Nisin、ε-聚赖氨酸和温度对枯草芽孢杆菌失活动力学的影响

枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，极易产生芽孢，同时是食品发酵过程中的常见污染菌，并可能导致人类食源性疾病[1]。熟制水产品是以水生动物为原料，经相应工艺加工熟化后制成的风味制品。熟制水产品具有营养丰富、味道鲜美，携带方便和开袋即食等特点，日益受到消费者的青睐。水产原料经预处理、蒸、煮、烘烤和油炸等熟化后，在冷链或常温流通过程中，产品极易腐败变质，其中微生物作用是导致腐败的主要因素。在沙丁鱼、海蜇和鲍汁等[2-4]熟制水产品中，枯草芽孢杆菌和乳链球菌等是导致产品腐败变质的优势菌。如何安全有效杀灭枯草芽孢杆菌及芽孢是保证食品安全的一个重要问题[5]。对延长熟制水产品的货架期具有重要作用。

传统热杀菌(如高温高压)法易对熟制水产品的风味及质构产生不良影响，非热杀菌技术如超高压杀菌[6]、脉冲电场杀菌[1]、生物杀菌[7]及酸性电解水杀菌[8]等能有效保持产品质构和营养等。生物杀菌法是利用生物代谢产物来抑制或杀灭微生物，与其他非热杀菌技术相比，杀菌强度温和，能更大程度保持原有的色泽、营养和风味等。同时，化学防腐剂的持续广泛使用可能造成严重的健康问题，每日高摄入量可能导致人体对食品腐败菌和致病菌产生抗性[9]。生物保鲜剂具有天然、高效和安全无毒的特性，在消化道内极易降解，对人体消化道菌群活性无影响等[7]，种类主要有ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、溶菌酶、茶多酚和壳聚糖等。ε-聚赖氨酸是种常用食品保鲜剂[10]，对革兰氏阳性菌、酵母菌和霉菌具有广谱抑制作用，尤其对耐热性芽孢杆菌和某些病毒具有较强抑制作用[11]，热稳定性高，且对人体无毒性或毒性较低。乳酸链球菌肽(Nisin)具有耐热，易在消化系统中消化，对广谱革兰氏阳性菌具有抑制作用，作为世界卫生组织(WHO)和美国食药监管局(FDA)批准的天然食品添加剂已在50多个国家使用[12-13]。Nisin能有效杀灭处于萌发状态的枯草芽孢杆菌[14]，具有抑制孢子生长及溶解营养细胞的作用，ε-聚赖氨酸和Nisin对枯草芽孢杆菌具有协同抑菌效应[9,15]。

针对食品中重要的有害芽孢杆菌(如蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)，研究何种杀灭和抑制手段，来有效控制菌体生长和杀灭孢子，是当前研究的2个重要方向。RAO等采用传统热杀菌[16]、微波杀菌[17]和高压CO2[18]等高强度杀菌手段或联合生物保鲜剂(如Nisin等)可有效杀灭芽孢杆菌孢子；CHI等采用多种生物保鲜剂等温和手段来协同抑制芽孢杆菌的生长和失活等[9,15,19]。在外界抑菌因子或杀菌等作用下，微生物等生长极易受到抑制甚至失活，失活模型可预测微生物特定条件的死亡状况。微生物失活模型包括Weibull、Log-logistic、修正Gompertz和Biphasic模型等[20]。研究显示,Weibull模型和Log-logistic模型可较好拟合非热失活曲线[20-23]，国内外关于腐败菌的生长、失活模型均有大量报道[12-13]，其中对枯草芽孢杆菌的研究多集中于生长模型，而生物保鲜剂作用下的失活模型相对较少[24-25]。

在前期对熟制对虾虾仁常温贮藏下的货架期和腐败菌特性、微波杀灭地衣芽孢杆菌孢子特性及效果的研究基础上[17,26]，本文以分离自熟制对虾虾仁货架期终点的枯草芽孢杆菌为对象，采用Nisin、ε-聚赖氨酸和温度等温和抑菌手段，运用线性模型、Weibull模型和Log-logistic模型拟合失活动力学曲线，采用Af、Bf、RMSE、R2对模型拟合优度进行评价，并对失活动力学预测值和实测值进行比较，旨在为优化靶向生物杀菌和延长水产品货架期等提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

