马婕馨1，蔡程山1,2，高苏1，方晔晨1，赵国柱1*
1(北京林业大学 生物科学与技术学院，北京，100083)2(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏中心，北京，100015)
摘 要 建立了一种较为系统的蛹虫草液体发酵产SOD的培养条件。以4种来源蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株YCC-B、YCC-C、YCC-W、YCC-Y为研究对象，以生物量和SOD活性为指标，筛选出SOD高活性菌株。之后优化SOD高活性菌株的液体发酵条件，以生物量、SOD清除超氧阴离子能力(清除率)、酶活力和比活力为测定指标，选取接种量、装液量和pH展开3因素3水平的正交实验。经筛选，得到SOD高活性菌株为YCC-W。通过优化YCC-W的液体发酵条件，得出最佳组合为接种量4%，装液量100 mL/250 mL和pH 5.5。SOD清除率可提高41.17%，达到54.84%；SOD酶活力可提高42.04%，达到19.74 U/mL；比活力可提高44.23%，达到56.34 U/mg。该研究提供了通过蛹虫草菌丝体发酵产SOD的方法，在替代传统动物血液获取SOD上具有一定的应用前景；通过系统优化发酵条件SOD活性得到显著提升，通过继续扩大实验规模，有望用于SOD的规模化生产。
关键词 蛹虫草；SOD；发酵
第一作者：硕士研究生(赵国柱副教授为通讯作者，E-mail：zhaogz@im.ac.cn)。
基金项目：国家自然科学基金(31570019)
收稿日期：2019-01-14，改回日期： 2019-02-25
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019951
蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北虫草、北冬虫夏草等，是虫草属的模式种[1]，其食用与药用保健功能已被广泛关注。蛹虫草具有抗菌、消炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等功效，富含虫草素、虫草酸、虫草多糖、虫草超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等成分[2-6]。研究表明蛹虫草在某些活性成分上，甚至要高于冬虫夏草[7-9]，并且已经实现规模化人工培育[10]而常被认为是野生冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)的主要替代品[11-12]。因此，人工培育蛹虫草及发酵虫草菌筛选药用保健活性成分，成为虫草研究的重要方向。
SOD是一种生物活性蛋白质，可通过对细胞内超氧化物自由基的清除，帮助人体延缓衰老、对抗炎症、抵御疾病，防御由自由基过量造成的氧毒性[13]，在临床[14-16]、食品[17-19]等领域已有广泛应用。传统的SOD多从动物血液里提取，需要饲养动物，技术和成本要求较高。另外，血液来源的SOD用在人体上存在着排他性、交叉感染等安全性风险，在一定程度上限制了开发应用。研究发现蛹虫草可以产生高活性的SOD[20]，其菌丝体的SOD酶活力甚至高于子座的SOD酶活力[21-22]。目前市场上的蛹虫草多以食用子实体(子座)为主要形式[23]，SOD的吸收、转化效率及功能难以有效发挥，以工业发酵生产方式提取SOD将成为今后发展的重要方向，并且蛹虫草液体培养还具有耗时短、易操作等优点。本研究通过筛选蛹虫草SOD高活力菌株，采用液体培养的方式优化其培养条件，为蛹虫草SOD发酵生产提供参考。
1.1.1 供试菌株
蛹虫草菌株YCC-B为市场购买商品化蛹虫草，经分离纯化获得菌株；YCC-C为收集商品栽培菌株；YCC-W由中国科学院真菌学国家重点实验室提供；YCC-Y为采自河北秦皇岛的野生蛹虫草分离菌株。
1.1.2 试剂与仪器
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、蛋白胨、蔗糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、HCl、磷酸、无水乙醇、EDTA、牛血清白蛋白、VB1、考马斯亮蓝G-250、Tris-HCl、ddH2O、邻苯三酚，上述试剂均为分析纯：购自北京易秀博谷生物科技有限公司。
752型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TG16A-WS离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9626A鼓风数显干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HZC-250全温振荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；SPX-250生化培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；OMEGA真菌DNA小量提取试剂盒(D3390-01)，北京华诚兴达科技有限公司。
