牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一种非血红素铁结合蛋白,分子质量为77 kDa,是由689个氨基酸组成的单一多肽链,具有广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及参与免疫调节等多种生物学活性[1-9],在食品添加剂、饲料添加剂、医药、化妆品行业中具有广阔的应用前景。我国已将其列入GB14880—2012,认定其为食品营养强化剂。牛乳铁蛋白抗菌机制主要是牛乳铁蛋白水解产生的2个小肽的作用[10-11]。这2个小肽位于N末端上的17~30位和265~284位2个氨基酸结构域[12-14],而且这2个小肽在空间结构上很相近,2个结构域相互协作起作用,这比单一结构域具有更强的抗菌活性[15]。牛乳铁蛋白目前主要从牛乳中提取,生产成本高。微生物发酵法是一种降低牛乳铁蛋白生产成本的极具潜力的方法。目前,牛乳铁蛋白已经在大肠杆菌中得到表达[16],但容易形成包涵体,无法应用于工业生产。毕赤酵母表达系统生长快,易于高密度发酵培养,且具有真核细胞翻译后折叠修饰、加工、糖基化等功能[17-20]。毕赤酵母中醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子是一个强启动子,已经成功诱导表达了数百种外源蛋白[21-24],因而毕赤酵母是表达牛乳铁蛋白的优良载体。
为便于分泌表达,本研究以较小分子质量的牛乳铁蛋白N端功能片段(包括2个功能结构域的1~333氨基酸序列,bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)为重组表达目标,目标基因经密码子优化后构建重组质粒,使用毕赤酵母GS115分泌表达。并比较了BSM、D’Anjou、RDM[25-26]三种高密度发酵培养基对目的蛋白表达的影响,为毕赤酵母高密度发酵生产牛乳铁蛋白相关产品提供借鉴。
1.1.1 菌株和质粒
Pichia pastoris GS115菌株为本实验室保存。质粒pPIC9K-BlfFf由擎科公司合成构建。
1.1.2 引物
表1 本研究中用到的引物
Table 1 Primers used in this study
引物引物序列(5′→3′)用途alfa-sig-FTACTATTGCCAGCATTGCTGCT阳性转化子鉴定3‘AOX1-RGCAAATGGCATTCTGACATCCT阳性转化子鉴定
1.1.3 主要试剂
DNA限制性内切酶、DNA marker,TaKaRa公司;遗传霉素(G418)、质粒抽提试剂盒、酵母基因组提取试剂盒、TMB显色液,上海生工;分子量蛋白marker、BSA、PVDF膜,索莱宝公司;Anti-6﹡His单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,浩克生物公司;Anti-6﹡His-tag亲和层析柱(His-Trap HP),GE公司;His Tag ELISA Detection Kit试剂盒,南京金斯瑞。
1.1.4 培养基
LB、YPD、MD、BMGY与BMMY配方参照Invitrogen公司的《毕赤酵母表达操作手册》。
BSM培养基参照Pichia Fermentation Guidelines (Version B,053002,Invitrogen)。
D’Anjou(g/L)培养基:(NH4)2SO4 20,KH2PO4 12,MgSO4 4.7,CaCl2·2H2O 0.36,甘油40,PTM1 4.35 ml/L,用5 mol/L的KOH调pH值到5.0。
RDM培养基(g/L):(NH4)2SO4 1.65,KH2PO4 12,MgSO4 4.7,CaCl2·2H2O 0.36,甘油40,KOH 3.37,谷氨酰胺 1.74,精氨酸 1.46,PTM1 4.35 mL/L,用5 mol/L的KOH调pH值到5.0。
PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6,NaI 0.08,MnSO4·H2O 3,Na2MoO4 ·2H2O 0.2,H3BO3 0.02, CoCl2 0.5,FeSO4·7 H2O 65,生物素 0.2,浓H2SO4 5 mL。
1.2.1 重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的构建与筛选
提取pPIC9K-BlfFf重组质粒DNA,用Bpu1102 Ⅰ线性化处理,电转至毕赤酵母GS115,加入1 mL预冷的1 mol/L三梨醇,30 ℃孵育2 h,涂布于MD平板中,30 ℃静置培养72 h,在平板上加入适量无菌水并用玻璃棒涂布刮菌,菌液用无菌水稀释至10-5,取50 μL分别涂布于含有0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板筛选抗性转化子。挑选抗性转化子接入YPD培养基中,于30 ℃、200 r/min培养24 h,用酵母基因组提取试剂盒提取基因组DNA,以alfa-sig-F、3‘AOX1-R鉴定BlfFf基因是否整合入酵母基因组中。设置空载体酵母重组子GS115-pPIC9K为阴性对照。
1.2.2 重组毕赤酵母的诱导表达