真空包装熟制对虾虾仁(采购于宁德市某水产公司)货架期终点时分离纯化出优势菌株，经MIDI细菌鉴定系统(Microbial ID Inc.,美国)、BIOLOG细菌鉴定系统(Biolog公司，美国)、16S rRNA测序(KU570452.1)[17,26]鉴定为枯草芽孢杆菌，冻干，4 ℃贮藏，待用。

1.2 原料与试剂

乳酸链球菌素,浙江新银象生物工程有限公司;ε-聚赖氨酸,郑州博研生物科技有限公司;

营养肉汤：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃下高压灭菌 15 min，备用。

营养琼脂：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL(加固体琼脂粉 20 g)，调pH值7.0，121 ℃下高压灭菌15 min，备用。

NaCl、冰乙酸(AR)及其他主要试剂，上海市国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

洁净工作台(SW-CJ-1FB)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低温培养箱(MIR-153)，日本三洋公司；反压蒸煮消毒锅(ZM-100)，广州标际包装设备有限公司；恒温培养振荡器(ZHWY-200H)，上海智城分析仪器制造有限公司；pH测定仪(HI 2216 pH/ORP/ISE Meter)，北京哈纳科学仪器科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液制备

菌株活化：把冻干枯草芽孢杆菌接种在营养肉汤中，150 r/min振荡，37 ℃培养 8 h，增殖至对数初期，此时菌数约 105 CFU/mL。

扩大培养：将 0.5%活化好的菌种接种至 100 mL TSB增菌液中，30 ℃静止培养(约12 h)至对数生长后期，菌数约109 CFU/mL，获得原菌液。

将原菌液接种至营养肉汤中，初始接种量约107 CFU/mL。按照GB 4789.2—2016进行菌落计数。单因素试验均做 3个平行，重复2次。

1.4.2 单因素实验

参考GB 2760—2014标准，Nisin在熟制水产品中限量≤0.5 g/kg，ε-聚赖氨酸在熟肉制品中限量≤ 0.25 g/kg。ε-聚赖氨酸及Nisin溶液梯度皆设置为0.031 3、0.062 5和0.125 mg/mL，溶于营养肉汤中。结合2种生物保鲜剂的特点，设定菌液pH值为5。

将达到稳定期的枯草芽孢杆菌菌悬液分别与Nisin或ε-聚赖氨酸溶液按1∶1混合，空白对照组不添加Nisin/ε-聚赖氨酸，只加营养肉汤(pH=5)，稀释至约105～106CFU/mL，在25、37和45 ℃培养，在1、5、15、30、90和180 min取样，涂布于营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h，计数。失活效应以lg(LD)表示，如公式(1)所示：

式中：LD,失活量；Ni,培养i(i=1、5、15、30、90和180)min后枯草芽孢杆菌的菌落数,CFU/mL；N0,培养0 h时的菌落数,CFU/mL。

1.4.3 模型的选择

一级动力学模型，线性模型(Linear)描述了Nisin、ε-聚赖氨酸和温度对枯草芽孢杆菌的失活数量与处理时间的线性关系[27]，见公式(2)。

式中：N0和N分别是初始和经处理特定时间(t，min) 后微生物或芽孢的数量，CFU/mL；D表示使90%的枯草芽孢杆菌死亡所需的时间，min。

Weibull模型：该失活曲线表述了各种失活因子的累积效应，描述营养体和细胞具有不同的耐受性[21,28]，见公式(3)。

式中：N0和N分别是初始和经处理特定时间(t，min) 后微生物或芽孢的数量，CFU/mL；b与n分别是尺度参数和形状参数。当n<1，Weibull分布为一凹面向上的曲线；n>1，曲线凹面向下；n=1时为一条直线。

Log-logistic模型：该模式用以拟合微生物非热失活的非线性模型[29]，见式(4)。

式中：α为上渐近线，lg CFU/g；ω为下渐近线，lg CFU/g；σ为失活曲线最大斜率；τ表示失活曲线大到最大斜率时数量级时间，lg(t)，τ决定曲线位置；t为处理时间，min。

