胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)是酵母种属的1种，属子囊菌门/隐形酵母科/红酵母属，是单细胞真核生物，在土壤、水和空气中均有存在。酵母胞外多糖(YEPS)是酵母细胞在生长代谢过程中分泌到细胞壁外,常渗于培养基的一类糖类化合物[1]，具有潜在的抗氧化，抗凝血，抗血栓和抗病毒活性，可用于生产有机体免疫调节剂，具有广阔的市场前景。迄今为止，已经报道了几种酵母可以产生胞外多糖，其中包括：隐球菌属(Cryptococcus)[2]，汉逊酵母属(Hansenula)[3]，油脂酵母属(Lipomyces)[4]，短梗霉属(Aureobasidium)[5]和胶红酵母属(Rhodotorula)[6]。目前，国内外对细菌胞外多糖和一些大型真菌胞外多糖的研究较多，而对酵母胞外多糖的菌株筛选、多糖的结构解析和功能活性研究较少，尤其是胶红酵母菌，属于空白。
本文以胶红酵母菌株R. mucilaginosa CICC 33013为研究对象，通过分离纯化得到胞外多糖单一纯品，并对其抗氧化活性做了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
胶红酵母菌株由中国典型培养物保藏中心提供；抗坏血酸、乙醇、三氯乙酸(分析纯)，天津市天力化学试剂有限公司；酵母浸膏、蛋白胨(生物试剂)，北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂粉(生物试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，安徽酷尔生物工程有限公司；ABTS，合肥博美生物科技有限责任公司。DEAE纤维素(DE-52),北京华中海威基因科技有限公司；葡聚糖凝胶(G-100),北京满仓科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备
CT15RT高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备有限公司；RE-3000旋转蒸发器，上海市亚荣生化仪器厂；LCll00安捷伦液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；EYELA冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；BSZ-1000自动部分收集器、HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂有限公司；EM-30 Plus扫描电镜，北京天耀科技有限公司；VERTEX 70傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克光谱仪器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 胶红酵母胞外多糖的制备
将胶红酵母菌种接入平板活化后，转入种子液培养基(酵母膏1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%)，在pH值为6的条件下培养2 d。随后以5%的量转入优化培养基(葡萄糖5%、(NH4)2SO4 0.1%、KH2PO4 0.1%、CaCl2 0.01%、NaCl 0.04%、MgSO4·7H2O 0.1%)，在28 ℃，pH 7的条件下，培养6 d。分离上清液与细胞，提取酵母胞外多糖。将液体培养液于9 000 r/min、4 ℃条件下离心6 min，分离酵母菌与培养液，浓缩液用4倍体积75%乙醇沉淀24 h，离心、冷冻干燥，得白色沉淀，即为酵母胞外多糖粗品。采用三氯乙酸法脱蛋白：称取2.00 g的胶红酵母胞外多糖样品，蒸馏水复溶。在胶红酵母胞外多糖的水溶液里缓慢滴加10%的三氯乙酸。置于4 ℃的冰箱内放置24 h，离心去除白色沉淀。将去除蛋白的多糖溶液醇沉后进行冻干处理，得到粗多糖REPS，保存后备用。
1.2.2 多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法[7]。
1.2.3 胶红酵母胞外多糖的分离、纯化
1.2.3.1 DEAE-52纤维素层析柱纯化
在原有方法[8]基础上进行了修改，具体方法如下：将粗多糖REPS溶解于蒸馏水中，离心去除未溶解的沉淀与杂质，上清液用DEAE-52阴离子交换柱进行层析分离，依次用0.0，0.3，0.6，0.9和1.2 mol/L的NaCl以0.5 mL/min的流速洗涤，苯酚-硫酸法跟踪检测收集液，合并各洗脱峰洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥，备用。
1.2.3.2 Sephadex G-100凝胶柱层析
将DEAE-52纤维素柱层析分级得到的胞外多糖溶解，用滴管将多糖溶液沿壁缓慢地加入平衡好的SephadexG-100色谱柱中，蒸馏水洗脱，流速为0.5 mL/min，苯酚-硫酸法跟踪检测收集液，合并各洗脱峰洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥，备用，即得到多糖REPS纯品。
1.2.4 多糖分子质量的测定和纯度鉴定
将REPS纯品组分采用高效凝胶渗透色谱法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)[9]测定纯度和分子量。
1.2.5 红外光谱测定
将多糖样品用KBr压片。通过Vector 33 FT-IR(fourier transform infrared spectrometer)分光光度计扫描，以4～400 cm-1的分辨率记录2 cm-1的FT-IR光谱[10]。
1.2.6 多糖抗氧化性的研究
1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的测定
