黑茶，因成品茶外观呈黑色而得名，是我国六大茶类之一，生产历史悠久，生产区域广阔，花色品种众多，其代表品种有湖北青砖茶、湖南茯砖茶、四川康砖茶、云南普洱(熟)茶和广西六堡茶等[1]。黑茶滋味醇和，具有生津止渴、减肥降脂[2]、健胃助消[3]、抗氧化[3]、抗癌[4]、降血糖[5]等多种功效，备受消费者喜爱。然而，不同地区、不同品类黑茶质量参差不齐，直接影响黑茶的消费和售价；随着黑茶产业呈良好发展态势，市场上虚假标榜黑茶产地、以次充好的现象屡见不鲜[6]，这严重影响黑茶产业健康发展和消费者基本权益；因此，开展黑茶产地鉴别研究显得极其重要。
传统茶叶鉴别方法主要为感官评定或简单理化指标检测，前者主观性强，后者步骤繁琐，无法全面反映茶叶的整体特征[7]。因此，利用现代分析仪器获取样品组分信息，再结合多元统计方法进行数据分析以最大程度获取有效信息，在样品成分信息差异、地域特征和品质特性之间建立关联，进而筛选特征性物质和构建模型，已成为茶叶产地与种类鉴别的重要模式。NING等[8]以六大茶类436个样本为研究对象，采用高效液相色谱测定其儿茶素、咖啡因、茶氨酸含量，并结合Fisher逐步判别分析构建模型，结果表明，该模型能够有效鉴别六大茶类。王淑慧等[9]采用HPLC指纹图谱技术对3种名优绿茶31个样品的茶汤特征滋味成分进行检测分析，并利用逐步判别分析法对不同绿茶种类进行判别，其判别正确率为100%。戴悦雯等[10]对4个不同等级的西湖龙井茶分别进行香气属性感官审评和电子鼻检测，通过Fisher判别分析法和K-最近邻算法进行特征提取和模式分类，实现对训练集样本100%和测试集样本97.5%的正确识别。Fisher判别分析法是依据方差分析原理建立而成，在区分少数样本时具有直观、快速简便的优势，且对总体的分布和方差无特殊要求，因而在产地鉴别领域具有广泛应用[7-10]。但目前茶叶鉴别研究主要集中在六大茶类和部分名优绿茶上[7-10]，尚未见运用Fisher判别法识别黑茶产地的研究报道。
鉴于此，本研究以湖南、湖北、四川、云南4个地区具代表性的55个黑茶样本为研究对象，采用HPLC等方法检测其主要生化成分，并通过主成分分析(principal component analysis，PCA)和系统聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)筛选特征性成分和研究产地聚类，同时通过Fisher判别分析筛选引起不同地区黑茶产生差异的主要化合物，建立黑茶分类的判别函数模型，以期为黑茶的品质评定和地区判别提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试黑茶采集于湖南、湖北、四川、云南等地，共计55个样本，均为紧压茶。因六堡茶品质独特，与其他黑茶差异明显，如具有松烟香、槟榔香等[11]，故本研究未选择六堡茶作为样品。根据相关标准[12-13]，青砖茶、茯砖茶和普洱茶(熟茶)紧压茶不分等级，康砖茶分为特制和普通2个等级。研究报道，在一定的贮藏时间内，黑茶品质相对稳定，因此样本的生产年份集中于2015～2017年[14]。同一公司样品采集前均贮藏于该公司具恒温恒湿条件的仓库，采集后均贮藏于实验室4 ℃冰箱，保证了贮藏环境的一致性。样品具体信息见表1。
表1 不同地区黑茶样品编号
Table 1 The numbers of dark teas in different areas
黑茶种类采集地点样品数量/个编号青砖湖北省咸宁市(咸安区、崇阳县、赤壁市)14HB1～HB14茯砖湖南省长沙市(望城区、雨花区)、益阳市(安化县、桃江县)13HN15～HN27特制康砖四川省雅安市(雨城区、名山区)14SC28～SC41普洱茶(熟茶)云南省昆明市(官渡区、安宁市)、西双版纳傣族自治州(勐海县)、大理白族自治州(大理市下关镇)14YN42～YN55
