5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，HMF)是食品中的一种内源污染物，低浓度的HMF具有抗氧化、抗心肌缺血的作用[1]；但高浓度的HMF具有细胞毒性[2]、遗传毒性[3]和致癌性[4]，对眼睛、黏膜和皮肤都有刺激作用[5]。除此之外，HMF容易氧化形成致癌物羟甲基糠酰磺酸盐(5-sulfoxymethyfurfural，SMF)[6]，HOIE课题组[7]证明了，HMF通过转变为SMF对人体产生危害，DE LA CUEVA[8]等证明了HMF能够在人体内转化成SMF，后者与DNA形成加合物，具有致癌活性。
HMF的形成与碳水化合物含量丰富食品的热加工过程密切相关[9]，其主要产生途径有以下2种：一是果糖或葡萄糖在高温条件下，烯醇化、脱水、环化生成HMF[10]，其中3-脱氧奥苏糖和不饱和奥苏糖是2种重要的前体物质[11-12]；二是蔗糖或果糖裂解成果糖呋喃阳离子，它是HMF的直接前体物质[13]，能够在高温干燥的条件下快速转化为HMF[14]，是比3-脱氧奥苏糖更高效的形成途径[15]。HMF在食品热加工中还受到pH[16]、水分活度、糖的种类[17]和二价阳离子[18]的影响。
我们的前期研究发现，食品中形成的HMF可与氨基酸结合形成氨基酸-HMF加合物[19]，从而降低食品中HMF含量。食物在胃肠道消化过程中，蛋白质会水解成氨基酸，pH也发生变化。但对HMF含量高的食物在消化过程中HMF的变化规律缺少研究。本研究选用4种市面上常见的热加工食品作研究对象(咖啡、饼干、薯片、方便面)，探讨4种食品经过模拟胃肠道消化前后的HMF变化规律，以期为HMF的风险评估提供依据。
1 实验材料与设备
1.1 材料与试剂
康师傅油炸方便面(香菇炖鸡)，康师傅控股有限公司；乐事薯片(原味)，乐事薯片公司；太平梳打饼干(奶盐味)，亿滋食品有限公司；雀巢咖啡(原味)，雀巢中国有限公司。
胃蛋白酶(猪源，15 000 u/g)、唾液淀粉酶(1 500 u/g)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰酶(4 000 u/g)，合肥博美生物科技有限责任公司。
1.2 仪器与设备
LC-20AT高效液相色谱仪(配备SPD-M20A光电二极管阵列检测器)，日本岛津公司；Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，安捷伦仪器有限公司；紫外分光光度计UV-900，北京瑞利分析仪器公司。
2 实验方法
2.1 系列模拟消化液配备
按MINEKUS[20]等的方法配制模拟唾液(simulated salivary fluid，SSF)并进行模拟消化试验，模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模拟肠液(simulated intestinal fluid，SIF)，具体配方见表1。
表1 不同模拟消化液储备液的配制
Table 1 Preparation of stock solutions for simulated digestion fluids
2.2 体外模拟消化过程
(1)模拟口腔消化
取5 g供试食品研磨成粉末放入锥形瓶中，加入3.5 mL的模拟唾液、25 μL的CaCl2储备液、975 μL水和0.5 mL 1 500 U唾液淀粉酶液，混合均匀后于37 ℃恒温振荡器上消化水解2 min，以模拟口腔咀嚼消化过程。
(2)模拟胃部消化
将模拟口腔消化产物中加入7.5 mL的模拟胃液、5 μL的CaCl2储备液、695 μL的水和1.6 mL 25 000 U的胃蛋白酶液，用0.2 mL的1 mol/L HCl调节消化体系的pH值至3，混合均匀后于37 ℃恒温振荡器上消化2 h，模拟胃部消化过程。
(3)模拟肠道消化
于模拟胃部消化产物中加入16 mL的模拟肠液、40 μL的CaCl2储备液、860 μL的水、2.5 mL胆盐和1 g胰酶，用0.6 mL的1 mol/L NaOH调节消化体系的pH值至7，混合均匀后于37 ℃恒温振荡器上消化2 h，模拟肠部消化过程。
每个食品重复3次。每段模拟消化后取样，采用HPLC法测定HMF含量。色谱分析条件：色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长284 nm，流动相为去离子水，柱温40 ℃，流速0.6 mL/min，进样量10 μL。
2.3 4种食品消化后的氨基酸分析
氨基酸总量采用茚三酮显色法进行测定，游离氨基酸采用氨基酸自动分析仪进行测定。
2.3.1 食品模拟消化物中氨基酸总量测定
分别取饼干、咖啡、方便面、薯片胃消化产物和肠消化产物2 mL于离心管中，加入等体积水稀释，然后加入4 mL石油醚混合摇匀，静置沉降15 min后以3 000 r/min离心15 min，去除有机层(脱脂)，测定水相中氨基酸含量。