在WANG等[11]的方法上有所改动，具体操作如下：准确吸取DPPH试剂3.9 mL，与0.1 mL甲醇试剂混合，以甲醇作参照，记录混合液于517 nm处所得的OD值(A对照)。吸取5份相同体积REPS纯品组分溶液，分别稀释到1、2、4、6和8 mg/mL；吸取5份相同体积的Vc溶液，分别稀释到1、2、4、6和8 mg/mL。量取上述试样各1 mL，加入3 mL DPPH(25 mg/L)试剂，涡漩均匀，30 ℃保温，避光静置40 min。甲醇为参照，记录各混合液在517 nm处所得的OD值(A样品)，所有的试样做3个重复后求平均值。取上述样液各0.1 mL，分别与3.9 mL甲醇试剂混合均匀，用甲醇做参照，记录各混合液在517 nm处所得的OD值(A参比)；记录各组数据，计算其清除率(percentage of scavenging radical capacity, SR)，得到清除率在一定浓度范围内的线性回归方程，通过线性回归方程计算半数清除率IC50。
DPPH清除率按公式(1)计算：
清除率
(1)
1.2.6.2 还原力的测定
在ZHU等[12]的方法基础上稍作修改。具体操作如下：吸取5份同体积的REPS纯品组分溶液，分别稀释到1、2、4、6、8 mg/mL。移取不同浓度试样0.4 mL，与磷酸盐缓冲溶液(0.5 mL 0.2 mol/L，pH 6.6)和0.5 mL六氰合铁酸钾[K3Fe(CN)6](1.0%)溶液混合。反应混合物在50 ℃水浴保温反应20 min后，快速冷却，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，2 min后加入0.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3。室温静置5 min，在700 nm处测其OD值(A)。用蒸馏水代替0.1% FeCl3作为空白对照。
1.2.6.3 ABTS自由基清除实验
在CHENG等[13]的方法基础上稍作修改。具体操作如下：ABTS阳离子自由基(ABTS+·)通过将7.00 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液混合而产生，并在室温下于黑暗中放置16 h。然后将3.6 mL的ABTS+溶液加入到0.4 mL不同质量浓度(1.0～8.0 mg/mL)的多糖组分REPS2-A中。将反应混合物在室温下放置20 min，于734 nm处测量吸光度。以不同浓度Vc作为阳性对照。
ABTS自由基清除率按公式(2)计算：
清除率
(2)
式中：A样品，样品吸光值；A对照，对照管的吸光值。
2 结果与分析
2.1 胶红酵母细胞菌落形态
如图1所示，在固体琼脂培养基平板上的胶红酵母(R. mucilaginosa CICC 33013)的菌落形态是均匀的，中等大小，暗红色，具有光滑的表面。SEM图像(图1-b)显示细胞形态为球形或椭圆形，3～4 μm，菌落分布为单个，配对或连环，出芽生殖。
a-胶红酵母平板菌落形态；b- R. mucilaginosa CICC 33013细胞表面扫描电子显微(SEM)图像
图1 胶红酵母细胞菌落形态
Fig.1 R. mucilaginosa CICC 33013 cell colony and morphology
2.2 多糖含量的测定
葡萄糖标准曲线的回归方程为：y=0.013 43x-0.106 7，线性相关系数R2=0.991 8。由葡萄糖标准曲线，可计算REPS产量为6.2 g/L。
2.3 胞外多糖的分离、纯化
通过醇沉，脱蛋白，透析等方法得到粗多糖组分REPS，复溶，DEAE-52离子交换柱层析，由洗脱曲线可知，分别得到蒸馏水洗脱峰REPS1和REPS2，0.3 mol/L NaCl洗脱峰REPS3三个多糖组分(图2)。将占主要部分的中性多糖REPS2用蒸馏水洗脱，并通过凝胶渗透在Sephadex G-100柱中进一步纯化，分别得到了2个多糖组分REPS2-A和REPS2-B(图3)。
图2 REPS的DEAE-52纤维素柱层析洗脱曲线
Fig.2 DEAE-52 cellulose column chromatography elution curve of REPS
图3 REPS2的SephadexG-100凝胶柱层析洗脱曲线
Fig.3 Sephadex G-100 gel column chromatography elution curve of REPS2
由于多糖组分REPS2-A占REPS2的75.2%(质量占比)，因此多糖组分REPS2-B未作研究。收集多糖组分REPS2-A，透析、干燥用于进一步分析。
2.4 多糖分子质量的测定和纯度鉴定
HPGPC色谱图显示多糖组分REPS2-A是单一、对称峰，表明得到的多糖组分REPS2-A是均相样品。如图4所示，根据葡聚糖标准，REPS2-A的平均分子质量为7.125×106 Da。
LS-激光光反射强度；RI-示差强度
图4 REPS2-A分子质量分布图
Fig.4 The molecular weight distributions of REPS2-A
2.5 红外光谱测定结果
图5显示了多糖组分REPS2-A的FT-IR谱，在3 431，2 933，1 621，1 431和1 088 cm-1处显示了多糖的典型特征吸收峰[14-17]。在3 431 cm-1处的典型峰是由于糖环中O—H的伸缩振动造成的。2 933 cm-1附近的谱带归因于C—H伸缩振动。在1 621 cm-1和1 431 cm-1附近的强吸收表明有羧基存在。在1 088 cm-1处的吸收峰表明在多糖组分REPS2-A中存在C
O键。在1 730 cm-1处没有观察到吸收峰，表明多糖组分REPS2-A不含糖醛酸[18-19]。
图5 REPS2-A红外光谱图
Fig.5 FT-IR spectrum of the REPS2-A fraction.