运用Fisher判别分析法建模时，随机选择4个地区各3个样品作为预测样本集用于验证模型，剩余样品则作为建模样本集用于建立模型。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 主要试剂
福林酚、甲醇(色谱纯)、冰乙酸(色谱纯)、Na2CO3、AlCl3、水合茚三酮、氯化亚锡、Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4、蒽酮、H2SO4、正丁醇、95%乙醇、乙酸乙酯、NaHCO3、草酸、没食子酸、谷氨酸、葡萄糖，均购自重庆永捷实验仪器有限公司；咖啡碱、儿茶素(catechin，C)、表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、草酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸均为标准品，购自美国Sigma公司。
1.2.2 仪器与设备
LC-20高效液相色谱仪，日本岛津公司；Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，美国安捷伦科技有限公司；FA1004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；722-型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；5810台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；KQ5200DE超声波振动仪，江苏昆山市超声仪器有限公司；微孔滤膜(0.45 μm)，上海市新亚净化器件厂；高速中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 茶多酚、黄酮、游离氨基酸总量、可溶性总糖、茶色素类的检测
茶多酚(福林酚法，参照GB/T 8313—2008)；黄酮(AlCl3比色法，参照《茶学实验技术》[15])；游离氨基酸总量(茚三酮比色法，参照GB/T 8314—2013，根据MAGNÉ等的研究方法略有改进[16])；可溶性总糖(蒽酮比色法，参照《茶学实验技术》[15]，根据BUYSSE等的研究方法略有改进[17])；茶色素类(分光光度法，参照《茶学实验技术》[15])。
1.3.2 儿茶素组分和咖啡碱的检测[18]
流动相A：2‰冰乙酸，流动相B：100%纯甲醇；色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；进样量：10 μL；流速：0.9 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：278 nm；检测时间：37 min，采用梯度洗脱程序。
1.3.3 有机酸组分的检测[19]
流动相A：0.05 mol/L KH2PO4溶液(用H3PO4调pH 2.7)，流动相B：100%纯甲醇，V(流动相A)∶V(流动相B)=97∶3；色谱柱：同1.3.2；进样量：20 μL；流速：0.6 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；检测时间：30 min。
1.4 数据分析
每组试验重复3次，数据均为
采用Origin 9.1绘制图形，IBM SPSS Statistics 19.0对数据进行单因素方差分析(Duncan法)、PCA、HCA和Fisher判别分析。
2 结果与分析
2.1 单因素方差分析与多重比较
文献报道，不同地区黑茶由于原料基础和加工工艺的不同，其品质风味、生化成分的含量与组成特征存在较大差别[20]。为明确不同地区黑茶生化成分的含量差异，本研究选择对黑茶品质风味和功能影响较大的19类生化成分进行比较和分析[20-27]。
2.1.1 不同地区黑茶的主要生化成分含量
