表1 液相色谱梯度洗脱条件
Table 1 Liquid chromatography gradient elution conditions
时间/min水/%甲醇/%05050153070253070265050
青花椒属芸香科花椒属的一种香辛料和油料作物，是我国传统的“八大调料”之一，因表皮呈青绿色而得名“青花椒”[1-2]。青花椒除作为调味料，其花椒精油、调味油、乳化油以及油树脂的微胶囊制剂等青花椒精深加工产品的应用也越来越广泛[3]。青花椒麻味浓郁、香气浓郁，相比红花椒更受广大消费者喜爱[4]。青花椒富含挥发油和酰胺类物质，且其主要麻味物质由这2种物质体现，同时青花椒还含有丰富的生物碱、香豆素、脂肪酸以及黄酮等[5-7]。青花椒也是一种药用经济作物，具有杀虫止痛止痒、温中等功效[8-10]，现已收录于《中华人民共和国药典》[11]。
现阶段，工业中常采用热风干制技术，但其能耗高，对绿色植物的护色效果无法达到要求[12-14]。同时，工业中也采用微波干制技术[15]、远红外干制技术[16]、热泵干制技术[17]等。热泵干制技术原理是采用特殊干制系统排出湿气，并在较高温度下用有效热能对物料进行干制的一种干燥方式[18]。热泵干制与其他干燥方式相比，其单位能耗除湿率达1.0～4.0 kg/(kW·h)，干制效果好于应用广泛的热风干制和干制物料稳定的真空干制[19]，且具有控制简单、设备维护成本低等优点，在轻纺、制药和农产品加工等行业中应用十分广泛[20-21]。杨韦杰等[19]通过对荔枝整果水分比的变化拟合荔枝热泵干制数学模型，结果表明Midilli模型对模拟整果荔枝热泵干燥过程效果好。CHUA等[22]设计两段式热泵干燥方式干制番石榴，相比连续式等温热风干燥，经过优化设计的两段式变温热泵干制减少20%的VC损失。
青花椒含有丰富的叶绿素，色泽是青花椒及其产品的最重要品质之一[23]。由于叶绿素稳定性差，易降解，所以青花椒干制期间，极易受外界环境因素影响，其叶绿素极易发生氧化降解而变色和退绿，干制后产品发褐，经济价值降低[24]。因此，青花椒干制过程中的护绿变得尤为重要。总色差△E代表样品颜色的可接受度，数值越低，其可接受度越高。热泵干制技术是一种节能高效的干制技术，特别适合青花椒这种干制中易褪绿的原料。基于此，本试验以重庆市江津九叶青花椒为试验原料，以青花椒色泽△E、挥发油含量和麻味物质含量为评价指标，优化热泵干制工艺参数，以期解决青花椒在干制过程中的颜色及其他品质变化，为青花椒护色干制护绿提供理论依据和参考意见。
鲜九叶青花椒：重庆市江津区凯扬农业发展有限公司；甲醇(分析纯)：成都市科峰化学品有限公司；麻味物质标准样品：实验室自制。
FA2004分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；YGKRK热泵干燥机，东莞市永淦节能科技有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司Scan Ultra PRO色差仪，上海信联创体电子有限公司；Centrifuge 5810离心机，艾本德(上海)国际贸易有限公司进口。
1.3.1 样品预处理
去除霉烂和病虫害的鲜九叶青花椒，称取一定质量青花椒，然后装盘。热泵设备先预热到设定参数，然后放入青花椒进行干制，干制时间以含水率≤11%为止。干制产品4 ℃密封保存备用，用于测定色差△E、挥发油含量和麻味物质含量等指标。
1.3.2 青花椒色差的测定
参考方法[25]进行色差的测定。以△E表示总色差，如式(1)。
(1)
式中：△L*=L*(样品)-L*(标准)；△a*=a*(样品)-a*(标准)；△b*=b*(样品)-b*(标准)。
1.3.3 青花椒挥发油含量的测定
参考GB/T 17527—2009 胡椒精油含量的测定[26]。
1.3.4 青花椒麻味物质含量的测定
根据DB50/T321—2009花椒麻味物质检测方法高效液相色谱法[27]。
精确称取1.000 0 g粉碎花椒于100 mL离心管中，加入甲醇50 mL并封口，超声提取麻味物质(50 ℃， 300 W，40 min)，离心(4 000 r/min，10 min)，上清液置于100 mL容量瓶，重复提取2次，甲醇定容，4 ℃冰箱保存备用。过0.45 μm孔径滤膜，进HPLC检测。
色谱参考条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C-18；流动相，水-甲醇(V/V)，梯度洗脱条件如表1；柱温，40 ℃；进样量，20 μL；流速，0.8 mL/min；检测波长，254 nm。
表1 液相色谱梯度洗脱条件
Table 1 Liquid chromatography gradient elution conditions
时间/min水/%甲醇/%05050153070253070265050
以本课题组制备的花椒麻味物质标准品为标样，用甲醇溶解后配制一系列不同浓度的标准品分析液。采用上述条件进行分析测定。花椒麻味物质在高效液相色谱中主要有3个峰，保留时间在14～16 min，如图1所示。
图1 花椒麻味物质标准品HPLC色谱图
Fig.1 High performance liquid chromatogram of numb taste standard ofZanthoxylum L.
