重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵

魏春,任郑,吴涛,钱晓芬,孙杰,汪钊*

(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州,310014)

摘 要 该研究合成了密码子优化后的牛乳铁蛋白功能片段(bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf),转入毕赤酵母GS115中重组表达并筛选抗性菌株,通过镍亲和层析纯化BlfFf,以Western Blot、液质联用和ELISA对重组蛋白进行鉴定及检测。比较了5 L发酵罐生产中3种不同高密度发酵培养基对BlfFf生产的影响。结果表明:重组转化子正确表达了BlfFf。镍亲和层析中,150 mmol/L咪唑洗脱可得到电泳纯37 kDa的目标条带。在3种高密度发酵培养基中,RDM最优,诱导48 h,菌体湿细胞密度达到297 g/L,BlfFf表达量为38.1 mg/L。

关键词 牛乳铁蛋白;毕赤酵母;高密度发酵;分泌表达;纯化;鉴定

牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一种非血红素铁结合蛋白,分子质量为77 kDa,是由689个氨基酸组成的单一多肽链,具有广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤及参与免疫调节等多种生物学活性[1-9],在食品添加剂、饲料添加剂、医药、化妆品行业中具有广阔的应用前景。我国已将其列入GB14880—2012,认定其为食品营养强化剂。牛乳铁蛋白抗菌机制主要是牛乳铁蛋白水解产生的2个小肽的作用[10-11]。这2个小肽位于N末端上的17~30位和265~284位2个氨基酸结构域[12-14],而且这2个小肽在空间结构上很相近,2个结构域相互协作起作用,这比单一结构域具有更强的抗菌活性[15]。牛乳铁蛋白目前主要从牛乳中提取,生产成本高。微生物发酵法是一种降低牛乳铁蛋白生产成本的极具潜力的方法。目前,牛乳铁蛋白已经在大肠杆菌中得到表达[16],但容易形成包涵体,无法应用于工业生产。毕赤酵母表达系统生长快,易于高密度发酵培养,且具有真核细胞翻译后折叠修饰、加工、糖基化等功能[17-20]。毕赤酵母中醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子是一个强启动子,已经成功诱导表达了数百种外源蛋白[21-24],因而毕赤酵母是表达牛乳铁蛋白的优良载体。

为便于分泌表达,本研究以较小分子质量的牛乳铁蛋白N端功能片段(包括2个功能结构域的1~333氨基酸序列,bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)为重组表达目标,目标基因经密码子优化后构建重组质粒,使用毕赤酵母GS115分泌表达。并比较了BSM、D’Anjou、RDM[25-26]三种高密度发酵培养基对目的蛋白表达的影响,为毕赤酵母高密度发酵生产牛乳铁蛋白相关产品提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

Pichia pastoris GS115菌株为本实验室保存。质粒pPIC9K-BlfFf由擎科公司合成构建。

1.1.2 引物

表1 本研究中用到的引物
Table 1 Primers used in this study

引物引物序列(5′→3′)用途alfa-sig-FTACTATTGCCAGCATTGCTGCT阳性转化子鉴定3‘AOX1-RGCAAATGGCATTCTGACATCCT阳性转化子鉴定

1.1.3 主要试剂

DNA限制性内切酶、DNA marker,TaKaRa公司;遗传霉素(G418)、质粒抽提试剂盒、酵母基因组提取试剂盒、TMB显色液,上海生工;分子量蛋白marker、BSA、PVDF膜,索莱宝公司;Anti-6﹡His单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗,浩克生物公司;Anti-6﹡His-tag亲和层析柱(His-Trap HP),GE公司;His Tag ELISA Detection Kit试剂盒,南京金斯瑞。

1.1.4 培养基

LB、YPD、MD、BMGY与BMMY配方参照Invitrogen公司的《毕赤酵母表达操作手册》。

BSM培养基参照Pichia Fermentation Guidelines (Version B,053002,Invitrogen)。

D’Anjou(g/L)培养基:(NH4)2SO4 20,KH2PO4 12,MgSO4 4.7,CaCl2·2H2O 0.36,甘油40,PTM1 4.35 ml/L,用5 mol/L的KOH调pH值到5.0。