由图1可知，云南熟普的茶多酚平均含量显著高于其他地区，湖南茯砖次之，湖北青砖和四川康砖最低，且无显著差异；云南熟普的总黄酮平均含量显著高于其他地区，湖南茯砖和四川康砖次之，湖北青砖显著低于其他地区；除湖北青砖外，各地区黑茶可溶性总糖平均含量无显著差异；云南熟普的游离氨基酸和咖啡碱平均含量均显著高于其他地区，且其他3个地区无显著差异。
图1 不同地区黑茶主要生化成分的平均含量
Fig.1 The average content of biochemical components in dark teas for different areas
注：各生化成分不同地区黑茶之间，不同小写字母，表示差异显著(P<0.05)，误差条高度数值为±标准差，在本研究中反映的是同一地区黑茶在某生化成分数据中的离散程度，其高度越低代表这类黑茶的品质越稳定，图2 ～图4同。
茶多酚具有抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、防治心血管疾病等多种生理功能，且对茶汤苦涩浓强滋味有重要贡献[21]；黄酮类化合物由于母核常含羟基、甲氧基和烃氧基等助色团而多显黄色，同时具有抗氧化、抗突变等功效[21]；游离氨基酸既是茶汤鲜爽滋味的重要成分，又可与糖类发生羰氨反应生成挥发性物质，还可在特殊温湿条件下发生氧化、降解和转化，与多酚类反应生成褐色色素影响茶汤色泽[20]；咖啡碱是茶汤苦味的重要物质基础，且具有兴奋神经中枢和利尿等药理功能，其与茶黄素、蛋白质等以氢键缔合后形成的复合物具有鲜爽味[21]；云南熟普的茶多酚、总黄酮、游离氨基酸和咖啡碱的平均含量均显著高于其他地区黑茶，这可能是云南熟普内质汤色红浓明亮、滋味浓厚回甘，且具有多种生理功能的重要原因。有研究认为，云南普洱茶独特的品质特征可能是其特殊原料和环境所致[22-23]：云南地处中国西南部，由于受地形地貌和印度洋、太平洋季风影响，气候类型多样，拥有雨量丰沛、光照充足、年温差小、日温差大等得天独厚的自然条件，因此晒青毛茶含有比一般原料更丰富的化学成分[23]，这些成分可为渥堆或自然陈化过程中的生物转化提供有利的物质基础。齐桂年等[24]认为，康砖和茯砖的茶多酚含量产生差异的主要原因是原料嫩度不同，湖南茯砖的原料主要是以湖南黑毛茶三级为主；而四川南路边茶主要是以修剪枝叶的毛庄茶、做庄茶为主，更加粗老。
2.1.2 茶色素组分
由图2可知,各地区黑茶的茶色素组分中，茶褐素含量最高，其次是茶黄素，含量最低的是茶红素。云南熟普的茶黄素平均含量显著高于其他地区，湖北青砖次之，湖南茯砖和四川康砖最低，且无显著差异；湖北青砖和湖南茯砖的茶红素平均含量显著高于其他2个地区；云南熟普的茶褐素平均含量显著高于其他地区，湖北青砖和四川康砖次之，湖南茯砖显著低于其他地区。茶色素(主要包括茶黄素、茶红素和茶褐素)是茶多酚的主要水溶性氧化产物，不仅是组成茶汤黄、橙、棕的主体，也参与干茶色泽的形成[25]；茶黄素和茶红素是茶多酚氧化聚合过程中的中间产物，在黑茶中积累较少，而茶褐素作为最终氧化聚合产物，在黑茶中积累最多；云南熟普的茶黄素和茶褐素平均含量均显著高于其他地区黑茶，这可能是形成其外形色泽红褐、汤色红浓明亮、叶底红褐等独特品质特征的重要原因[26]。
图2 不同地区黑茶茶色素组分的平均含量
Fig.2 The average content of tea pigment components in dark teas in different areas
2.1.3 儿茶素组分
儿茶素是茶多酚的主体成分，其单体主要包括6种：C、EC、EGC属于非酯型儿茶素，ECG、GCG、EGCG属于酯型儿茶素[25]。由图3可知，各地区黑茶的儿茶素组分中，除EGCG较高之外，其他5种儿茶素的平均含量较低。云南熟普的儿茶素组分以简单儿茶素为主，而其他地区的儿茶素组分以酯型儿茶素为主，且EGCG含量最高。四川康砖的C平均含量显著高于其他地区；湖北青砖的EC平均含量显著高于其他地区；湖南茯砖的EGC平均含量显著高于其他地区；各地区黑茶的ECG平均含量差异显著，由高到低为四川康砖>湖南茯砖>湖北青砖>云南熟普；四川康砖的GCG平均含量显著高于其他地区；各地区黑茶的EGCG平均含量差异显著，由高到低为四川康砖>湖南茯砖>湖北青砖>云南熟普。