取上述处理后样品液0.5 mL于比色管中加水定容至5 mL，从中取出0.5 mL液体与0.5 mL柠檬酸-磷酸缓冲液和1 mL茚三酮溶液均匀混合，置于沸水浴15 min后取出，冷却至室温后于分光光度计测定吸光值(波长570 nm)。以亮氨酸作为标准氨基酸，绘制标准曲线，计算样品中氨基酸总量。
2.3.2 食品消化物中游离氨基酸含量的测定
在国标GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定方法》[21]基础上调整方法测定饼干、咖啡、方便面和薯片胃肠道消化产物中游离氨基酸含量。主要分为以下4个步骤：定容→脱脂→沉淀蛋白质→衍生→上机检测。
取4种食品的模拟胃肠消化产物2 mL，加入等体积水，旋涡混合。加入等体积石油醚旋涡萃取，静置30 min后离心(4 000 r/min，15 min)除去脂肪。取水相2 mL于试管中，加入2 mL三氯乙酸，静置1 h后离心(4 000 r/min，15 min)，除去蛋白质。取上清液，过0.45 μm滤膜。
准确吸取0.200 ml混合氨基酸标准液，用pH 2.2的缓冲液稀释至5 mL，此标准稀释液浓度为5.00 nmol/50 μL，作为上机测定用的氨基酸标准，采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量。其检测条件为：进样量20 μL；离子交换柱磺酸型阳离子树脂(4.6 mm ×60 mm, 3 μm)；柱温57 ℃；分离缓冲液流速0.4 mL/min；反应温度135 ℃；茚三酮反应液流速0.35 mL/min；检测波长440 nm和570 nm。
3 结果与分析
3.1 4种食品在模拟消化条件下HMF的变化
4种食品经过体外模拟消化后的HMF含量见表2。
表2 饼干、咖啡、薯片、方便面胃肠道消化产物HMF含量变化
Table 2 Changes in the amount of HMF in the simulated digests of biscuits, coffee, chips and instant noodle
注：*和**表示与未消化食品相比，HMF含量分别在5%和1%水平上存在差异。
由表2可知，方便面、饼干和薯片中HMF含量相近而咖啡中含量很高。经过模拟胃消化后，方便面、薯片及饼干中的HMF含量均升高，分别增加15.5%，44.9%和135%，但咖啡消化后HMF却下降。
模拟肠消化后，4种食品的HMF含量均大幅下降，方便面和咖啡的HMF残留量分别下降78.4%和74.1%，饼干和薯片中HMF的残留量低于检测限。由此可见，在胃消化过程中被释放的HMF于肠消化环境中被大量消除，消除机理可能是食品中的蛋白质酶解出大量的游离氨基酸，氨基酸与食品里面的5-HMF反应重新形成加合物[19]。
3.2 4种食品消化产物中HMF的可能消减机理
HAMZALIOGLU和GOKMEN[22]认为，食品高温加工过程中产生的HMF前体物质3-脱氧奥苏糖(3-DG)和不饱和奥苏糖(3,4-DG)累积在食品当中，在胃环境下3-DG和3,4-DG能够转化为HMF，从而使HMF含量增加。但这很难解释咖啡中出现的相反现象。我们推测速溶咖啡中半胱氨酸含量较高，HMF在酸性条件下会形成加合物[23]，从而降低HMF含量。
为了验证上述推测，我们测定了模拟胃肠消化后游离氨基酸含量(表3)。结果表明，被试食品的氨基酸总量均有大幅度增长，由多及少顺序依次为咖啡>薯片>方便面>饼干。半胱氨酸对HMF的消除能力最强[19]，表3结果表明，释放的半胱氨酸含量顺序依次为咖啡>方便面>薯片>饼干，而表2中HMF增加量顺序依次为饼干>薯片>方便面，咖啡中的HMF含量下降，说明蛋白质中释放的半胱氨酸在HMF的消减中起重要作用。
基于我们的近期研究[23]，加合物的形成会降低HMF对细胞的毒性。因此，在摄食HMF含量高的食品的同时，适量摄入蛋白质可消除HMF的危害。
表3 饼干、咖啡、薯片、方便面模拟胃肠消化产物氨基酸含量 单位：μg/mL
Table 3 Amount and numbers of amino acids in biscuits,coffee, chips and instant noodles after simulated gastrointestinal digestion
4 结论
除咖啡外，相比食品原样，方便面、薯片和饼干经模拟胃消化后HMF的含量均增加，推测食品中HMF加合物在胃的低pH环境下被释放HMF。经过模拟肠消化后，所有食品中HMF的含量大幅降低，主要是因为HMF与食品蛋白质水解后的游离氨基酸结合形成氨基酸-HMF加合物，其中半胱氨酸可能起重要作用。加合物的细胞毒性大大低于HMF，因此摄入足够量的蛋白质可缓解HMF的危害。
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