将抗性平板上较大的单菌落接种于BMGY中,30 ℃、200 r/min摇床培养18 h(OD600≈2~6),离心收集菌体,用适量的BMMY培养基悬浮菌体,接种于BMMY使其初始OD600=1.0,于30 ℃、200 r/min继续培养96 h,每24 h添加100%甲醇,诱导浓度为0.5%。诱导结束离心取上清,-20 ℃保存备用,实验设GS115-pPIC9K为阴性对照。
1.2.3 表达产物的鉴定
取1 mL诱导96 h的发酵上清,以甲醇-氯仿法沉淀蛋白,用40 μL去离子水溶解蛋白,加入SDS-Loading Buffer后煮沸10 min,进行SDS-PAGE和Western Blot分析。转印后的膜用0.5%的BSA封闭1 h,加入Anti-6﹡His单克隆抗体孵育1 h,PBST漂洗3次,10 min/次,再以HRP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h,PBST漂洗3次后,用TMB显色。
1.2.4 重组牛乳铁蛋白功能片段的纯化
将离心后的发酵液上清过0.45 μm膜,再以超滤法除盐浓缩,分别收集截留液和透过液。以截留上清过镍柱,带有His标签的蛋白可与镍柱中镍结合,然后分别以40、100、150、250、500 mmol/L咪唑洗脱,收集洗脱峰与流穿液。以10 000 Da超滤管超滤,置换缓冲液,进行SDS-PAGE和Western Blot检测。
1.2.5 重组牛乳铁蛋白功能片段的质谱鉴定
纯化后的目的蛋白经Western Blot鉴定后,将对应的SDS-PAGE上目的条带切胶后进行LC-MS鉴定(苏州普泰生物医药有限公司检测)。
1.2.6 重组酵母表达上清目的蛋白的ELISA定量检测
按照南京金斯瑞公司His Tag ELISA Detection Kit试剂盒说明书操作。
1.2.7 三种高密度发酵培养基的生产比较
挑选摇瓶表达量最大的菌株用于高密度发酵,以10%接种量分别接入含3 L BSM、RDM、D’Anjou培养基的5 L发酵罐,用氨水、KOH、H3PO4调pH值至5.0,温度为30 ℃,调节转速与通气量,控制溶氧在20%以上。当培养基中甘油消耗完后,溶氧(dissolved oxygen, DO)快速上升(DO>60%),随即开始流加含有PTM1的质量浓度为500 g/L的甘油200 mL,流速50 mL/h。流加结束后饥饿30 min,流加含有PTM1的100%甲醇进行诱导,控制比生长速率在0.015 h-1左右,调节转速与通气量,控制溶氧大于20%,诱导后每12 h分别取样,测定目的蛋白含量与菌体湿重。
M-DNA marker 2k plus;2-对照(GS115-pPIC9K);1、3~12-重组转化子中BlfFf的PCR产物
图1 重组酵母菌的PCR鉴定
Fig.1 Identification of recombinant yeast by PCR
将合成的重组质粒pPIC9K-BlfFf电转化入P. pastoris GS115,通过组氨酸营养型与G418抗性筛选,得到重组酵母GS115-pPIC9K-BlfFf。GS115-pPIC9K-BlfFf中BlfFf的PCR结果显示(图1)含有1 200 bp的目的基因扩增条带,对照GS115-pPIC9K无扩增条带,测序结果与目的基因序列相同。结果表明表达牛乳铁蛋白功能片段的重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-BlfFf构建成功。
2.2.1 SDS-PAGE分析
挑选表达量较高的克隆进行发酵。发酵上清的SDS-PAGE分析显示,与GS115-pPIC9K菌株相比,重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的发酵上清可见分子质量约为37 kDa的蛋白条带(图2)。
M-蛋白分子量marker;1~8-高抗性转化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1~8的发酵上清;9-GS115-pPIC9K的发酵上清
图2 转化子发酵上清的SDS-PAGE
Fig.2 SDS-PAGE profile of expression products
2.2.2 摇瓶发酵上清的Western Blot分析
Western Blot检测结果显示,重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的摇瓶发酵上清与Anti-6﹡His单克隆抗体可发生特异性反应,在37 kDa处有特异性条带可见,与SDS-PAGE结果一致,见图3。
M-蛋白分子量marker;1~8-高抗性转化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1~8的发酵上清;9-GS115-pPIC9K的发酵上清
图3 摇瓶发酵上清的Western Blot分析
Fig.3 Western Blot analysis for the fermentation supernatant in shake flask
结果表明,构建的GS115-pPIC9K-BlfFf, 75%转化子成功分泌表达牛乳铁蛋白功能片段,4#、5#转化子发酵上清未发生特异性反应,为假阳性。蛋白灰度扫描结果表明3#菌表达能力最强(图3),选取该菌株用于高密度发酵试验。