RDM培养基(g/L):(NH4)2SO4 1.65,KH2PO4 12,MgSO4 4.7,CaCl2·2H2O 0.36,甘油40,KOH 3.37,谷氨酰胺 1.74,精氨酸 1.46,PTM1 4.35 mL/L,用5 mol/L的KOH调pH值到5.0。

PTM1(g/L):CuSO4·5H2O 6,NaI 0.08,MnSO4·H2O 3,Na2MoO4 ·2H2O 0.2,H3BO3 0.02, CoCl2 0.5,FeSO4·7 H2O 65,生物素 0.2,浓H2SO4 5 mL。

1.2 方法

1.2.1 重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的构建与筛选

提取pPIC9K-BlfFf重组质粒DNA,用Bpu1102 Ⅰ线性化处理,电转至毕赤酵母GS115,加入1 mL预冷的1 mol/L三梨醇,30 ℃孵育2 h,涂布于MD平板中,30 ℃静置培养72 h,在平板上加入适量无菌水并用玻璃棒涂布刮菌,菌液用无菌水稀释至10-5,取50 μL分别涂布于含有0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板筛选抗性转化子。挑选抗性转化子接入YPD培养基中,于30 ℃、200 r/min培养24 h,用酵母基因组提取试剂盒提取基因组DNA,以alfa-sig-F、3‘AOX1-R鉴定BlfFf基因是否整合入酵母基因组中。设置空载体酵母重组子GS115-pPIC9K为阴性对照。

1.2.2 重组毕赤酵母的诱导表达

将抗性平板上较大的单菌落接种于BMGY中,30 ℃、200 r/min摇床培养18 h(OD600≈2~6),离心收集菌体,用适量的BMMY培养基悬浮菌体,接种于BMMY使其初始OD600=1.0,于30 ℃、200 r/min继续培养96 h,每24 h添加100%甲醇,诱导浓度为0.5%。诱导结束离心取上清,-20 ℃保存备用,实验设GS115-pPIC9K为阴性对照。

1.2.3 表达产物的鉴定

取1 mL诱导96 h的发酵上清,以甲醇-氯仿法沉淀蛋白,用40 μL去离子水溶解蛋白,加入SDS-Loading Buffer后煮沸10 min,进行SDS-PAGE和Western Blot分析。转印后的膜用0.5%的BSA封闭1 h,加入Anti-6﹡His单克隆抗体孵育1 h,PBST漂洗3次,10 min/次,再以HRP标记的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h,PBST漂洗3次后,用TMB显色。

1.2.4 重组牛乳铁蛋白功能片段的纯化

将离心后的发酵液上清过0.45 μm膜,再以超滤法除盐浓缩,分别收集截留液和透过液。以截留上清过镍柱,带有His标签的蛋白可与镍柱中镍结合,然后分别以40、100、150、250、500 mmol/L咪唑洗脱,收集洗脱峰与流穿液。以10 000 Da超滤管超滤,置换缓冲液,进行SDS-PAGE和Western Blot检测。

1.2.5 重组牛乳铁蛋白功能片段的质谱鉴定

纯化后的目的蛋白经Western Blot鉴定后,将对应的SDS-PAGE上目的条带切胶后进行LC-MS鉴定(苏州普泰生物医药有限公司检测)。

1.2.6 重组酵母表达上清目的蛋白的ELISA定量检测

按照南京金斯瑞公司His Tag ELISA Detection Kit试剂盒说明书操作。

1.2.7 三种高密度发酵培养基的生产比较

挑选摇瓶表达量最大的菌株用于高密度发酵,以10%接种量分别接入含3 L BSM、RDM、D’Anjou培养基的5 L发酵罐,用氨水、KOH、H3PO4调pH值至5.0,温度为30 ℃,调节转速与通气量,控制溶氧在20%以上。当培养基中甘油消耗完后,溶氧(dissolved oxygen, DO)快速上升(DO>60%),随即开始流加含有PTM1的质量浓度为500 g/L的甘油200 mL,流速50 mL/h。流加结束后饥饿30 min,流加含有PTM1的100%甲醇进行诱导,控制比生长速率在0.015 h-1左右,调节转速与通气量,控制溶氧大于20%,诱导后每12 h分别取样,测定目的蛋白含量与菌体湿重。

