灵芝菌丝体固态发酵豆渣的营养成分变化

申春莉,李曼,沙见宇,张锦丽*

(山东农业大学 食品科学与工程学院,山东 泰安, 271000)

摘 要为了研究灵芝菌丝体固态发酵豆渣过程中的营养特性变化,以豆渣为原料,利用灵芝菌丝体固态发酵豆渣,研究发酵过程中菌质的形态指标、理化指标、生化指标的变化。结果表明,灵芝菌丝体发酵豆渣可分为3个 阶段,1~5 d为发酵前期,5~9 d为发酵后期,9~11 d为老化期。豆渣经灵芝菌丝体固态发酵,总膳食纤维的质量分数在发酵前期由发酵前的43.16%显著下降至28.72%;脂肪的质量分数由发酵前的19.69%显著下降至发酵末期的12.29%;可溶性蛋白、氨基酸态氮的含量分别由发酵前的2.27 mg/g、1.16 mg/g显著上升至发酵末期的11.05 mg/g、9.94 mg/g;多肽的含量由发酵前的11.90 mg/g上升至发酵后期的19.59 mg/g。该研究结果为灵芝菌丝体固态发酵豆渣的工艺优化提供了理论依据。

关键词灵芝菌丝体;豆渣;固态发酵;菌质;形态;营养成分

豆渣(soybean curd residue,SCR)是加工豆浆或豆腐后的副产物,是一种具有再利用价值和生物转化潜力的材料。豆渣的营养成分均衡,干豆渣中含有25.4%~28.4%粗蛋白(主要是不溶性蛋白)、9.3%~10.9%脂肪、40.2%~43.6%不溶性纤维、12.6%~14.6% 可溶性纤维和3.8%~5.3%可溶性碳水化合物[1](质量分数),具有颗粒细小且湿润的质地,能够支持固态发酵中各种微生物的生长[2]

通过微生物发酵,对豆渣进行生物转化,营养及消化率得到提高,发酵产物(又称菌质,FSCR)既实现了豆渣的整体加工利用又亦含有菌丝体的营养成分,可作为食品或配料,使之重新回到食物链中。VONG等研究了少孢根霉联合解脂耶氏酵母固态发酵豆渣前后主要营养成分及抗氧化活性的变化[3-4],管瑛等将雅致放射毛霉、米根霉、少孢根霉作为固态发酵菌种,研究了发酵豆渣中主要营养成分及抗氧化活性的变化[5-6]。ZHANG等利用羊肚菌、灵芝固态发酵豆渣提取多糖[7-8],利用香菇提取多酚[9],并对发酵条件进行了优化。

对豆渣发酵过程进行监测有利于充分理解微生物在豆渣固体基质上的生长特性以及豆渣的降解机理,而灵芝菌丝体在豆渣上的发酵特性未见报道,对此进行探究,有望为灵芝固态发酵豆渣的工艺优化提供理论依据。本研究采用黑暗环境静态恒温培养灵芝菌丝体,探究发酵过程中菌质形态及营养物质的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵菌株及原料

灵芝(Ganoderma lucidum)菌株,由山东农业大学菌物试验基地提供。

新鲜豆渣:热加工豆浆后的剩余物,气味芳香。新鲜豆渣于105 ℃干燥至含水量为60%,分装于250 mL三角瓶中,121 ℃灭菌120 min,备用。

1.1.2 仪器

DHG-9070A 电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;SPX-250BSH生化培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司; UV755B 分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;HH-6水浴锅,国华电器有限公司;SYF-60F水分测定仪,上海精密仪器仪表有限公司;SZF-06 脂肪测定仪,上海经科仪器有限公司。

1.1.3 试剂

葡萄糖、琼脂、苯酚、浓H2SO4、冰醋酸、香草醛、MgSO4、KH2PO4、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、牛血清蛋白、酪氨酸、福林试剂、甲醛、醋酸钠,均为分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司。

1.1.4 培养基与种子培养

PDA培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、马铃薯浸膏4、KH2PO4 3、MgSO4 1.5、琼脂20(菌种保藏和活化)。

液体种子培养基:同PDA培养基,不加琼脂。

种子培养:取250 mL三角瓶分装75 mL液体培养基,接种5个直径1 cm的菌苔,于26 ℃、150 r/min振荡培养11 d。种子颗粒大小均匀一致,培养液澄清透明。

