老陈醋是山西省地理标志产品之一，因其独特的制作工艺、风味及营养价值[1]而受到大家欢迎，有“天下第一醋”美誉，已被列入国家级非物质文化遗产。但以低龄醋冒充高龄醋欺骗消费者的情况还时有发生。川芎嗪是山西老陈醋中特征性成分之一，具有抗血栓[2-4]、抗肿瘤[5-7]作用，对人体消化、呼吸等系统具有保护作用[8-11]，其含量在存放期间随着陈放时间的延长逐渐增多[12]。
目前检测川芎嗪的方法主要是传统仪器检测法：高效液相色谱法[13-15]、紫外分光光度法[16-17]、近红外光谱检测法[18-20]等。虽检测结果准确，但仪器庞大不易携带，前处理相对复杂，检测周期长，不适合现场大批量快速筛查[21-22]，而便携式激光拉曼检测仪[23]小型便携、操作简单、检测速度快，适合执法部门在繁重的日常抽检中使用。本研究建立了基于川芎嗪的山西老陈醋醋龄拉曼光谱快速检测方法，该法检测速度快、准确度高、操作简单，不仅适用于实验室检测，也非常适合执法部门现场快速筛查。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山西老陈醋,太原宁化府益源庆醋业有限公司(分别为：新醋、醋龄1、1.5、3、4、5年醋)。
盐酸川芎嗪, 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪盐酸盐(C8H12N2·HCl)(≥98%),北京索莱宝科技有限公司；CCl3(AR),ACN(AR),HCl(AR),CH3CH2OH(CR),天津市申泰化学试剂有限公司；NaOH(AR),NH4H2PO4(AR),天津进丰化工有限公司；纳米增强检测试剂OTR202，OTR103,苏州欧普图斯光学纳米科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA224S电子天平(d=0.01 g)、pH计,德国Sartorius公司；UPT-I-10T超纯水器,四川优普超纯科技有限公司；SC-3610低速离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司；RanTracer-200-QCM便携式激光拉曼光谱仪,上海美谱达仪器有限公司；高效液相色谱仪(紫外检测器),美国Waters公司。
1.3 实验方法
1.3.1 溶液配制
盐酸川芎嗪标准液：参照文献[24]的方法配制。将1 mg/mL川芎嗪标准液分别稀释到5、10、25、50、100、200、500 μg/mL备用。
1.3.2 样品前处理
由于川穹嗪含量是随着年份增加逐渐增加[12]，含量多的时候测定相对准确，稳定性更高，但由于4年醋和5年醋的样品黏稠度太大，提取存在不彻底的可能，因此实验中选择3年醋。
取3年陈放期山西老陈醋10 mL，加NaOH溶液至pH>8，加5 mL CHCl3，萃取。4 000 r/min离心15 min，合并CHCl3相。添加0.2 mol/L HCl 4.4 mL萃取，合并水相，用dH2O定容至10 mL。
取3年陈放期老陈醋待测液，分别加入100、200、500 μg/mL盐酸川芎嗪标准品。
1.3.3 条件参数
便携式激光拉曼光谱仪系统参数：拉曼光谱范围250～2 400 cm-1，激光波长785 nm，CCD像素2 048，光学分辨率<6 cm-1。
条件参数：激光输出功率200 mW，积分时间10 s，积分次数2，平滑系数5，纳米增强试剂V(OTR 202)∶V(OTR103)=5∶1。
1.3.4 川穹嗪拉曼特征峰确定
检测瓶中加入600 μL乙腈溶液进行检测，自动进行基线校正。
向检测瓶中依次加入500 μL纳米增强试剂OTR202、20 μL待测液、100 μL OTR103，振荡后迅速放入检测池开始检测。
对3年陈酿期老陈醋待测液按上述实验方法进行检测，再分别在待测液中添加100、200、500 μg/mL盐酸川芎嗪标准液(体积比为1∶1)进行检测，保存检测结果，对谱图进行分析。
用上述实验方法对配制好的1 mg/mL盐酸川芎嗪标准液进行检测，检测结果与理论计算的拉曼光谱进行比较分析。
1.3.5 检测方法条件优化
待测液按1.3.2方法进行前处理，按照1.3.4实验流程进行检测，对主要影响因素(积分时间、积分次数、平滑系数、激光输出功率、样品量)进行单因素优化实验，测定各检测液峰强。积分时间分别设置为2、5、10、15、20、30 s；积分次数为1、2、5、10、15；平滑系数为2、5、15、20；功率分别为200、250、300、350 mW；检测样品量分别为20、40、50、100 μL。确定各水平最佳范围。
1.3.6 基于川穹嗪的山西老陈醋醋龄拉曼检测方法的建立和评价
1.3.6.1 川穹嗪拉曼光谱检测法标准曲线建立
分别对10、25、50、100、200 μg/mL川穹嗪标准溶液进行检测，建立标准曲线并计算相关性。
