李晓毓1，曹莹莹2，耿雪晴1，李昆1，徐子豪1，杨森1，姚婷3*
1(黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山，245041)2(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州，730050) 3(黄山学院现代教育技术中心，安徽 黄山，245041)
摘 要 该文主要探讨魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan, KGM)作为脂肪替代品对中式香肠品质及凝胶特性的影响。将不同量的KGM(添加量(质量分数)为0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)添加于中式香肠中，通过比较低脂香肠与普通香肠在蒸煮损失、脂肪含量、蛋白质含量、感官评价等方面的差异，确定KGM最佳添加量；在此基础上，提取对肉糜类制品的质构特性起主要作用的肌球蛋白，与不同比例的KGM制成混合凝胶，借助红外光谱、荧光光谱以及扫描电镜技术分析其存在状态和分子构象的变化，探讨KGM对凝胶特性的影响。结果表明，添加KGM的香肠样品蒸煮损失明显减小，香肠中脂肪含量降低，蛋白质含量增加，综合感官评定及整体接受性得出，KGM最佳添加量(质量分数)为1.5%；红外、荧光以及电镜分析表明，添加KGM对肌球蛋白凝胶形成影响显著，KGM与肌球蛋白间形成了新的氢键，从而结合形成稳定而致密的网状结构，其中KGM添加量(质量分数)为1.5%时结构最为致密。
关键词 魔芋葡甘露聚糖(KGM)；脂肪替代品；中式香肠；品质；表征分析
第一作者：李晓毓(硕士，副教授)和曹莹莹(博士，副教授)为共同第一作者(姚婷副教授为通讯作者，E-mail：yting@hsu.edu.cn)。
基金项目：安徽省高校自然科学研究项目(KJ2013B270)；安徽省大学生创新创业项目(AH201610375024); 国家大学生创新创业训练计划项目 (201610375037，201810375008，201810375037)；黄山学院自然科学基金项目(2015xkj011)
收稿日期：2018-09-29，改回日期：2018-11-15
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.018934
脂肪是人体营养所必需的，但摄入过多可能带来肥胖、脂肪肝、高血脂等危害[1-2]，低脂/无脂食品逐渐受到人们的喜爱。在肉制品生产中，低脂肉制品已成为一种发展趋势。将脂肪替代品魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan，KGM)应用于低脂肉制品中具有与传统肉制品相似的感官性状，但在人体内被消化释放的能量又比天然油脂少或者不被消化，既降低了传统肉制品的脂肪含量又弥补了口味的损失，同时预防了疾病的发生，有着广阔的发展前景[3]。
KGM是一种天然、安全、营养、且具有减肥、降血脂等生理功能的食品添加剂，被认为是天然的脂肪代替物，具有很好的改善肉制品品质的作用。陈洁等[4]发现KGM的加入改善了重组火腿的物性，使其咀嚼性降低，弹性改善；倪学文等[5]在混合肉糜添加不同量KGM可明显改善肉糜的质构特性和凝胶特性；刘虎成等[6]用复配魔芋胶部分代替肉制品中的脂肪可使其外观、口感、持水性等各方面达到模拟高脂肉制品的要求；孙姣林等[7]用魔芋精粉-猪皮浆-淀粉制备混合凝胶50%替代肥肉丁生产中式香肠取得较好的效果；扶庆权等[8]将魔芋复配胶0.6%加入香肠类产品中，产品质构有明显提升；CHIN等[9]利用魔芋粉-淀粉共混物作为脂肪替代品用于香肠中，香肠感官品质无不良影响，脂肪含量从30%下降到2%。目前，关于KGM的研究多集中在物性学分析、感官评价方面[4-13]，深入探讨KGM与蛋白质作用机制、改变食品物性的机理等研究较少。
在肌肉与肌原纤维蛋白层面探讨KGM与蛋白质作用机制的研究常受限于其复杂的体系，因此针对单体蛋白的基础研究非常必要。占肉总重15%～22%的肌肉蛋白主要有三类：肌浆蛋白(水溶性蛋白)、肌原纤维蛋白(盐溶性蛋白)和基质蛋白(不溶性蛋白)。肌球蛋白是肌肉中含量最高也是最重要的蛋白质，约占肌原纤维蛋白质的50%～55%，占肌肉总蛋白质的1/3，具有很好的凝胶能力，在加热或者高压下发生变性聚集形成凝胶，从而影响到肉制品的质构、外观和出品率，被认为是在肉制品质构特性中起主要作用的蛋白质[14-15]。基于此，本文以KGM作为脂肪替代品应用于中式香肠中，通过比较与普通肉制品在颜色、蒸煮损失、脂肪含量、蛋白质含量、感官评价等方面的变化确定KGM最佳添加量；同时在此基础上提取对肉糜类制品的质构特性起主要作用的肌球蛋白，将不同配比的KGM与肌球蛋白混合制成凝胶，利用红外光谱、荧光分析、扫描电镜等技术，从肌球蛋白分子结构/构象变化和各种化学作用力对凝胶形成贡献的角度，探讨KGM对中式香肠中肌球蛋白热凝胶形成的具体作用，为低脂凝胶类肉制品的开发提供理论指导和技术支持。