图3 不同地区黑茶儿茶素组分的平均含量
Fig.3 The average content of catechin components in dark teas in different areas
2.1.4 有机酸组分
黑茶中的有机酸含量与发酵程度呈高度正相关，严重制约渥堆发酵的微生物菌群，对酸碱平衡起重要的调节作用，同时有机酸作为糖类分解的中间产物，对香气形成也具有重要作用，但目前研究相对较少[27]。
图4 不同地区黑茶有机酸组分的平均含量
Fig.4 The average content of organic acid components in dark teas in different areas
由图4可知，各地区黑茶的有机酸组分中，草酸和苹果酸含量最高，其次是奎尼酸，含量最低的是柠檬酸和琥珀酸。云南熟普的草酸平均含量显著高于其他地区；湖南茯砖的奎尼酸平均含量显著高于其他地区；除云南熟普外，各地区黑茶的苹果酸平均含量无显著差异；各地区黑茶的柠檬酸平均含量无显著差异；四川康砖的琥珀酸平均含量显著高于其他地区。
鉴于单因素方差分析只能对4个地区黑茶生化成分的平均含量差异进行评估，无法对各生化成分在不同地区黑茶样品的分布规律及特征进行比较分析，且单一分析方法对数据的内部关系及整体评价存在局限性[28]，为此，本研究综合运用单因素方差分析、主成分分析、系统聚类分析、Fisher判别分析4种分析方法进行多变量分析处理。
2.2 主成分和聚类分析
2.2.1 主成分分析
PCA分析是将上述55个黑茶样品检测所得19种生化成分进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，从而在分析图上只显示最重要的2个综合指标，形成二维样品得分散点图(图5-A)和旋转载荷矩阵图(图5-B)。由表2结合旋转载荷矩阵表可知，PC1～PC8分别可解释全部成分变量信息的33.95%、17.51%、10.80%、8.53%、5.18%、4.23%、3.60%、3.25%，累积贡献率达87.06%；其中茶褐素、游离氨基酸总量、咖啡碱、黄酮、茶多酚对第1主成分贡献率较大，GCG对第2主成分贡献率较大，EGC对第3主成分贡献率较大，柠檬酸对第4主成分贡献率较大(表2)。
表2 主成分的特征值和方差贡献率
Table 2 Eigenvalue and variance contribution rates ofprincipal components
主成分序号特征值贡献率/%累积贡献率/%PC16.4533.9533.95PC23.3317.5151.46PC32.0510.8062.26PC41.628.5370.79PC50.985.1875.98PC60.804.2380.21PC70.683.6083.81PC80.623.2587.06
由图5-A可知，不同地区黑茶在第1、2主成分的得分图上有一定程度的聚类趋势，其中四川康砖主要分布于第1象限，分布较集中，与湖南茯砖有一定交叉；湖北青砖和湖南茯砖主要分布于第3象限，这2类茶呈交叉分布；云南熟普主要分布于第2和第4象限，且与其他黑茶距离较远。结合图5-B可知，第1象限主要为以GCG、C、ECG、EGCG含量较高，而茶黄素含量较低的四川康砖为代表的黑茶；第3象限主要为以EC、茶红素含量较高，而茶褐素、黄酮含量较低的湖北青砖和湖南茯砖为代表的黑茶；第2、第4象限主要为以茶褐素、游离氨基酸总量、茶多酚、咖啡碱、黄酮、草酸、茶黄素含量较高，而EGCG、ECG含量较低的云南熟普为代表的黑茶；此结果与单因素方差分析结果一致。
A-主成分得分散点图; B-旋转载荷矩阵图
图5 主成分得分散点图和旋转载荷矩阵图