1.3.6.2 方法建立
按照1.3.2方法对所取样品(新醋、陈放期为1、1.5、3、4、5年山西老陈醋)进行前处理，每个年份取3个样品平均值，以醋龄为横坐标，3次检测峰强平均值为纵坐标作图。
1.3.6.3 方法评价
(1)精密度。取3年醋龄样品经前处理检测，同一样品重复5次，计算相对标准偏差(RSD)，以RSD值表示该方法的精密度，如公式(1)所示。
(1)
式中：X，特征峰峰强；n=5。
(2)重现性。取3年醋龄山西老陈醋10份，每份样品经前处理后进行检测，记录特征峰峰强，以RSD表示该方法重现性。
(3)添加回收率。取3年醋龄山西老陈醋前处理液，分别加入0.025、0.05、0.1 mg川芎嗪标准品，每组3个平行取平均值，计算加标回收率和变异系数。
1.3.6.4 高效液相色谱法测定山西老陈醋醋龄
色谱柱为Venusil ASB C18(150 mm×4.6 mm)，流动相为V(0.2 mmol/L磷酸二氢铵溶液)∶V(色谱甲醇)=5∶5，流速是0.8 mL/min，紫外检测器检测波长为279 nm，柱温是20 ℃，进样量为10 μL。
在上述色谱条件下将5、10、25、50、100、200 μg/mL川芎嗪标准液分别进样10 μL进行检测，重复3次取平均值，以色谱峰响应值为纵坐标，以样品浓度为横坐标绘制标准曲线。
样品经过前处理，按照上述色谱条件分别取样10 μL进入色谱仪检测，根据标曲计算其川芎嗪含量，进而得出醋龄。
2 结果与分析
2.1 确定川穹嗪拉曼特征峰
2.1.1 初步确定特征峰
通过对谱图分析，结果显示在拉曼位移1 599 cm-1处川芎嗪拉曼峰峰形较好，且随着添加标品量的增多，峰强呈线性关系，与标品特征峰对应非常好，故初步选为本研究特征峰。
2.1.2 确定特征峰
图1是盐酸川穹嗪理论计算拉曼光谱，图2是盐酸川穹嗪实验拉曼光谱。结合量子化学理论密度泛函理论方法计算得到盐酸川穹嗪理论拉曼谱图，通过高斯View 5.0对理论盐酸川芎嗪分子振动模式进行观察，并与实验谱图比较，进行拉曼峰归属分析，可以看出理论计算和实验测得的盐酸川芎嗪拉曼光谱基本一致。在768、1 533 cm-1处的峰在实验检测中没有出现，是因为理论计算与实际分子振动中存在一定的误差，705、736、1 031、1 239、1 300、1 353、1 572、1 599 cm-1等处的峰都是环振动引起，在1 599 cm-1处峰与理论谱图位置基本一致，且峰型较好。
图1 盐酸川穹嗪理论计算拉曼图谱
Fig.1 Theoretical Raman spectrum of ligustrazine hydrochloride
图2 盐酸川穹嗪实验拉曼图谱
Fig.2 Experimental Raman spectrum of TMP
2.2 检测条件优化
2.2.1 积分时间优化
对样品前处理后，设置激光输出功率为200 mW、积分次数2、平滑系数5、样品量20 μL、纳米增强试剂：OTR202和OTR103分别为500 μL和100 μL，积分时间分别设置为2、5、10、15、20、30 s，综合考虑特征峰强度和检测时间，在保证快速检测前提下获得较强特征峰强度，且峰强未发生衰减的时间为最优积分时间。
将拉曼位移1 599 cm-1特征峰放大后如图3所示。可以看出，随着积分时间增加，峰强不断增加，积分时间20 s时峰强最高，当积分时间增加到30 s时，峰强明显降低，故选择积分时间20 s为最佳积分时间。
图3 积分时间优化
Fig.3 Optimization of integral time
2.2.2 积分次数优化
按2.2.1得到的优化条件，设置积分次数为1、2、5、10、15，操作流程同2.2.1进行检测，在保证快速检测的前提下获得较强特征峰强度，且峰强未发生衰减次数为最优积分次数。
图4 积分次数优化
Fig.4 Optimization of number of integral times
由图4可以看出，积分次数在1～10，随着积分次数增加，峰强不断增加，积分次数为10时峰强最高，当积分次数变为15时，峰强降低，故选择积分次数10作为最佳积分次数。
2.2.3 平滑系数优化
上述优化条件下，设置平滑系数为2、5、15、20，操作流程和判断依据同2.2.1。从图5可以看出平滑系数越大，谱线越光滑，但平滑系数过大会使结果失真，图中平滑系数20时谱线明显有偏移且峰强降低，在平滑系数为15时，峰型最好且峰强最高，此时的平滑系数更有利于谱图分析，故选择平滑系数15为最佳平滑系数。
图5 平滑系数优化
Fig.5 Optimization of the smoothness coefficient
2.2.4 功率优化
在上述最优条件下，设置功率分别为200、250、300、350 mW，操作流程和判断依据同2.2.1。