1.4.4 拟合优度评价

采用精确因子(accuracy factor，Af)、偏差因子(bias factor，Bf)、均方根误差(root mean square error，RMSE)[30]、决定系数R2及调整决定系数

评判拟合优度。研究表明，Af、Bf、R2越接近1，RMSE越接近于0，模型的拟合优度则越高。Af、Bf和RMSE如式(5-7)所示：

式中：yobs为实测值；ycal为预测值；n为实测值个数。

1.5 数据统计

采用Excel 2010 进行均值及标准偏差计算，Origin 9.0软件(美国OriginLab公司)动力学模型拟合并作图，SPSS17.0软件(美国IBM公司)进行数据处理、方差分析(analysis of variance，ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 Nisin及ε-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌失活情况的影响

由图1可知，25 ℃下，在180 min终点时随Nisin的浓度升高，枯草芽孢杆菌的失活量从4.29 lgCFU/mL增加至4.39 lgCFU/mL；随ε-聚赖氨酸的浓度升高，失活量从5.12 lgCFU/mL增加至6.35 lgCFU/mL。37 ℃下，在180 min终点时随Nisin的浓度升高，枯草芽孢杆菌的失活量从5.43 lgCFU/mL增加至6.70 lgCFU/mL；随ε-聚赖氨酸的浓度升高，失活量达6.70 lgCFU/mL。45 ℃下，在180 min终点时随Nisin的浓度升高，枯草芽孢杆菌的失活量从2.06 lgCFU/mL增加至2.47 lgCFU/mL；随ε-聚赖氨酸的浓度升高，失活量从4.00 lgCFU/mL增加至4.5 lgCFU/mL。同时，Nisin及ε-聚赖氨酸溶液在微酸环境下抑菌活性更高，在选用微酸(pH=5)条件下，对照组在25、37及45 ℃时180 min内也呈现一定失活量，微酸环境可能是导致枯草芽孢杆菌菌数下降的主要原因。虽然微酸环境对枯草芽孢杆菌的生长有一定抑制作用，但很难有失活效果。45 ℃时，ε-聚赖氨酸组枯草芽孢杆菌的失活量高于Nisin组，该温度下，Nisin的失活效果不显著。由图1可知，37 ℃时，除在质量浓度为0.031 3 mg/mL外，两者失活量差异不显著；25和45 ℃时，ε-聚赖氨酸处理180 min后的枯草芽孢杆菌失活量>Nisin组失活量。pH 5时，可能是2种保鲜剂与pH值产生相互作用所导致的，研究指出Nisin在pH<4时稳定性最强，4[31]；ε-聚赖氨酸在中性或微酸性条件作用显著，最适抑菌pH值为5～8[11]，这可能是导致Nisin和ε-聚赖氨酸有效浓度及失活效果差异的原因[31]。

2.2 ε-聚赖氨酸和Nisin失活动力学曲线分析

由表1中的3种动力学模型拟合曲线参数及统计参数可知，一级线性模型

并不能很好拟合所有的数据点，而其余2种非线性模型的拟合效果

优于线性模型。研究发现，线性模型无法拟合多数杀菌动力学曲线，微生物生长或失活预测更符合非线性模型[32]。由图2可知，运用Weibull模型和Log-logistic模型能更好拟合不同条件下2种生物保鲜剂处理枯草芽孢杆菌的动力学曲线。

CHEN等[21]结合对牛乳中单增李斯特菌的失活动力学研究时选择了Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型对失活曲线进行拟合，最终选择Log-logistic方程进行描述。COLLADO和卢蓉蓉等[25,28]研究表明，Weibull模型可较好描述芽孢杆菌失活动力学过程，EVELYN等[33]用Log-logistic模型较好描述牛肉浆中芽孢杆菌孢子失活情况。Weibull模型和Log-logistic模型的R2平均值分别为0.970和0.992，表明两模型均能较好描述Nisin及ε-聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌失活效应，且拟合度相差不多。在模型的选择过程中，模型的拟合优度是根据参数值来判断，所以排除线性模型用于拟合枯草芽孢杆菌的失活动力学模型。