Fig.5 Scatter plot of PCA scores and rotation load matrix diagram
2.2.2 系统聚类分析
以欧氏距离的平方为不同类别数据点间距离(相似度)的计算准则，以组间平均连接法为组群的合并准则，对4个地区共55个黑茶样品进行HCA，结果见图6。选取不同的欧式距离可获得不同的分类结果：在15欧氏距离处，55个黑茶样品聚为2类，第1类为YN42～YN55，这类黑茶均为云南熟普，与其他地区黑茶的品质有明显区别，其茶多酚、总黄酮、游离氨基酸、咖啡碱、茶黄素、茶褐素、草酸含量较高；湖北青砖、湖南茯砖和四川康砖聚为第2类；此分类与PCA结果一致。在5欧氏距离处，第2类可分为2个亚类，其中第1亚类为HB4、HB5、HB6，这类黑茶均为湖北青砖。在2欧氏距离处，第2亚类可分为11个小类，HN23、SC33、SC35、SC36、SC38、SC39聚为第1小类；SC29、SC41聚为第2小类；HN16、HN21聚为第3小类；HN15、HN25、HN27聚为第4小类；HB2、HB3、HB8、HB9、HB12、HB14聚为第5小类；HB1、HB7、HB10、HB13、HN22、SC32聚为第6小类；SC31、SC34、SC37、SC40聚为第7小类；HB11和SC30分别为第8小类与第9小类；HN17、HN18、HN19、HN20、HN24聚为第10小类；HN26和SC28聚为第11小类；其中有8个小类都以某一地区的黑茶样品为主，这说明同一地区同一类别黑茶易聚在一起，其品质具有一定的相似性和共性，侧面反映了本研究所选样品的典型性。
图6 不同地区黑茶的聚类分析树状图
Fig.6 Cluster analysis dendrogram of dark tea in different areas
PCA和HCA结果均表明，云南熟普很好地聚为一类，但其他地区黑茶不能被有效识别。这可能是由于特征值大于1的主成分有前4个，但累积贡献率不足85%，这使得PCA在本研究中的应用存在信息量提取不足、特征向量方向不确定等缺点[29]；HCA作为一种无管理模式的识别方法，所得结果很大程度上取决于方法所采用的距离、类间距等参数，不一定能反映数据的真实模型[30]；因此提出一种有监督的数据降维方法在黑茶分类中变得尤为关键。
2.3 Fisher判别分析
Fisher判别分析是一种把高维数据压缩为一维数据的多元分析方法，基本思路就是从N个总体中抽取具有P个指标的样品观测数据，通过方差分析构造一维判别函数或判别式，然后应用该线性函数把P维空间中的已知类别总体以及求知类别归属的样本都变换为一维数据，再根据其间的亲疏程度把未知归属的样本点判定其归属；与其他方法不同之处在于，判别分析是一种有指导有监督的分类预测方法[30](表3)。
表3 黑茶类型典型判别结果
Table 3 Results obtained for dark tea classification by stepwise canonical discrimination analysis
验证方式类别预测组成员湖北青砖湖南茯砖四川康砖云南熟普正确判别率/%整体正确判别率/%原始分类湖北青砖(n=11)11000100.0湖南茯砖(n=10)01000100.0四川康砖(n=11)00110100.0云南熟普(n=11)00011100.0100.0未分组案例(n=12)324391.791.7交叉验证分类(留一法)湖北青砖(n=11)11000100.0湖南茯砖(n=10)01000100.0四川康砖(n=11)0110090.9云南熟普(n=11)00011100.097.7
Fisher判别分析结果表明，共有7个变量对判别效果影响极显著。其影响大小依次为：茶褐素>ECG>EGC>黄酮>C>EGCG>EC(根据F值大小)，其他生化成分对此判别模型的影响不显著(P>0.05)。通过判别分析，建立了3个典型判别式函数(Y)，分别为：