1.2 固态发酵

吸取种子液(接种量为0.15 mL/g),接种于装有35 g豆渣的三角瓶中(含水质量分数60%),混合均匀,封口膜(透气孔14 mm ×14 mm)封口,26 ℃静置培养。每隔1 d取样,进行分析测定。样品空白为接种等体积蒸馏水的豆渣,样品对照为发酵0 h的菌质。

1.3 菌质外观及微观形态观测

将新鲜菌质于60 ℃烘干,用导电胶粘于板台上,表面喷金,SEM观察菌质颗粒表面结构变化[10]。取菌质纵切面的中心位置,光学显微镜观察发酵豆渣细胞、纤维以及菌丝生长规律的变化。

1.4 菌质质构特性测定

取不同发酵时间的菌质,切成15 mm ×15 mm ×10 mm的小方块用于质构特性分析,采用P100探头,在TPA模式下测定菌质质构特性,数值以10个样品的平均值表示[11-13]

1.5 菌质理化、生化指标的测定

将菌质用液氮研磨,测定理化及生化指标。菌质中的膳食纤维、蛋白质、氨基酸态氮的测定参照相应的国标。可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝法测定[6],菌质中的脂肪含量采用“脂肪测定仪法”测定,含水量采用自动水分测定仪测定。

菌质生物量可通过核酸含量表征,核酸含量的测定采用定磷法。菌质中磷的测定参照相应的国标。

1.6 数据处理与分析

数据离散性由平均值和标准差表示,采用Origin 17.0软件进行数据变化规律分析,以Duncan多重比较法(P< 0.05)进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中菌质形态变化

豆渣经灵芝菌丝体发酵后,菌质洁白,有菌菇特有的香气。

灵芝的菌丝为圆形管状物,其顶端呈钝圆锥形。在这个圆锥形的顶端,约有2~10 μm长的部分称为生长点。生长点是菌丝生长最为旺盛的部分。生长点后面较老的菌丝可产生分枝,每个新分枝的顶端也都具有生长点。菌丝生长点不断伸展,同时形成锁状联合,进行菌丝细胞增殖。其他部分由于细胞较厚很难伸展[14]

发酵过程中菌质的形态变化如图1所示。

a~f分别为发酵1、3、5、7、9、11 d的豆渣;a1~f1
表示三角瓶中FSCR俯瞰图;a2~f2表示三角瓶中FSCR侧视图;a3~f3表示灵芝菌丝的SEM图;a4~g4表示豆渣颗粒的SEM图;a5~f5表示豆渣子叶细胞降解的显微镜图;b6~f6表示豆渣纤维的显微镜图
图1 发酵过程中菌质形态变化
Fig.1 Changes in the appearance of fungal substance during fermentation

根据菌质的形态特点,可将灵芝发酵豆渣的过程分为3阶段,发酵1~5 d为生长前期,5~9 d为生长后期,之后2 d为老化期。

生长前期的菌丝生长速度快,在发酵第1天,菌丝已经进入细胞生长(图1-a5),随着发酵的进行,菌丝呈发散状向四周扩展(图1-a1~图1-c1),菌丝数量逐渐增多(图1-a3~图1-c3),至第5天时,菌丝完全占领料面,气生菌丝纤弱,颜色洁白(图1-c1),开始形成菌丝束(图1-e3)。SCR颗粒呈蜂窝状,表面粗糙松散,具有不均匀沟壑,随着发酵的进行,豆渣颗粒有明显的降解痕迹,表面沟壑消失(图1-a4~图1-a4)。SCR子叶细胞呈椭圆形,细胞壁不完整,发酵过程中子叶细胞的细胞壁在灵芝基内菌丝胞外酶的作用下逐渐被降解(图1-a5~图1-c5),至第5天时,细胞壁可以被完全降解。SCR及发酵第1天的FSCR均未发现纤维晶体,在发酵第3天出现了纤维晶体(图1-b6),之后纤维晶体在灵芝基内菌丝胞外水解酶的作用下被部分降解(图1-b6~图1-c6)。