图6结果显示，当激光功率从200 mW增加到300 mW时，特征峰峰强越来越高，功率为350 mW时峰强降低，300 mW时峰强最高且峰型较好，所以选择300 mW为最佳激光照射功率。
图6 功率优化
Fig.6 Optimization of power
2.2.5 样品量优化
在上述最优条件下，设置检测样品量分别为20、40、50、100 μL，操作流程和判断依据同2.2.1。从图7可以看出，加样量为20 μL时信号最强，选择此加样量为最佳加样量。
图7 加样量优化
Fig.7 Optimization of addition quantity
2.2.6 结果分析
拉曼光谱检测各参数的优化结果如2.2.1～2.2.5所示，当积分时间为20 s，积分次数为10次，平滑系数为10，功率为300 mW，样品量为20 μL时，特征峰位置处峰强最高，因此选择此条件作为山西老陈醋中川芎嗪拉曼检测方法的最优检测条件。
2.3 基于川穹嗪的山西老陈醋醋龄拉曼检测方法建立与评价
2.3.1 绘制标准曲线
2.3.1.1 拉曼光谱法
拉曼光谱法检测川芎嗪的标准曲线线性回归方程为：y=5.568 7x+2 737.2(R2=0.925 1)，结果表明拉曼位移1 599 cm-1处川芎嗪质量浓度在10～200 μg/mL与峰强具有较好的线性关系。
2.3.1.2 高效液相色谱法
高校液相色谱法测定川芎嗪浓度的标准曲线回归方程为：y= 0.647 2x-4.027 6(R2=0.999 1)，结果表明，川芎嗪质量浓度在5～200 μg/mL，与液相色谱响应值具有良好的线性关系。
2.3.2 不同醋龄山西老陈醋中川芎嗪含量测定
2.3.2.1 拉曼光谱法
不同醋龄山西老陈醋中川芎嗪含量拉曼检测结果见图8，可以看出随着醋龄增加，川芎嗪含量不断增加，且醋龄从1年增加到5年，川芎嗪含量增加幅度基本呈线性增加，线性关系为：y=501.52x+1 150.6，R2=0.982 5。
图8 山西老陈醋醋龄拉曼光谱检测
Fig.8 Detection of vinegar age by SRES
2.3.2.2 高效液相色谱法
不同醋龄山西老陈醋中川芎嗪含量高效液相色谱检测结果见图9，随着醋龄增加，川芎嗪含量不断增加，且在醋龄达到1.5年之后，川芎嗪含量随陈放时间的增加，趋势接近线性增加，3～5年醋龄川芎嗪增加趋势线性方程为：y=32.075x-60.183，R2=0.992 2，带入标曲中计算得到5年醋龄的山西老陈醋中川芎嗪含量达到162 μg/mL。
图9 山西老陈醋醋龄高效液相色谱法检测
Fig.9 Detection of vinegar age by HPLC
2.3.3 方法评价
表面增强拉曼光谱检测山西老陈醋醋龄的检测方法精密度、重现性、加标回收率及变异系数结果见表1，其中精密度RSD在2.3%～3.6%，重现性RSD在1.6%～3.2%，加标回收率在80.5%～87.2%，变异系数在5.1%～9.8%。高效液相色谱法检测山西老陈醋醋龄的精密度、加标回收率、变异系数见表2。
表1 SERS法方法评价
Table 1 Evaluation of SRES
加标量/(μg·mL-1)精密度/%重现性/%加标回收率/%变异系数/%253.62.582.5±5.86.3502.31.687.2±8.79.81003.53.280.5±4.85.1
通过比较表1和表2数据可以看到，表面增强拉曼光谱法检测川芎嗪含量具有较高的准确度。同时表面增强拉曼检测方法重现性较好，在加标量分别为25、50、100 mg/mL时该方法的变异系数均小于10%，能够满足实验室及现场快速检测要求。
表2 HPLC法方法评价
Table 2 Evaluation of HPLC
加标量/(μg·mL-1)精密度/%加标回收率/%变异系数/%251.288.7±5.26.1502.890.6±3.84.41002.293.2±4.35.1
3 结论
本研究通过拉曼光谱检测法成功为地标产品山西老陈醋的质量监控提供了一种快速检测方法。并对山西老陈醋中川芎嗪表面增强拉曼光谱检测方法中各条件参数进行优化，包括积分时间、积分次数、平滑系数、检测功率、样品量这5个指标，优化结果为：积分时间20 s，积分次数10次，平滑系数10，功率300 mW，样品量20 μL为本研究建立的拉曼检测法最佳检测条件。通过方法学评价得到此方法特异性强，准确性、精密度和重现性均良好。与高效液相色谱法加标回收率相当，精密度有所提高，变异系数有显著提高，说明此方法的精密度较好。
食品安全质量检测越来越向无损化、简单化、智能化方向发展[25]。本研究所建立的方法在一线检测中适用，且已在实践中得到了验证。今后，还需要建立并完善数据库，期望该方法能与相关的追溯技术[26]、大数据等相结合为食品安全保驾护航。
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