按照真菌DNA提取试剂盒的操作步骤，提取4种来源的蛹虫草全基因组，进行ITSrDNA基因PCR扩增，通用引物：ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[24]；PCR条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物电泳检测后，送生工生物工程股份有限公司(北京测序部)测序，所得序列校对后，在NCBI中进行BLAST比对分析。
1.3.1 菌株活化
将存于4 ℃冰箱的4种蛹虫草菌株分别接种于PDA斜面培养基，于21 ℃生化培养箱中避光培养至菌丝布满培养基。
1.3.2 种子液制备
用接种针从活化培养基中挑取约1cm2的菌块，接种于种子液培养基(蔗糖2%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO4 0.1%)，于全温振荡培养箱中培养84h，条件为装液量100 mL/250 mL三角瓶、26 ℃、130 r/min[25]。
1.3.3 液体培养
将种子液接种于基础发酵培养基(蔗糖2%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO4 0.1%、维生素B1 0.002%)，全温振荡培养箱中培养。
1.4.1 生物量测定
将液体发酵培养物经纱布过滤，蒸馏水冲洗数次后，将获得的菌丝体于40 ℃烘干至恒重，测定菌丝体干重，以衡量其生物量大小。
1.4.2 粗酶液的提取
参考杜琳等[26]的方法，对菌丝体中的SOD进行粗提。称取0.1 g菌丝体粉末，加入1 mL PBS缓冲液超声提取10 min，4 500×g离心10 min，取上清液，在沉淀中加入1 mL PBS缓冲液再次离心，合并两次上清液，添加固体硫酸铵至质量浓度为340 g/L，9 000×g 离心3 min留沉淀。加入2 mL PBS缓冲液溶液，获得粗酶液。
1.4.3 SOD清除超氧阴离子能力(清除率)和酶活力测定
采用邻苯三酚自氧化法[27]测定SOD总酶活力，在试管中依次加入缓冲液和双蒸水，与25 ℃预热的邻苯三酚(对照组用10 mmol/L HCl代替)混合，摇匀后迅速加入比色皿中，在波长420 nm处每0.5 min测定1次吸光度A0，共测4 min，计算自氧化组溶液吸光度值随时间的变化率ΔA0。样品测定：加入1 mL 样品液，相应减少同体积双蒸水，其余试剂添加同自氧化组，测定加入样品后的自氧化速率ΔA1。SOD酶活性单位定义为每分钟每毫升反应液邻苯三酚自氧化被抑制50%所需酶量为1个活力单位。按照公式(1)、(2)，计算清除率和酶活力:
清除率
(1)
酶活力
(2)
式中，ΔA0-对照管吸光度(自氧化速率)；ΔA1-测定管吸光度(加入酶后的氧化速率)；n-稀释倍数；V0-定义体积，1 mL；Va-反应总体积；Ve-加入酶体积。
1.4.4 SOD粗酶液蛋白含量及比活力测定
采用考马斯亮蓝法[28]绘制蛋白标准曲线并测定样品蛋白含量。编号的标准蛋白试管后加入试剂，摇匀后放置2 min，在595 nm测定吸光度，以牛血清蛋白含量(μg)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。另取1支试管，准确加入0.1 mL样品提取液，再加入0.9 mL蒸馏水。与5 mL考马斯亮蓝G-250试剂混匀后，放置2 min，以标准曲线0号试管作空白对照。在595 nm测定吸光度，并在标准曲线上查得相应蛋白含量。根据公式(3)，计算出样品对应的比活力值。
比活力
(3)
式中,酶活力，U/mL；蛋白含量，mg/mL。
1.5.1 单因素优化
以接种量、装液量、培养基pH、温度和培养天数为单因素，按照表1依次进行优化，每个因素5个水平，每个水平重复3次，以生物量、SOD活性为测定指标，并采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，不同处理组间比较采用One-way ANOVA检验，确定最佳单因素水平。
1.5.2 正交实验设计
借助“正交实验设计助手Ⅱ”软件，以接种量、装液量和培养基pH为因变量，展开3因素3水平的正交实验，分别以生物量、SOD活性为测定指标，确定最佳培养条件组合。
表1 液体培养条件单因素优化实验设计
Table 1 Single factor optimization experiment design for liquid culture conditions
经生物公司测序后，所得序列于NCBI中BLAST序列比对后，复核4株菌株均为蛹虫草。
根据1.4.4方法，经计算得标准方程为y=0.005 2x+0.026 8，其中x为牛血清白蛋白质量浓度(μg/mL)，y为595 nm处的吸光度值，R2=0.991 7，回归性较好，具有可信度。
按照1.4的方法，得到YCC-B、YCC-C、YCC-W和YCC-Y 4个菌株的生物量、SOD活力数值如图1。
图1 不同菌株的SOD活力及生物量
Fig.1 SOD activity and biomass of different strains
YCC-W菌株虽然生物量值较小，但其SOD活力(清除率、酶活力、比活力)较显著优于其他3个菌株(P<0.05)，因此YCC-W为SOD高活力菌株，以此展开后续研究。