生长后期,菌丝数量进一步增加且洁白浓密(图1-c1~图1-e1),发酵至第9天,豆渣表面被菌丝完全覆盖(图1-e1)。发酵至第7天,菌丝沿三角瓶瓶壁生长现象明显,瓶壁下部的菌丝因缺氧导致菌质与瓶壁分离(图1-f2),分离后通氧量增加,至第9天,在分离的间隙又长出一小部分新的菌丝体(图1-e2),并伴有水珠产生(图1-e2)。气生菌丝进一步扭结,呈树枝状(图1-d3~图1-e3)。随着发酵的进行,豆渣颗粒表面降解程度增大,出现了不规则的微鳞片和孔洞(图1-d4~图1-e4),推测这些孔洞可能是生成的CO2和挥发性碱性氮的逸出通道[11],FSCR的这种结构,促进了菌质形成团状。豆渣子叶细胞在灵芝胞外酶的作用下,细胞内容物被释放出来(图1-c5~图1-e5),豆渣纤维晶体的聚集度降低(图1-c6~图1-e6)。

老化期,气生菌丝变黄(图1-f1),菌质与瓶壁的分离部分水珠的产生量增加(图1-e2~图1-f2),部分基内菌丝自溶(图1-f3),豆渣颗粒表面变得光滑,孔洞体积及数量增大(图1-e4~图1-f4),豆渣细胞内容物释放程度增大(图1-e5~图1-f5),纤维降解程度增大(图1-e6~图1-f6)。SCR和FSCR之间的SEM形态差异可归因于膳食纤维、蛋白质的降解[11]

2.2 发酵过程中菌质含水量的变化

SCR的含水量为60.25%(质量分数),发酵过程中菌质含水量的变化如图2所示。发酵0~5 d含水量呈下降趋势,由60.25%下降至58.14%,推测原因为发酵前期菌丝生长旺盛,同化作用强于异化作用,消耗了部分自由水。5~9 d含水量呈上升趋势,由58.14%上升至64.10%(质量分数),推测原因为灵芝菌丝的异化作用强于同化作用,大分子的降解产生了部分自由水。

图2 发酵过程中含水量的变化
Fig.2 Changes in water content during fermentation
注:不同小写字母表示处理组间差异显著。下同。

2.3 发酵过程中菌质质构特性变化

质构特性分析可以实现对食品感官指标的定量化表征。食品的质构特性主要与蛋白质、脂肪、水分含量相关[15]

SCR与发酵第1天的FSCR呈松散状态,质构无法测定,发酵过程3~11 d质构特性的变化如图3所示。由图3-A可知,随着发酵的进行,弹性、黏聚性、回复性在第3天均达到最大值,主要原因是第3天菌丝生长至团状,随着发酵的进行,豆渣在菌丝的连接作用下变得致密,蛋白质网络被破坏,使弹性、黏聚性、回复性降低[12-13]。在发酵过程中菌质的硬度、胶着度、咀嚼度在3~7 d变化相对平稳,7~9 d时显著增加,第9天达到最大值(图3-B),原因可能是菌质在0~9 d时处于生长阶段,其中的菌丝与豆渣的连接作用随着发酵时间的延长逐渐增强,使硬度、胶着度、咀嚼度增强;而后随着菌体自溶,菌丝的支撑力减弱,使硬度、胶着度、咀嚼度减弱。

A-在发酵过程中菌质的弹性黏聚性、回复性的变化;B-在发酵过程中硬度、胶着度、咀嚼度的变化
图3 发酵过程中的质构特性变化
Fig.3 Changes of texture properties during fermentation

2.4 发酵过程中生物量的变化

蕈菌生物量的测定包括直接法和间接法。直接法可分为干重法和湿重法,通常用于液态发酵中蕈菌生物量的测定,经离心、洗涤或进一步烘干后测定菌丝质量。丝状微生物在固态基质中生长时,菌丝深入培养基内部,紧密缠绕在一起,不易从底物中分离,所以通常采用间接法来进行生物量的测定。间接测定生物量的方法有核酸法、麦角固醇法、氨基葡萄糖法。核酸在细胞中的含量十分稳定,而且它在代谢上较为稳定,不受营养条件、菌龄等因素的影响,理论上讲与生物量具有较好的线性关系[16]。本研究采用核酸法间接测定生物量。用定磷法间接表示核酸的质量分数。