2 结果与讨论

2.1 GS115-pPIC9K-BlfFf重组菌的构建与筛选

M-DNA marker 2k plus;2-对照(GS115-pPIC9K);1、3~12-重组转化子中BlfFf的PCR产物
图1 重组酵母菌的PCR鉴定
Fig.1 Identification of recombinant yeast by PCR

将合成的重组质粒pPIC9K-BlfFf电转化入P. pastoris GS115,通过组氨酸营养型与G418抗性筛选,得到重组酵母GS115-pPIC9K-BlfFf。GS115-pPIC9K-BlfFfBlfFf的PCR结果显示(图1)含有1 200 bp的目的基因扩增条带,对照GS115-pPIC9K无扩增条带,测序结果与目的基因序列相同。结果表明表达牛乳铁蛋白功能片段的重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-BlfFf构建成功。

2.2 表达产物的鉴定

2.2.1 SDS-PAGE分析

挑选表达量较高的克隆进行发酵。发酵上清的SDS-PAGE分析显示,与GS115-pPIC9K菌株相比,重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的发酵上清可见分子质量约为37 kDa的蛋白条带(图2)。

M-蛋白分子量marker;1~8-高抗性转化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1~8的发酵上清;9-GS115-pPIC9K的发酵上清
图2 转化子发酵上清的SDS-PAGE
Fig.2 SDS-PAGE profile of expression products

2.2.2 摇瓶发酵上清的Western Blot分析

Western Blot检测结果显示,重组酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的摇瓶发酵上清与Anti-6﹡His单克隆抗体可发生特异性反应,在37 kDa处有特异性条带可见,与SDS-PAGE结果一致,见图3。

M-蛋白分子量marker;1~8-高抗性转化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1~8的发酵上清;9-GS115-pPIC9K的发酵上清
图3 摇瓶发酵上清的Western Blot分析
Fig.3 Western Blot analysis for the fermentation supernatant in shake flask

结果表明,构建的GS115-pPIC9K-BlfFf, 75%转化子成功分泌表达牛乳铁蛋白功能片段,4#、5#转化子发酵上清未发生特异性反应,为假阳性。蛋白灰度扫描结果表明3#菌表达能力最强(图3),选取该菌株用于高密度发酵试验。

2.3 重组牛乳铁蛋白功能片段的纯化与质谱鉴定

以镍鳌合亲和层析柱对表达的牛乳铁蛋白功能片段进行纯化,在40、100、150 mmol/L咪唑浓度下分别得到洗脱峰(图4)。经SDS-PAGE检测,150 mmol/L咪唑下的洗脱峰样品在37 kDa处出现单一条带(图5)。100 mmol/L咪唑下无蛋白,可能是核酸等杂质污染导致起峰。Western Blot鉴定结果显示,150 mmol/L咪唑浓度下的洗脱峰样品在37 kDa处显色,出现特异性条带,且显色最深,为主要的蛋白洗脱峰;40 mmol/L咪唑浓度下的洗脱峰样品也出现分子量符合的特异性条带,说明目的蛋白组分与镍柱结合能力存在差异;流穿液样品中含有少量目的蛋白,说明有部分蛋白没有结合(图6)。实验表明,亲和层析可以较有效地纯化牛乳铁蛋白功能片段。

图4 发酵上清镍柱亲和层析过程图
Fig.4 Time course of nickel affinity chromatographic purification with fermentation supernatant

M-蛋白分子量marker;1-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇诱导发酵上清;2-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇诱导发酵上清;3-40 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;4-100 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;5-150 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;6-镍柱流穿液浓缩脱盐上清
图5 纯化样品的SDS-PAGE
Fig.5 SDS-PAGE of purification samples

纯化后的目的产物经LC-MS鉴定,确定分子量和氨基酸序列与预计相符,表明该蛋白得到正确表达。

2.4 三种高密度发酵培养基的生产比较

M-蛋白分子量marker;1-镍柱流穿浓缩脱盐上清;2-100 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;3-150 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;4-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇诱导发酵上清;5-40 mmol/L咪唑洗脱浓缩脱盐上清;6-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇诱导发酵上清
图6 纯化产物的Western Blot分析
Fig.6 Western Blot analysis for the purification products