Y1=-3.926+0.423×ρ(黄酮)+0.064×ρ(茶褐素)+0.178×ρ(C)-0.073×ρ(EC)+0.135×ρ(EGC)-0.273×ρ(ECG)-0.182×ρ(EGCG)
(1)
Y2=-6.623+0.431×ρ(黄酮)+0.010×ρ(茶褐素)+1.308×ρ(C)-0.298×ρ(EC)-0.031×ρ(EGC)+0.592×ρ(ECG)+0.034×ρ(EGCG)
(2)
Y3=-0.395-0.231×ρ(黄酮)+0.039×ρ(茶褐素)+1.559×ρ(C)+0.172×ρ(EC)-0.646×ρ(EGC)-0.006×ρ(ECG)+0.051×ρ(EGCG)
(3)
其中前2个典型判别式函数分别可解释71.6%和19.4%的方差变化，Y3解释了9.0%的方差变化。通过以上2个判别函数，分别计算不同地区黑茶样品在前2个函数的得分，以Y1为横坐标，Y2为纵坐标，得到不同地区黑茶的线性判别图(图7)。由表3可知，在原始分类结果中4个地区黑茶被完全分开；在交叉验证分类结果中，湖北青砖正确率为100.0%，湖南茯砖正确率为100.0%，四川康砖正确率为90.9%，云南熟普正确率为100.0%，9.1%的四川康砖被预测到湖南茯砖中；整体原始分类正确率(即回判成功率)为100%，交叉验证正确分类率为97.7%；在未分组案例中，仅有1个湖南茯砖被误判到四川康砖，外部验证正确分类率为91.7%。图7显示线性判别得分，湖北青砖、湖南茯砖、四川康砖的分组界限不清晰，但4个地区黑茶样品在空间上能够良好地区分，表明选择的7种生化成分可以反映不同地区黑茶生化成分特征的差异与联系，用得到的判别函数可以实现不同地区黑茶的良好区分。
图7 不同地区黑茶的线性判别得分图
Fig.7 Scatter plot of fisher linear discriminant scores of dark tea in different areas
3 结论
不同地区黑茶因产地、原料和制作工艺不同，其品质也具有独特性。本研究以4个地区55个黑茶为研究对象，通过HPLC等技术检测其生化成分，并结合多元统计分析方法研究后得出：
(1)单因素方差分析结果表明，云南熟普的茶多酚、总黄酮、游离氨基酸、咖啡碱、茶黄素、茶褐素、草酸含量显著高于其他地区，但ECG、EGCG含量显著低于其余地区；云南熟普的儿茶素组分以简单儿茶素为主，而湖北青砖、湖南茯砖、四川康砖的儿茶素组分均以酯型儿茶素为主，且EGCG含量最高。
(2)PCA结果表明，不同地区黑茶生化成分的含量与组成特征差异较大，四川康砖以GCG、C、ECG、EGCG含量较高，而茶黄素含量较低为特征；湖北青砖和湖南茯砖的生化成分组成特征接近，主要以EC、茶红素含量较高，而茶褐素、黄酮含量较低为特征；云南熟普主要以茶褐素、游离氨基酸总量、茶多酚、咖啡碱、黄酮、草酸、茶黄素含量较高，而EGCG、ECG含量较低为特征。HCA结果表明，云南熟普易聚为一类，与其他地区黑茶品质差异明显，但其他地区黑茶不能被有效区分；同一地区黑茶较易聚在一起，其品质具有一定的相似性和共性。
(3)Fisher判别分析结果表明，虽然分组界限不清晰，但4个地区黑茶样品在空间上能够被良好区分；茶褐素、ECG、EGC、黄酮、C、EGCG和EC是影响判别分析结果的主要物质，并根据这7种化合物建立了区分4个地区黑茶的判别函数，其原始分类正确率(即回判成功率)为100%，交叉验证正确分类率为97.7%，外部验证正确分类率为91.7%。
鉴于黑茶独有的微生物代谢参与使其品质形成极为复杂、不同地区黑茶的生化成分种类及含量差异较大，本研究仅选取4个地区最具代表性的黑茶且样本数量有限，因此研究所得分类模型和函数不一定适用所有黑茶产地鉴别，但这种基于生化成分、结合多元统计方法来构建分类模型的方法可为更多黑茶的区分提供参考价值，并可为规范黑茶加工方式及保证黑茶品质安全、质量标准提供一定的理论依据。
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