发酵过程中磷含量的变化如图4所示,自发酵开始至第11天,核酸的含量持续增加直至最大值,由发酵前的1.42 mg/g增加至1.8 mg/g。

图4 发酵过程核酸中磷的含量的变化
Fig.4 Changes of biomass during fermentation

生长前期,核酸含量呈上升趋势,增长速率一致,说明菌体生长迅速,如(图1-a1~图1-c1)所示。生长后期,5~7 d核酸质量分数变化不显著,根据图1-c3~图1-d3,发酵5~7 d菌质与三角瓶相连的菌体,由于透气量的减少发生自溶,以获得更多的氧气,此部分自溶的菌体与此阶段产生的菌体数量一致;发酵7~9 d,核酸质量分数呈增加趋势。9~11 d为菌体的老化期。此阶段的核酸质量分数呈增加趋势,究其原因是老化自溶的菌体细胞为新的菌丝生长提供了养分,新产生的细胞数目大于老化的细胞数目。

本研究中,核酸的变化规律适用于分析生长期的菌质特点,老化期的菌质可采用形态分析法确定。

2.5 发酵过程中膳食纤维质量分数的变化

SCR中SDF、IDF、TDF的质量分数分别为10.86%、32.30%和43.16%。发酵过程中的膳食纤维均来源于灵芝和豆渣两部分。IDF主要包括菌丝体中的几丁质以及豆渣中的纤维素、半纤维素;SDF主要包括菌丝体多糖以及豆渣中的果胶类物质。TDF的质量分数为SDF与IDF质量分数的总和。

发酵过程中膳食纤维具有相似的变化规律(图5)。可溶、不溶、总膳食纤维的质量分数呈先下降后上升的趋势。发酵第5天,SDF、IDF、TDF的质量分数达到最低值,分别为5.96%、22.76%和28.72%,究其原因为菌丝体的同化作用大于异化作用,菌丝体分泌胞外酶,将果胶、纤维素半纤维素分解为低聚糖、双糖或单糖,供菌体利用[3]。发酵5~9 d,SDF、IDF、TDF则呈上升趋势,原因是灵芝多糖的增多以及IDF的降解使SDF上升,菌丝体几丁质的增多使IDF升高。发酵9~11 d的菌质SDF的质量分数下降,IDF的质量分数上升,SDF下降的幅度高于IDF上升的幅度,所以发酵9~11 d TDF呈下降趋势。

一般认为,当IDF/SDF接近3时,膳食纤维为均衡的膳食纤维[12]。发酵过程中2.16<IDF/SDF<3.8,所以,整个发酵过程中的膳食纤维均为均衡的膳食纤维。

图5 发酵过程中膳食纤维质量分数的变化
Fig.5 Changes in dietary fiber during fermentation

2.6 发酵过程中可溶性蛋白、氨基酸态氮、多肽的变化

蛋白质是由氨基酸组成的分子质量巨大、结构复杂的化合物,它们不能直接进入细胞,微生物分泌蛋白酶至细胞体外,将蛋白质分解为大小不等的多肽或氨基酸等小分子化合物后进入细胞[17]。发酵过程中可溶性蛋白质、多肽、氨基酸态氮的质量分数变化如图6所示。发酵后可溶性蛋白的含量显著增加,由发酵前的2.27 mg/g显著上升至最大值11.05 mg/g (发酵第11天)。氨基酸态氮的质量分数由发酵前的1.16 mg/g显著上升至最大值9.94 mg/g(发酵第7天)。多肽的质量分数由发酵前的11.90 mg/g显著上升至最大值19.59 mg/g(发酵第9天)。

SHI等研究表明,豆渣中含量最多的为丙氨酸,其次是甘氨酸,羊肚菌发酵豆渣过程中产生了多种不同于豆渣原有的新的氨基酸(组氨酸、牛磺酸、赖氨酸、谷氨酸等)[8]。灵芝发酵豆渣过程中的氨基酸的组成变化有待进一步研究。

图6 发酵过程中可溶性蛋白、氨基酸态氮、多肽含量的变化
Fig.6 Changes of soluble protein, amino acid nitrogen and peptide content during fermentation

2.7 菌质中粗脂肪的变化

脂肪可以作为碳源被菌体利用,微生物在发酵豆渣过程中可以产生脂肪酶,将脂肪降解为短链脂肪酸、甘油和脂肪酸等小分子物质[18]。未发酵豆渣的脂肪质量分数为19.69%,发酵过程中脂肪的质量分数变化如图7所示。随着发酵的进行,脂肪的质量分数持续下降,至发酵结束时脂肪质量分数达到最小值(2.29%), 下降了37.56%。