BSM、RDM、D’Anjou三种培养基是毕赤酵母高密度发酵中使用较多的培养基配方。取GS115-pPIC9K-BlfFf-3菌株,分别使用BSM、RDM、D’Anjou 3种培养基进行高密度发酵以表达牛乳铁蛋白功能片段。经甲醇诱导48 h(发酵72 h)后,菌体湿重在3种培养基中分别达到350、297、233 g/L(图7-A)。

A-BSM、D’Anjou、RDM三种培养基的菌体生长曲线;B-BlfFf在BSM、D’Anjou、RDM培养基的诱导表达时间过程; C-表达产物的Western Blot分析(M-Marker; 1-D’Anjou发酵样品; 2-RDM发酵样品; 3-BSM发酵样品)
图7 BlfFf在3种不同高密度培养基中的生产比较
Fig.7 Comparison of BlfFf production in high-cell-density fermentation with three different media

在甲醇诱导阶段,菌体生长速度较慢, BSM、RDM、D’Anjou培养基中酵母平均比生长速率分别为0.016 h-1、0.012 h-1、0.008 h-1。随着诱导时间的增加,目的蛋白的产量逐渐增加。在甲醇诱导24 h后,目的蛋白表达量增长明显。诱导48 h后,RDM、BSM培养基中产量相差不大,分别为38.1、29.5 mg/L,D’Anjou培养基中表达量为20.3 mg/L(图7-B)。综合比较,选择RDM作为高密度发酵培养基。由于RDM盐浓度较低,使用该培养基既可以减少培养基成本,又可以减少分离纯化过程中的脱盐步骤且使后期处理更加便利。诱导结束后的发酵液经Western Blot分析,确认目的蛋白得到表达(图7-C)。

3 结论

以牛乳铁蛋白N端功能片段(1~333氨基酸序列)为重组表达目标,经密码子优化基因序列后,连接至表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K-BlfFf并转化毕赤酵母GS115筛选得到3#高表达菌株;表达产物经镍柱亲和层析纯化,在150 mmol/L咪唑浓度下洗脱得到37 kDa目标条带,Western Blot和质谱鉴定表明纯化得到了正确表达的牛乳铁蛋白功能片段。3#菌株分别用3种培养基进行高密度发酵,结果表明RDM培养基最优,甲醇诱导48 h,目的蛋白表达量为38.1 mg/L。与传统的BSM培养基比较,采用RDM培养基降低了培养基成本及分离纯化过程中的脱盐成本,为该产品工业放大生产提供了依据。

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Recombinant bovine lactoferrin functional fragment expressed in Pichia pastoris and high-cell-density fermentation

WEI Chun,REN Zheng,WU Tao,QIAN Xiaofen,SUN Jie,WANG Zhao*

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

ABSTRACT This study aimed to express bovine lactoferrin functional fragments (BlfFf) in Pichia pastoris and investigate high-cell-density fermentation. The codon-optimized BlfFf was synthesized and transferred into P. pastoris GS115 for recombinant expression, followed by resistant strain screening. The BlfFf was purified with Ni affinity chromatography, and identified and determined by Western Blot, LC-MS, and ELISA assays. The effects of three different high-cell-density fermentation media on BlfFf production in a 5 L fermentor were compared. The results showed that the engineered yeast expressed BlfFf correctly, and a 37 kDa electrophoretic pure target band was obtained by elution with 150 mmol/L imidazole. Moreover, RDM was found to be the optimal culture medium. After 48 h induction, the wet cell density reached 297 g/L and the yield reached 38.1 mg/L. In conclusion, the recombinant P. pastoris was successfully constructed to produce BlfFf in RDM medium for high-cell-density fermentation, which shows its industrial application potentials.

Key words bovine lactoferrin; Pichia pastoris; high-cell-density fermentation; secretory expression; purification;identification

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.019993

第一作者:博士,副教授(汪钊教授为通讯作者,E-mail:hzwangzhao@163.com)。

基金项目:浙江省自然科学基金(LY12B06010)

收稿日期:2019-01-17,改回日期:2019-03-07