材料：新鲜猪肉，购于黄山市大润发超市；KGM(食品级)，符合国家食品添加剂标准要求。
试剂：NaOH，K2HPO4，KH2PO4，KCl，乙二胺四乙酸(EDTA)，焦磷酸钠，哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)，Na2HPO4，(NH4)2SO4，上海国药集团，所有试剂均为分析纯。
台式高速离心机(TG16-WS型)，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HH6-数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；电子分析天平(AUY220型)，日本岛津；扫描电镜(S-3400N型)，日本日立公司；荧光光谱仪(F-4500型)，日本日立公司；傅立叶红外光谱仪(Nicolet 380型)，美国Nicolet公司。
1.3.1 中式香肠的制备
试验设6个处理组，均采用相同加工工艺，流程如下：称取新鲜猪肉十斤，瘦肉与肥肉的质量比为7∶3。 将瘦、肥肉分别切成小丁，肥肉切丁后用温水洗净滤干。将白酒(60°大曲酒100 g)、白砂糖(150 g)、食盐(100 g)、生抽(100 g)等调料放入盆中，倒入肥肉丁搅拌均匀，腌制1～2h，再放入瘦肉一起搅拌均匀。最后放在绞肉机(孔径：1～1.2 cm)内绞碎。分别加入质量分数为0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%的KGM与瘦肉和肥肉丁搅拌均匀；灌肠(猪肠衣)后置于日光下曝晒，烘烤，自然风干。
1.3.2 蒸煮损失的测定
香肠经过蒸煮过后，冷却至室温，称重，每组测3个平行样。香肠蒸煮损失的计算式如公式(1)：
(1)
式中：L为香肠蒸煮损失的质量分数；N0为蒸煮之前香肠的质量,g；N1为蒸煮之后香肠的质量，g。
1.3.3 蛋白质及脂肪含量的测定
蛋白质含量的测定参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》方法一[16]。脂肪含量的测定参照GB 5009.6—2016 《食品中脂肪的测定》方法二[17]。
1.3.4 表征分析
采用2003年徐幸莲[18] 的方法提取猪肉糜中的肌球蛋白，将提取的肌球蛋白稀释到20 mg/mL(溶于0.6 mol/L NaCl pH 6.5，20 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4， 磷酸盐缓冲液)。加入不同水平的KGM(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)混合，在65 ℃ 条件下水浴加热，使之呈现为凝胶状态。将其倒置在干净的托盘中，放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥8～12 h后成粉末状，待用。
1.3.4.1 红外分析
采用KBr压片法，分辨率为4 cm-1，对混合凝胶样品在4 000～400 cm-1范围进行扫描。
1.3.4.2 荧光分析
激发波长463 nm，扫描范围：300～800 nm，扫描速率：2 400 nm/min，λex为5.0 nm，λem为5.0 nm。
1.3.4.3 电镜扫描
将样品置于-38 ℃低温冷冻24 h，冻干后的混合凝胶样品经真空离子喷金，在扫描电镜下观察内部结构。
1.3.5 香肠的感官评定
感官评定由8位有经验的学生组成的感官评定小组完成。随机抽取等量的香肠样品放入盘中，100 ℃下蒸15 min，切成均匀薄片进行评定。感官评分标准列于表1。
表1 中式香肠感官评分标准表
Table 1 Criteria of sensory evaluation on Chinese-style sausage
2.1.1 KGM对香肠蒸煮损失的影响