2.3 模型拟合优度评价

采用Af、Bf、RMSE和R2等参数比较Weibull模型和Log-logistic模型下枯草芽孢杆菌失活曲线的拟合优度。由表2可知，Weibull模型Af、Bf、RMSE和R2均值分别为1.02～1.18、0.94～1.08、0.080～0.740和0.963，而Log-logistic的Af、Bf、RMSE和R2均值分别为1.01～1.09、0.98～1.02、0.04～0.26和0.991。表明，Log-logistic模型预测的平均精度更高，离散程度较低，其拟合优度优于Weibull模型，与卢蓉蓉等[34]研究所示Weibull模型R2(均值=0.94)和Log-logistic模型R2(0.980～0.998)较接近。COLLADO等[25]运用Weibull模型拟合4～20℃下芽孢杆菌孢子失活过程；EVELYN等[33]研究了Log-logistic模型描述超声波结合热处理下，2种芽孢杆菌失活过程，说明2种模型均可较好模拟杀菌过程，也可预测不同处理条件下的杀菌效果。

为考察2种模型是否具备预测失活效果的功能，比较Weibull模型与Log-logistic模型回归方程计算的预测值与实测值的接近程度，基于37℃时0.125 mg/mL ε-聚赖氨酸和Nisin失活效果最优，选取该2组微生物残存预测值与实测值进行比较，图3所示，Log-logistic模型(R2=0.994～0.996)拟合优度优于Weibull模型(R2=0.912～0.994)，均可较好预测失活效应。这与高芳等[27]建立超高压协同温度处理对绿色魏斯式菌的失活动力学中，也选择了Linear模型、Weibull模型和Logistic模型处理模型拟合结果，最终Logistic模型作为最适拟合模型结果相似。

2.4 模型的验证

通过验证试验得到枯草芽孢杆菌的减少量即实测值，随机挑选两组条件(37 ℃、ρ(Nisin)=0.100 mg/mL、ρ(ε-聚赖氨酸)=0.050 mg/mL和30 ℃、ρ(Nisin)=0.150 mg/mL、ρ(ε-聚赖氨酸)=0.125 mg/mL作为试验条件，将各试验条件分别带入对应的模型公式(4)、(5)、(6)中，得到预测值。根据实测值和预测值便可计算得到模型的Af、Bf、RMSE值。从表3可知，除线性模型外，Weibull模型、Log-logistic模型的偏差因子Bf值分别在 0.98～1.08，说明这些模型较可靠，能有效评价虾源枯草芽孢杆菌的失活趋势。

3 结论

(1)在25、37和45 ℃时，虾源枯草芽孢杆菌在0.0313～0.125 mg/mL Nisin溶液及ε-聚赖氨酸溶液抗菌作用下，15～180 min可显著降低其菌数(P<0.05)。温度越趋向于37 ℃，2种生物保鲜剂浓度越高，失活效果越好。

(2)经验证，线性模型不能很好地拟合失活动力学曲线，Weibull模型和Log-logistic模型的R2平均值分别为0.970和0.992，表明2种模型均能很好拟合其失活过程；Weibull模型Af、Bf、RMSE和R2均值分别为1.02～1.18、0.94～1.08、0.080～0.740和0.963，而Log-logistic的Af、Bf、RMSE和R2均值分别为1.01～1.09、0.98～1.02、0.04～0.26和0.991。表明Log-logistic模型预测的平均精度更高，离散程度较低，其拟合优度优于Weibull模型。进一步通过比较2种模型回归方程预测值与实测值的接近程度，得出Log-logistic模型(R2>0.99)拟合优度优于Weibull模型(R2>0.96)，应用Logistic模型可以较好地体现不同保鲜剂结合温度处理下枯草芽孢杆菌在不同基质中的死亡情况，也很好地预测处理ε-聚赖氨酸和Nisin协同温度在虾源枯草芽孢杆菌的死亡动态变化，这为延长水产品货架期及制定产品质量安全控制方案提供参考依据。

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