图7 发酵过程中粗脂肪质量分数的变化
Fig.7 Changes of crude fat during fermentation

VONG等研究发现豆渣的脂肪酸中,饱和脂肪酸占17%,不饱和脂肪酸占83.3%,不饱和脂肪酸中含量最多的是亚油酸(占不饱和脂肪酸的65.0%),其次是油酸(占不饱和脂肪酸的31.4%);ω-3脂肪酸来源较少,豆渣中的亚麻酸是ω-3脂肪酸,含量为8.8%[4]。 发酵过程中脂肪酸含量的变化有待进一步研究。

3 结论

有气生菌丝的菌种更容易在豆渣固态基质中生长,能有效消除豆渣渣感,酵母菌、乳酸菌很难单独在豆渣固态基质中生长。应用于豆渣固态发酵的微生物主要为真菌(包括霉菌、食用菌、酵母)。

利用真菌固态发酵豆渣的研究中,主要分为3类。第1类是以发酵中的某一成分作为指标,优化培养条件,获得目标物的最大产量,发酵微生物为灵芝[8]、羊肚菌[10]、香菇[9]、美味牛肝菌[19]、平菇[20]、米曲霉[21]、毛霉[22]、黑曲霉[23]、毛霉[24]等。第2类是研究发酵前后功能成分及抗氧化活性的变化,发酵微生物为蛹虫草[25]、米曲霉[26]、解脂耶氏酵母[3-4]等。第3类是研究发酵过程中主要营养成分的变化,发酵微生物为少孢根霉[27]、米根霉[27]、雅致放射毛霉[6,28]、粗壮脉纹孢菌[29]

通过上述研究发现,相对于食用菌,霉菌降解纤维素的能力更强,生长时间更短,但是霉菌产生孢子,菌质颜色不理想,有些孢子有苦味。相对霉菌,食用菌可产生较多的氨基酸和多糖,不产生孢子,菌质颜色洁白,具有菌菇特有的香味,感官特性好。

灵芝菌丝体固态发酵豆渣过程中形态特性及营养成分变化的研究尚未报道。通过研究发现,灵芝菌丝体固态发酵豆渣可分为3个阶段,1~5 d为生长前期,菌丝体对细胞壁的降解作用明显。5~9 d为生长后期,菌丝大量分解细胞内容物和纤维晶体,豆渣颗粒表面产生孔洞。9~11 d为老化期,菌丝变黄,菌体自溶产生水珠。豆渣经过灵芝菌丝体发酵后,总膳食纤维含量下降了33.45%,脂肪含量下降了37.6%,可溶性蛋白升高了3.9倍,氨基酸态氮升高了7.6倍,多肽含量升高了65%。发酵后的豆渣营养物质得到了改善,可以作为食品配料。发酵过程中微生物胞外酶与其代谢产物的系统研究有待进一步探讨。

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Nutrient changes in solid-state fermented okara with Ganoderma lucidum

SHEN Chunli, LI Man, SHA Jianyu, ZHANG Jinli*

(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai′an 271000, China)

ABSTRACT Okara was solid-state fermented byGanoderma lucidum and its nutritional changes, morphological, physicochemical and biochemical indexes were characterized. The fermentation was divided into three distinctive stages: early fermentation stage (1-5 d), late fermentation stage (5-9 d), and aging stage (9-11 d). It was found that in comparison to fresh okara, the mass fraction of total dietary fiber at early fermentation stage decreased significantly from 43.16% to 28.72%, and fat decreased significantly from 19.69% to 12.29% at aging stage. While soluble proteins and amino nitrogen increased significantly from 2.27 mg/g and 1.16 mg/g to 11.05 mg/g and 9.94 mg/g, respectively, at aging stage. Besides, the mass fraction of peptides increased from 11.90 mg/g to 19.59 mg/g at late fermentation stage. Overall, this study provides a theoretical basis for optimizing solid-state fermentation process of okara byG.lucidum.

Key words Ganoderma lucidum mycelium; okara; solid state fermentation; morphology; nutrients

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020303

第一作者:硕士研究生(张锦丽副教授为通讯作者,E-mail:zhang li9538@sina.com)。

收稿日期:2019-02-24, 改回日期:2019-03-18