蒸煮损失是肉制品加工中的一个重要指标，蒸煮损失越少，其肉制品的质量就越好，产品率就越高。图1为KGM不同添加量对香肠蒸煮损失的影响，可以看出6种添加量均存在显著差异(P<0.05)，KGM添加量为1.5%时蒸煮损失最小。表明KGM可以与水分子通过氢键、分子偶极、瞬时偶极等作用力聚集成庞大而难以自由运动的大分子从而将水分子固定[19]，同时，与香肠中的蛋白质形成络合物，形成致密的网状结构，进一步将水分子固定[20]，有效减少了蒸煮过程中带来的损失，使得香肠具有很好的弹性和保水性，提高肉制品质量。
图1 KGM添加对蒸煮损失的影响
Fig.1 Effects of KGM on the cooking loss
2.1.2 KGM对香肠脂肪含量、蛋白质含量的影响
对添加不同量KGM制成的中式香肠其蛋白质含量进行单因素方差分析可以看出，6种添加量均存在显著差异(P<0.05)。由图2可知，空白组样品中脂肪提取量为38.44 g/100 g；添加KGM的样品中，脂肪提取量均低于空白组，其中KGM添加量为1.5%的样品中脂肪含量减少最多，减幅为36.6%。这与已报道的文献结果相符[12-13,21]。
图2 KGM添加对脂肪提取量的影响
Fig.2 Effects of KGM on fat extraction
对添加不同量KGM制成的中式香肠其蛋白质含量进行单因素方差分析可以看出，6种添加量均存在显著差异(P<0.05)。由图3可知，添加KGM的香肠样品蛋白质提取量明显高于空白样品，KGM添加量增至1.5%的过程中，蛋白质的提取量逐渐增加，由7.65%增至22.84%，一定程度上反映了添加KGM对中式香肠中蛋白质的含量有影响。
图3 KGM添加对蛋白质含量的影响
Fig.3 Effects of KGM on protein extraction
2.1.3 感官评定分析
感官评定主要根据评定小组人员食用香肠后对其视觉、触觉、味觉以及整体接受度进行评价分析。由香肠感官评定标准和结果(表1和2)可知，未添加KGM、KGM添加量为0.5%和1.0%的香肠颜色呈暗红色，且普遍较硬；而随着KGM的添加量由1.5%升至2.5% 时，部分香肠颜色由暗红色转成红棕色，质地由较硬变为松软，评定人员对香肠的接受程度也随着KGM添加量的增加而增加。这可能是由于KGM本身具有甜味，加入到香肠后，和香肠中蛋白质结合形成具有弹性的凝胶，使得香肠变的松软，从而产生独特的咸甜风味。因此，香肠中KGM添加量为1.5%和2.5%时口味最佳，接受程度最高。
表2 中式香肠感官评定
Table 2 Results of sensory evaluation on Chinese-style sausage
综上所述，添加KGM以及添加不同量的KGM对中式香肠的蒸煮损失、蛋白质含量和脂肪含量均有影响。KGM添加量为1.5%时蒸煮损失最小，脂肪含量最少，蛋白质含量最多，综合感官评价，接受程度也高，最终确定KGM最佳添加量为1.5%。
2.2.1 红外分析
KGM标准样品、肌球蛋白样品以及混合凝胶样品的红外光谱图如图4所示。添加1.0%，1.5%，2.0% KGM的混合凝胶样品、KGM标准品以及肌球蛋白样品相同的羟基伸缩振动峰都为3 449 cm-1，但KGM标准品的羟基伸缩振动峰峰形较宽；添加1.0%，1.5%，2.0%KGM的混合凝胶样品、KGM标准品以及肌球蛋白相同的-COCH3伸缩振动峰都在1 651 cm-1附近，与肌球蛋白标准品伸缩振动峰相比，加入KGM的混合凝胶样品的-COCH3伸缩振动峰有所增强；肌球蛋白标准品在1 023 cm-1附近无明显特征峰，而在加入KGM后各混合凝胶样品分别出现了吸收峰，属于C-O 伸缩振动峰，且KGM添加量为1.5%的峰形最宽；776 cm-1附近属于C-H面的弯曲振动，在添加KGM之后的样品相对强度较KGM标准品和肌球蛋白有所增加，其中KGM添加量为1.5%时样品的相对强度增加最大。这是由于KGM分子与肌球蛋白分子2种分子间形成了新的较强的氢键，KGM分子中的-COCH3基团和-OH基团与肌球蛋白分子中的羟基相互作用并产生了良好稳定性，这是多糖分子与蛋白质分子相互作用的结果，KGM的加入使香肠的结构更加紧密，稳定性和韧性等都得到明显改善[22]。
a-1.0% KGM；b-1.5% KGM；c-2.0% KGM；d-myosin；e-KGM。
图4 不同混合凝胶样品红外光谱图
Fig.4 Infrared spectrum of different myosin mixed gel
2.2.2 荧光分析
图5列出了肌球蛋白标准品和混合凝胶样品的荧光光谱图。由图5-A，5-B，5-C可知，1.0%，1.5%和2.0%混合凝胶样品的发射峰在440～650 nm，主峰峰值分别为463、463和454 nm。
A-KGM添加量为1.0%；B-KGM添加量为1.5%；C-KGM添加量为2.0%；D-肌球蛋白
