哌丁胺0.5 h后，发酵果蔬汁低、中、高剂量组分别灌胃给予含受试样品的墨汁(含5%的活性炭粉、10%阿拉伯树胶)，对照组给墨汁灌胃。
进行小肠运动实验的动物在灌胃墨汁25 min后立即脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按公式(1)计算墨汁推进率：
墨汁推进率
(1)
墨汁推进率需进行数据转换，X=Sin-1 √P，式中P为墨汁推进率，用小数表示。
进行排便实验的动物从灌胃墨汁开始，记录每只动物排首粒黑便时间、5 h内排黑便粒数，称量粪便鲜重，并将其烘干至恒重，称量粪便干重，按公式(2)计算粪便含水量：
粪便含水量
(2)
1.5 减肥功能评价实验
1.5.1 实验分组及受试样品给予
大鼠适应性喂养5 d后，称量体重，按体重随机分成2组，10只大鼠给予维持饲料作为空白对照组，60只给予高热量饲料作为模型对照组。每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体重1次。喂养2周后，给予高热量饲料的大鼠按体重增重排序，淘汰体重增重较低的1/3肥胖抵抗大鼠。
将筛选出的40只肥胖敏感大鼠按体重随机分成4组，分别为模型对照组和3个剂量组。模型对照组和3个剂量组给予高热量模型饲料，上述空白对照组给予维持饲料。各剂量组灌胃给予不同剂量的受试样品，模型对照组和空白对照组给予等量的相应溶剂，受试样品给予时间6周。具体实验分组及受试样品给予同表3。
1.5.2 指标测定
每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体重1次。喂养6周后，各组动物禁食不禁水过夜，第2天清晨称量体重后在乙醚麻醉下经股动脉放血处死。处死后的动物剖腹完整分离肾周及睾周脂肪并称重，计算脂肪/体重值。
1.6 统计分析
实验结果以X±SD(均数±标准差)表示。所有数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同实验组的结果进行统计检验，以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。方差齐时，采用LSD法进行两两比较；方差不齐时，采用Tamhane′s法进行两两比较。
2 结果与分析
2.1 通便功能评价实验结果
2.1.1 小肠运动实验
小肠运动实验期间各组动物未出现腹泻症状，饮食和活动正常，健康状况和精神状况良好。发酵果蔬汁对小鼠体重的影响如表4所示。由表4可见，小肠运动实验各组动物初始体重无明显差异(P>0.05)；经口灌胃给予受试物15 d后，各组动物终末体重也无明显差异(P>0.05)。表明受试样品发酵果蔬汁对动物的生长无不良影响。
表4 小肠运动实验发酵果蔬汁对小鼠体重的影响(n=12)
Table 4 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the body weight(n=12)
小肠运动实验结果如表5所示。与空白对照组相比，模型对照组墨汁推进率显著降低(P<0.01)，说明使用盐酸洛哌丁胺构建小鼠便秘模型成功。与模型对照组相比，发酵果蔬汁剂量组小鼠的墨汁推进率均高于模型组，且随剂量增大而更接近空白对照组，其中发酵果蔬汁中、高剂量组墨汁推进率显著升高(P<0.05，P<0.01)，且与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，表明中、高剂量发酵果蔬汁可促进便秘模型小鼠的小肠蠕动。
表5 发酵果蔬汁对小鼠小肠运动的影响(n=12)
Table 5 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the small intestine movement(n=12)
注：与空白对照组相比差异有统计学意义， *P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比差异有统计学意义，#P<0.05，##P<0.01。
2.1.2 排便实验
排便实验期间各组动物未出现腹泻症状，饮食和活动正常，健康状况和精神状况良好。发酵果蔬汁对小鼠体重的影响如表6所示。由表6可见，排便实验各组动物初始体重无明显差异(P>0.05)；经口灌胃给予受试物15 d后，各组动物终末体重也无明显差异(P>0.05)。表明受试样品发酵果蔬汁对动物的生长无不良影响。
表6 排便实验发酵果蔬汁对小鼠体重的影响(n=12)
Table 6 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the body weight(n=12)
排便实验结果如表7所示。与空白对照组相比，模型对照组排首粒黑便时间显著延长(P<0.01)，5 h排黑便粒数、5 h排黑粪便质量均显著减少(P<0.01)，说明使用盐酸洛哌丁胺构建小鼠便秘模型成功。与模型对照组相比，发酵果蔬汁低、中、高剂量组排首粒黑便时间均有不同程度的缩短，且差异具有统计学意义(见表7)，且存在剂量反应关系，中、高剂量5 h排黑便粒数显著增多(P<0.05，P<0.01)，表明发酵果蔬汁能缩短小鼠的首便时间，改善便秘症状。