2.4.1 接种量组
分别以1%、3%、5%、7%、10%的接种量将种子液接种于液体发酵培养基中，其余条件(温度26 ℃，装液量100 mL/250 mL三角瓶，pH自然，培养时间2 d，转速150 r/min)均一致，并分别设置3组平行实验。由图2可以得出，生物量随接种量增加而增加，当接种量为10%时生物量最大；接种量为3%时酶活力与比活力的值最佳，且差异显著(P<0.05)。因实验主要以SOD活性为测定指标，所以后续单因素实验选取的接种量为3%。
图2 菌株YCC-W在不同接种量下的SOD活性
Fig.2 SOD activity of strain YCC-W in different inoculation levels
2.4.2 装液量组
以60、80、100、120、140 mL的不同装液量将液体发酵培养基分装于250 mL三角瓶中，其他条件(接种量3%，温度26 ℃，pH自然，培养时间2 d，转速150 r/min)均一致，并设置3组平行实验。由图3得，装液量为120 mL时生物量高于其他几组，而装液量为100 mL时酶活力与比活力的值最佳，且差异显著(P<0.05)，后续单因素实验选取的装液量为100 mL/250 mL三角瓶。
图3 菌株YCC-W在不同装液量下的SOD活性
Fig.3 SOD activity of strain YCC-W in different liquid medium
2.4.3 pH值组
分别将发酵培养基的pH值调成4、5、6、7、8，其余条件(接种量3%，装液量100 mL/250 mL三角瓶，温度26 ℃，培养时间2 d，转速150 r/min)均一致，分别设置3组平行实验。由图4可以看出，pH为8时生物量最大，pH为5时酶活力与比活力值最佳，且差异显著(P<0.05)，后续单因素实验选取的发酵培养基pH值为5。
图4 菌株YCC-W在不同pH下SOD活性
Fig.4 SOD activity of strain YCC-W in different pH
2.4.4 培养天数组
以1、2、3、4、5 d不同时间进行培养，其余条件(接种量3%，装液量100 mL/250 mL三角瓶，pH 5，温度26 ℃，转速150 r/min)均一致，并分别设置3组平行实验。由图5可以看出，培养时间为4 d时生物量最大，培养时间为2 d时酶活力与比活力的值最佳(P<0.05)。但在培养至4 d时，菌丝体出现裂解，致使发酵液浑浊，因此后续单因素实验选取的培养时间为2 d。
图5 菌株YCC-W在不同培养时间SOD活性
Fig.5 SOD activity of strain YCC-W in different culture days
2.4.5 培养温度组
以22、24、26、28、30℃不同温度进行培养，其他条件(接种量3%，装液量100 mL/250 mL三角瓶，pH 5，培养时间2 d，转速150 r/min)均一致，分别设置3组平行实验。由图6可知，温度为24 ℃ 时酶活力与比活力的值最佳，且差异显著(P<0.05)，而26 ℃时生物量最大。因此24 ℃较适合作为维持SOD高活性的培养温度。
图6 菌株YCC-W在不同温度下SOD活性
Fig.6 SOD activity of strain YCC-W in different temperatures
经过对单因素实验数据的总结与分析，选取pH(因素A)、装液量(因素B)、接种量(因素C)这3个因素，以L9(34)正交表进行3因素3水平的正交实验设计，利用“正交设计助手Ⅱ”软件分别以SOD清除超氧阴离子能力(清除率)、酶活力、比活力和生物量为自变量进行分析，得到直观分析表(表2)和方差分析表(表3)。
表2 菌株YCC-W的3因素3水平正交实验及直观分析
Table 2 Orthogonal experimental visual analysis table of YCC-W
表3 菌株YCC-W的SOD清除率方差分析
Table 3 SOD clearance rate analysis of YCC-W
注：α=0.05时显著差异水平，*表示有显著差异。
从表2、表3可以看出，3个因素对SOD的清除率影响从大到小为pH>装液量>接种量，其中pH的改变对清除率有显著影响，pH为5.5时清除超氧阴离子效果最好；装液量的改变对清除率也有显著的影响，100 mL和110 mL三角瓶(250 mL)装液量的均值相等，考虑到经济成本，装液量为100 mL/250 mL三角瓶时最佳；接种量的改变则对清除率无显著影响，4%的接种量最佳。3个因素对比活力的影响从大到小为装液量> pH >接种量，但它们的改变对比活力均无显著影响。3个因素对生物量的影响从大到小为接种量> pH >装液量，而它们的改变对生物量同样均无显著影响。综合以上数据，得出蛹虫草菌丝体高SOD活性的培养条件为pH 5.5、装液量100 mL/250 mL三角瓶和接种量4%。SOD清除率最高可提高41.17%，可达到54.84%；SOD酶活力可提高42.04%，达到19.74 U/mL；比活力可提高44.23%，可达到为56.34 U/mg。