图5 不同混合凝胶样品荧光光谱图
Fig.5 Fluorescent spectrograms of different mixed gel
与肌球蛋白(图5-D)相比，1.0%混合凝胶的荧光强度比肌球蛋白的荧光强度略强，且随着KGM含量增加，1.5%和2.0%混合凝胶的荧光强度明显增强，其中2.0%的混合凝胶荧光强度达1.00 A.U。推测可能是KGM与肌球蛋白结合发生相互作用，使得肌球蛋白的荧光集团的环境发生改变，荧光效应增强。这与红外分析结果趋势相一致。
2.2.3 微观结构分析
图6分别列出了肌球蛋白样品，KGM标准品和混合凝胶样品的显微结构图。由图6可知，肌球蛋白(图6-D)表面光滑，呈片状，结构松散，有许多的小颗粒状物质分布，这使得肌球蛋白本身水分保持能力较差；添加KGM 1.0%(图6-A)、1.5%(图6-B)、2.0%(图6-C)的混合凝胶样品中蛋白质与KGM相互连接，形成致密的网状结构，网状结构中的空隙有助于牢牢将水分子固定住，并能阻止水分及其营养物质的流失[23-28]。
A-KGM添加量为1.0%；B-KGM添加量为1.5%；C-KGM添加量为2.0%；D-肌球蛋白；E-KGM标准品
图6 不同混合凝胶样品扫描电镜图
Fig.6 Scanning electron micrographs of different mixed gel
其中，1.5%的混合凝胶样品(图6-B)中蛋白质与KGM的结构尤其紧密，蛋白质将KGM紧紧包裹住，网状结构之间的空隙更小，使得其产生更好的持水能力，保留脂肪等营养物质的能力，与本文添加KGM对蒸煮损失、感官测定和营养物质分析的结果一致。
将KGM添加到肉制品中对其品质及凝胶特性均有影响。添加KGM的香肠样品蒸煮损失明显减小，保水性增强，脂肪含量降低，蛋白质含量增加，结合感官评定综合得出，KGM最佳添加量(质量分数)为1.5%；在此基础上，进一步提取对肉糜类制品的质构特性起主要作用的肌球蛋白，与不同比例的KGM制成混合凝胶，红外、荧光以及电镜分析表明，添加不同KGM对肌球蛋白凝胶形成影响显著，KGM与肌球蛋白间形成了新的氢键，从而结合形成稳定而致密的网状结构，其中，KGM添加量(质量分数)为1.5%时结构最为致密。综合感官评定及整体接受性得出，低脂香肠制备中KGM添加量(质量分数)为1.5% 时，香肠蒸煮损失小，蛋白质的含量增加及脂肪含量降低明显，形成的网状结构稳定致密，凝胶特性，持水能力、弹性、口感均较好。
参考文献
[1] VURAL H, JAVIDIPOUR I, OZBAS. Effects of interesterified vegetable oils and sugarbeet fiber on the quality of frankfurters[J]. Meat Science, 2004,67(1):65-72.
[2] CARBALLO J,BARRETO G,JIMENEZ C F.Starch and egg white influence on properties of bologna sausage as related to fat content[J].Journal of Food Science,2010,60(4):673-677.
[3] 刘怀伟,孔保华,徐聃.脂肪替代物及其在肉制品中的应用[J].肉类研究,2006,20(7):28-31.
[4] 陈洁,张科,杜金平,等. 魔芋葡甘聚糖及其衍生物对禽肉重组火腿物性的影响[J].食品科学, 2010,31(13):36-39.
[5] 倪学文，严文莉，汪芳丽,等.魔芋胶对鸡肉和猪肉混合肉糜凝胶特性的影响[J].食品工业科技, 2015,36(8):305-308.
[6] 刘虎成,李洪军,刘勤晋,等.魔芋胶在低脂肉糜制品中的应用研究[J].肉类研究,2000,229(7):44-46.
[7] 孙姣林,夏延斌.中式香肠中肥肉丁替代物的研究[J].食品与机械.2010,26(6):131-134.
[8] 扶庆权，师文添.拉胶和魔芋胶的复配及其在香肠类产品中的应用[J].肉类研究,2008,116(10):28-30.
[9] CHIN B K,KEETON J T,MILLER R K,et al.Evaluation of konjac blends and soy proteinisolate as fat replacements in low-fat bologna[J].Journal of Food Science,2000,65(5):756-763.