与空白对照组相比，模型对照组粪便含水量无显著差异(P>0.05)，说明本研究所用造模药物对受试动物粪便含水量无显著影响。与模型对照组相比，发酵果蔬汁剂量组粪便含水量无显著差异(P>0.05)，但均有上升，且存在随剂量增大粪便含水量增加的趋势，提示发酵果蔬汁可能通过增加粪便含水量改善便秘症状，但要深入探讨发酵果蔬汁对受试动物粪便含水量的影响尚需采用更合适的造模方法。
表7 发酵果蔬汁对小鼠排便时间、粪便粒数、粪便质量和粪便含水量的影响(n=12)
Table 7 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the first black stool time, the dejection amounts,weights and feces water content(n=12)
注：与空白对照组相比差异有统计学意义， *P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比差异有统计学意义，#P<0.05，##P<0.01。
2.2 减肥功能评价实验结果
2.2.1 实验期间动物体重增长
实验期间动物体重变化如表8所示，造模结束后，各组动物初始体重无明显差异(P>0.05)。整个实验期间，各组动物的平均体重均呈现随周龄增加逐渐增加的趋势。从第4周开始，B组体重显著高于A组(P<0.05)，并一直延续至实验结束(第5周，P<0.05；第6周，P<0.01)，提示肥胖模型建立成功。第1周，C组、E组体重显著低于B组(P<0.05)。从第3周开始，E组体重显著低于B组直至实验结束(P<0.05)，提示一定剂量的发酵果蔬汁可降低肥胖大鼠体重。
表8 发酵果蔬汁对饲喂高热量饲料大鼠体重的影响(n=10) 单位：g
Table 8 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the weight of rats fed with high calorie feed(n=10)
注：与空白对照组(A组)相比差异有统计学意义， *P<0.05， **P<0.01；与模型对照组(B组)相比差异有统计学意义，#P<0.05。A-空白对照组；B-模型对照组；C-发酵果蔬汁低剂量组；D-发酵果蔬汁中剂量组；E-发酵果蔬汁高剂量组，下同。
2.2.2 实验期间动物摄食量
实验期间各组动物的摄食量如表9所示，各组动物摄食量无明显差异(P>0.05)，提示发酵果蔬汁对实验动物摄食行为无不良影响。
表9 发酵果蔬汁对饲喂高热量饲料大鼠摄食量的影响(n=10) 单位：g
Table 9 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the food intake of rats fed with high calorie feed(n=10)
2.2.3 脂/体比
如表10所示，与A组相比，B、C、D组睾丸及肾周脂肪重显著升高(P<0.05)，脂/体比也显著增加(见表10)，提示肥胖模型建立成功。与B组相比，E组睾丸及肾周脂肪重和脂/体比均显著降低(P<0.01)，提示一定剂量的发酵果蔬汁可降低肥胖大鼠体内脂肪含量，有助于减肥。
表10 发酵果蔬汁对饲喂高热量饲料大鼠脂/体比值的影响(n=10)
Table 10 Effects of fermented fruit and vegetable juice on the ratio of fat weight/body weight in rats fed with high calorie feed(n=10)
注：与空白对照组(A组)相比差异有统计学意义， *P<0.05；与模型对照组(B组)相比差异有统计学意义， ##P<0.01。
3 结论与讨论
发酵果蔬汁富含膳食纤维，便秘的产生与饮食结构密切相关,其中一个重要原因就是膳食纤维缺乏，已有研究[13-15]显示肉苁蓉膳食纤维、复合膳食纤维具有良好的润肠通便功能，其重要机制之一是水不溶性膳食纤维具有较强的持水力，使粪便柔软易于排出，同时具有一定的溶胀性，且不易被消化酵解，从而形成较多食物残渣，使粪便的重量和体积增大利于排出[16]。此外，水溶性膳食纤维容易被肠道菌群酵解，产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸(SCFA)，降低肠内pH值，同时与酵解产物二氧化碳、甲烷等气体共同刺激肠粘膜，也可促进肠道蠕动[16]。另一方面，膳食纤维的持水力使其能够增加小肠内容物的体积、容量和黏度，延缓人体对营养物质的吸收[12]，同时，还能够调节胃肠道中相关激素的分泌来增加饱腹感，从而调控体重增长[17]。
本实验使用盐酸洛哌丁胺构建小鼠功能性便秘模型，使用高热量饲料构建大鼠营养性肥胖模型，结果显示模型构建成功。同时，发酵果蔬汁组墨汁推进率、排首粒黑便时间和5h排黑便粒数与模型对照组相比有显著改善；发酵果蔬汁组体重、睾丸及肾周脂肪重和脂/体比也显著低于模型组，根据《保健食品检验与评价技术规范》，可判定本实验所用发酵果蔬汁具有通便和减肥功能。本研究为开发利用发酵果蔬汁提供了科学依据，为功能性便秘和肥胖的治疗提供了思路。
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