对4种来源的蛹虫草菌株进行复核，经初步筛选，得出YCC-W菌株为高活性SOD菌株。单因素优化YCC-W菌株菌丝体SOD活性表明，当以生物量为测定指标时，接种量10%、装液量120 mL/250 mL三角瓶、pH 8、培养时间4 d、温度24 ℃为最佳，组间差异显著(P<0.05)；而以SOD活性为测定指标时，接种量3%、装液量100 mL/250 mL三角瓶、pH 5、培养时间2 d、温度24 ℃为最佳，组间差异显著(P<0.05)。在单因素实验基础上，以液体发酵培养基pH、装液量和接种量为因素，展开3因素3水平正交实验，确定了蛹虫草菌丝体高SOD活性的培养条件为pH 5.5、装液量100 mL/250 mL三角瓶和接种量4%。
本研究中，当分别以菌丝体干重和活性成分SOD为测定指标时，5个单因素的最佳数值存在一定差异，说明在培养过程中菌体生物量与SOD的活性并不完全同步，在实际发酵生产中，不能只注重培养物的产量，更要重点关注特定活性成分的产生及其功效和品质。研究同时发现，SOD活性并不随生物量的改变而改变，二者似乎不具有线性关系。正交实验及方差分析，发现pH的改变对SOD活力的变化影响较大，说明蛹虫草菌丝体中的SOD对pH较敏感，高于或低于最适pH时，其活性基团的解离状态可能会发生改变，影响了酶和底物的结合力，造成SOD活力下降。
目前关于蛹虫草的优化培养研究，多注重对培养基成分的改变而忽视了培养条件(接种量、装液量、pH、培养时间、温度等)的影响。蛹虫草在培养发酵过程中，由于菌株、实验条件、培养方式、测定方法差异，其产生的活性化学成分种类、含量及药理作用可能会不同[29]。XIONG等[30]研究表明，用不同培养基培养蛹虫草菌丝体时，以及用不同基质培养子实体时，其转录表达谱都存在差异。贺佳[13]通过实验测得蛹虫草子实体中SOD粗酶液比活力为39.0 U/mg；李万芳等[20]测定北虫草中SOD粗酶液酶活力为 823.57 U/g，平均比活为 36.22 U/mg；刘晓红等[31]比较鲜蛹虫草与干蛹虫草抗氧化活性和活性物质差异发现，鲜蛹虫草子实体的SOD粗酶液比活力为50.3 U/mg，干蛹虫草为37.6 U/mg。本研究通过优化，得到的蛹虫草菌丝体SOD粗酶液比活力可达56.34 U/mg，与其他研究中子实体SOD粗酶液比活力相近甚至要高，与王奇等[21]和梁迪思等[22]的研究一致。另外，本研究发现液体培养2 d时SOD活性最高，这与子实体培养相比(一般需要50～60 d)大大缩短了收获SOD的时间。因此，在进一步蛹虫草规模化SOD发酵生产之前，对培养条件的摸索和优化是十分必要的。本研究在实验条件下完成，取得了较好的结果，进一步将结合SOD纯化实验和发酵罐扩大实验，完善规模化生产蛹虫草SOD的各种条件，为今后蛹虫草SOD的进一步研究和规模化发酵生产奠定基础。
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MA Jiexin1, CAI Chengshan1,2, GAO Su1, FANG Yechen1, ZHAO Guozhu1*
1(College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China) 2(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)
ABSTRACT To establish a fermentation process to produce SOD by Cordyceps militaris, the biomass and SOD activity of the mycelia from four strains of C. militaris,YCC-B, YCC-C, YCC-W, and YCC-Y, were examined. Of which, C. militaris YCC-W produced the highest activity of SOD. The optimized fermentation condition for producing SOD from YCC-W was as follows: 4% inoculum, 100 mL working volume in a 250 mL flask, and at pH=5.5. Under this condition, the SOD activity was 19.74 U/mL (increased 42.04%) and the specific activity was 56.34 U/mg (enhanced by 44.23%). Besides, the removal rate of SOD increased by 41.17% and reached 54.84%. In conclusion, this study provides a new method for producing SOD by C. militaris fermentation, which shows a certain application prospect in replacing traditional animal blood to obtain SOD.
Key words Cordyceps militaris; SOD; fermentation