[10] JIMÉNEZ-COLMENERO F, COFRADES S, L
PEZ-LPEZ, et al. Technological and sensory characteristics of reduced/low-fat, low-salt frankfurters as affected by the addition of konjac and seaweed [J].Meat Science,2010,84(3):356-363.
[11] RUIZ-CAPILLAS C, TRIKI M, HERRERO A M, et al. Konjac gel as pork backfat replacer in dry fermented sausages: Processing and quality characteristics[J]. Meat Science, 2012, 92(2):144-150.
[12] 安攀宇.低脂低钠传统中式香肠的研究[D].昆明:云南农业大学,2012.
[13] 曲超.一种脂肪替代品的制备及其在低脂肉制品中的应用[D].哈尔滨:东北林业大学,2010.
[14] 韩敏义,徐幸莲,周光宏.肌球蛋白及其凝胶特性[J]. 江苏农业科学.2003,26(3):67-70.
[15] 曹莹莹,张亮,王鹏,等.超高压结合热处理对肌球蛋白凝胶特性及蛋白二级结构的影响[J].肉类研究，2013, 27(1):1-7.
[16] 中华人民共和国国家标准.GB 5009.5—2016，食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2016.
[17] 中华人民共和国国家标准.GB 5009.6—2016，食品安全国家标准食品中脂肪的测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2016.
[18] 徐幸莲. 兔骨骼肌肌球蛋白热诱导凝胶特性及成胶机制研究[D]. 南京:南京农业大学，2003.
[19] 杨湘庆,沈悦玉.魔芋胶的理化性、功能性、流变性及其在食品中的应用[J]. 冷饮与速冻食品工业，2002,8(4):29-33.
[20] 许时婴,李博,王璋.复配胶在低脂肉糜制品中的作用机理[J]. 无锡轻工大学学报,2006,15(2):102-108.
[21] HUANG C C,SU H P,LIN C W.Utilization of konjac in low-fat Chinese-style sausage[J].Food Science(Taiwan),1998,25(4): 437-445.
[22] 张艳玲,夏远,朝格图,等. 野菊花不同提取物的红外光谱分析[J].光谱学与光谱分析,2012,32(12):3 225-3 228.
[23] 王伟,汪梦非,姚遥,等. 魔芋葡甘聚糖对鸭肉盐溶蛋白凝胶特性的影响[J].食品工业科技,2013,34(20)：144-148.
[24] 倪学文,严文莉,汪芳丽,等. KGM对鸡肉和猪肉混合肉糜凝胶特性的影响[J].食品工业科技,2015,36(8)：305-308.
[25] 杨振,孔保华,夏秀芳,等.魔芋粉对鲤鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响[J].食品科学, 2012, 33(11):116-120.
[26] 唐学燕,李博,顾小红,等. KGM对肌肉蛋白质性质的影响[J]. 食品与机械,2000,16(4):25-26.
[27] CHIN K B, GO M Y, XIONG Y L. Konjac flour improved textural and water retention properties of transglutaminase-mediatedt, heat-induced porcine myofibrillar protein gel: Effect of salt level and transglutaminase incubation [J]. Meat Science,2009,81:565-572.
[28] TONG Qunyi, CHEN Long, WANG Weijun, et al.Effects of konjac glucomannan and acetylated distarch phosphate on the gel properties of pork meat myofibrillar proteins[J].Journal of Food Science. 2018, 55(8):2 899-2 909.
LI Xiaoyu1,CAO Yingying2,GENG Xueqing1, LI Kun1,XU Zihao1,YANG Sen1,YAO Ting3*
1(College of Life and Environmental Sciences, Huangshan University, Huangshan 245041, China) 2(College of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China) 3(Modern Educational Technology Center, Huangshan University, Huangshan 245041, China)
ABSTRACT This paper explored the effects of konjac glucomannan (KGM) as a fat substitute on the quality and gel properties of Chinese-style sausage. Different amounts of KGM (0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% and 2.5%) were added into sausages. The optimum addition amount of KGM was determined by measuring differences in cooking loss, fat content, protein content, and sensory evaluation between low-fat sausages and ordinary ones. Additionally, changes in the existence state and molecular conformation of myosin were analyzed to explore the effects of KGM on the gel properties. The results showed that the cooking loss and fat content of the samples reduced obviously, while the protein content increased by KGM. Sensory evaluation and overall acceptability indicated that the optimum addition amount of KGM was 1.5%. Moreover, KGM had significant effects on myosin gel formation. A stable and dense network structure was formed based on new hydrogen bonds formed between KGM and myosin. Therefore, when 1.5% KGM added, the structure was the most compact.
Key words konjac glucomannan(KGM); fat substitute； Chinese-style sausage;quality; characterization analysis