以镍鳌合亲和层析柱对表达的牛乳铁蛋白功能片段进行纯化,在40、100、150 mmol/L咪唑浓度下分别得到洗脱峰(图4)。经SDS-PAGE检测,150 mmol/L咪唑下的洗脱峰样品在37 kDa处出现单一条带(图5)。100 mmol/L咪唑下无蛋白,可能是核酸等杂质污染导致起峰。Western Blot鉴定结果显示,150 mmol/L咪唑浓度下的洗脱峰样品在37 kDa处显色,出现特异性条带,且显色最深,为主要的蛋白洗脱峰;40 mmol/L咪唑浓度下的洗脱峰样品也出现分子量符合的特异性条带,说明目的蛋白组分与镍柱结合能力存在差异;流穿液样品中含有少量目的蛋白,说明有部分蛋白没有结合(图6)。实验表明,亲和层析可以较有效地纯化牛乳铁蛋白功能片段。
图4 发酵上清镍柱亲和层析过程图
Fig.4 Time course of nickel affinity chromatographic purification with fermentation supernatant
M-蛋白分子量marker;1-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇诱导发酵上清;2-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇诱导发酵上清;3-40 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;4-100 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;5-150 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;6-镍柱流穿液浓缩脱盐上清
图5 纯化样品的SDS-PAGE
Fig.5 SDS-PAGE of purification samples
纯化后的目的产物经LC-MS鉴定,确定分子量和氨基酸序列与预计相符,表明该蛋白得到正确表达。
M-蛋白分子量marker;1-镍柱流穿浓缩脱盐上清;2-100 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;3-150 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;4-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇诱导发酵上清;5-40 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;6-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇诱导发酵上清
图6 纯化产物的Western Blot分析
Fig.6 Western Blot analysis for the purification products
BSM、RDM、D’Anjou三种培养基是毕赤酵母高密度发酵中使用较多的培养基配方。取GS115-pPIC9K-BlfFf-3菌株,分别使用BSM、RDM、D’Anjou 3种培养基进行高密度发酵以表达牛乳铁蛋白功能片段。经甲醇诱导48 h(发酵72 h)后,菌体湿重在3种培养基中分别达到350、297、233 g/L(图7-A)。
A-BSM、D’Anjou、RDM三种培养基的菌体生长曲线;B-BlfFf在BSM、D’Anjou、RDM培养基的诱导表达时间过程; C-表达产物的Western Blot分析(M-Marker; 1-D’Anjou发酵样品; 2-RDM发酵样品; 3-BSM发酵样品)
图7 BlfFf在3种不同高密度培养基中的生产比较
Fig.7 Comparison of BlfFf production in high-cell-density fermentation with three different media
在甲醇诱导阶段,菌体生长速度较慢, BSM、RDM、D’Anjou培养基中酵母平均比生长速率分别为0.016 h-1、0.012 h-1、0.008 h-1。随着诱导时间的增加,目的蛋白的产量逐渐增加。在甲醇诱导24 h后,目的蛋白表达量增长明显。诱导48 h后,RDM、BSM培养基中产量相差不大,分别为38.1、29.5 mg/L,D’Anjou培养基中表达量为20.3 mg/L(图7-B)。综合比较,选择RDM作为高密度发酵培养基。由于RDM盐浓度较低,使用该培养基既可以减少培养基成本,又可以减少分离纯化过程中的脱盐步骤且使后期处理更加便利。诱导结束后的发酵液经Western Blot分析,确认目的蛋白得到表达(图7-C)。
以牛乳铁蛋白N端功能片段(1~333氨基酸序列)为重组表达目标,经密码子优化基因序列后,连接至表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-BlfFf并转化毕赤酵母GS115筛选得到3#高表达菌株;表达产物经镍柱亲和层析纯化,在150 mmol/L咪唑浓度下洗脱得到37 kDa目标条带,Western Blot和质谱鉴定表明纯化得到了正确表达的牛乳铁蛋白功能片段。3#菌株分别用3种培养基进行高密度发酵,结果表明RDM培养基最优,甲醇诱导48 h,目的蛋白表达量为38.1 mg/L。与传统的BSM培养基比较,采用RDM培养基降低了培养基成本及分离纯化过程中的脱盐成本,为该产品工业放大生产提供了依据。
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