2.6 多糖抗氧化性的研究
2.6.1 DPPH清除活性分析
如图6所示，随着多糖组分REPS2和REPS2-A浓度的增加，DPPH清除作用呈剂量依赖性增加。当质量浓度为1.0 mg/mL时，多糖组分REPS2和REPS2-A的DPPH自由基清除能力分别为(25.05±1.60)%和(19.05±1.00)%。此外，多糖样品在较高质量浓度(1.0～8.0 mg/mL)下表现出较高的清除能力。结果表明，多糖组分REPS2和REPS2-A具有较高的DPPH自由基清除能力，这意味着它们可以将电子或氢供给DPPH自由基。但是，粗多糖组分REPS对DPPH自由基清除能力的机制尚需进一步研究。
图6 清除DPPH自由基能力测定结果
Fig.6 DPPH radical scavenging activity of REPS2 and REPS2-A
2.6.2 ABTS清除率结果的测定
抗坏血酸、多糖组分REPS和REPS2-A对ABTS自由基的清除能力如图7所示。多糖组分REPS2-A的清除能力与其浓度高度相关(浓度越高，清除能力越高)，但低于相同浓度的抗坏血酸。抗坏血酸浓度仅为1.0 mg/mL时，清除率已经高达90%，且随着浓度增加，清除效果基本趋于平稳。REPS2-A和REPS在浓度达到8.0 mg/mL时表现出超过50.0%的ABTS自由基清除能力。结果表明，多糖组分REPS2-A和REPS对ABTS自由基具有清除能力，可作为潜在的抗氧化剂进一步研究。
图7 清除ABTS自由基的能力
Fig.7 ABTS radical scavenging capacity of REPS2 and REPS2-A
2.6.3 还原力实验结果
还原力的活性可以有效地用于显示抗氧化活性的能力。在反应中还原剂的存在导致Fe3+/铁氰化物络合物的还原，将其转化为Fe2+形式，可以通过在700 nm形成普鲁士蓝来检测[20-21]。本文比较了抗坏血酸，多糖组分REPS和REPS2-A的还原能力，如图8所示，较高的吸光度表明较强的还原能力，有相互依赖性。当浓度为8.0 mg/mL时，抗坏血酸、多糖组分REPS和REPS2-A的最大还原力分别为2.789±0.030，0.710±0.040和0.352±0.010。当多糖组分REPS和REPS2-A组分的浓度逐渐增大时，两者的还原力都在逐渐的增强，而多糖组分REPS的增加量大于REPS2-A，这说明经纯化后的多糖组分REPS2-A组分其活性低于粗多糖组分REPS，这也与上述2种抗氧化活性试验结果一致。
图8 REPS2和REPS2-A的还原力
Fig.8 Reducing power of REPS2 and REPS2-A
3 结论
本文主要对胶红酵母R. mucilaginosa CICC 33013菌株代谢的胞外多糖REPS进行分离纯化、初步结构解析及抗氧化活性分析等方面进行研究。结果表明：从R. mucilaginosa CICC 33013中分离出水溶性胞外多糖REPS，其产量为6.2 g/L。REPS经分离纯化得到多糖组分REPS2-A，分子质量为7.125×106 Da。通过不同方法的抗氧化能力体外测定(DPPH、ABTS、还原力)，证明REPS2-A具有较好的自由基清除能力，当多糖组分REPS2-A质量浓度为8 mg/mL时，DPPH自由基清除率为49.1%，ABTS自由基清除率为51.2%，还原力为0.352。多糖组分REPS2-A在各种反应体系中表现出不同的抗氧化活性，这可能与其特殊的结构和组成有关。研究表明，抗氧化活性的不同归因于不同机制，例如防止链引发，过渡金属离子催化剂的结合，过氧化物的分解，还原能力和自由基清除[22-25]。此外，研究发现，酵母多糖(如酵母多糖和颗粒葡聚糖)能够刺激超氧化物的产生并减少由自由基或PMN白细胞诱导的DNA链断裂[26]。然而，胶红酵母胞外多糖REPS2-A的抗氧化机制尚不清楚，未来的研究主要集中在抗氧化机制与多糖组分REPS2-A结构之间的关系上。此外，多糖组分REPS2-A的体内抗氧化活性还有待进一步研究。
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