以峰面积之和(Y)与对应花椒麻味物质标准品的浓度(X)进行线性回归，得回归方程为Y=26.392X-13.009(R2=0.999 9)。结果表明，花椒麻味物质浓度在一定范围时，线性关系良好。
1.3.5 热泵干燥单因素试验
称取一定质量青花椒进行热泵干燥，分别研究不同温度(45、50、55、60、65 ℃)；不同相对湿度(30%、35%、40%、45%、50%)、不同铺放量(450、600、750、900、1 050 g)对青花椒色差△E、麻味物质含量以及挥发油含量的影响。
1.3.6 Box-Benhnken试验设计
根据单因素试验的结果，采用Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，以干制温度、铺放量、干制相对湿度为响应变量，以色差△E、挥发油含量、麻味物质含量为响应值进行响应面优化。Box-Benhnken试验因素水平表见表2。
表2 Box-Benhnken试验因素与水平表
Table 2 Box-Benhnken response surface test factor level table
编码水平因素干制温度/℃铺放量/g相对湿度/%-155600350607504016590045
每个样品3次重复测定，数据统计与分析采用Excel和SPSS软件，结果以平均值±标准差(X±SD)的形式表示。方差分析采用ANOVA分析，数据进行正态分布检验，符合正态分布的多重比较采用Duncan法，不符合正态分布的用Kruskal-Wallis检验，差异显著性为P<0.05。图表绘制采用Origin 8.6软件。
2.1.1 温度对热泵干制青花椒品质的影响
不同热泵干制温度对青花椒品质的影响如图2所示。
图2 温度对热泵干制青花椒品质的影响
Fig.2 Effect of temperature on quality ofZanthoxylum L.
温度单因素试验时，固定相对湿度40%，铺放量750 g。由图2可知，青花椒的色差△E随着干制温度的升高呈先降低后升高的趋势，原因为干制温度低，则干制时间延长，导致叶绿素的损失。随着干制温度升高至65℃时，高温对青花椒中叶绿素破坏力加大，损失较多，色差△E增大。麻味物质含量随着干制温度的升高呈升高的趋势，挥发油含量呈先升高后降低的趋势，原因是主要为45 ℃低温干制时间为6 h， 60 ℃干制时间为3.5 h，所以45 ℃低温干制导致挥发油含量损失较多，当温度达到65 ℃时，高温会加快挥发油的挥发，进而导致其含量降低。
2.1.2 相对湿度对热泵干制青花椒品质的影响
不同热泵干制相对湿度对青花椒品质的影响如图3所示。相对湿度单因素试验时，固定温度55℃，铺放量750 g。如图3所示，青花椒色差△E随着相对湿度的升高呈先降低后升高的趋势，青花椒麻味物质和挥发油含量随着相对湿度的增加呈先升高后降低的趋势。原因是相对湿度较低时，水分蒸腾作用加快，相应的挥发油蒸发速度也加快，含量较低；当相对湿度较大时，青花椒干制时间延长，其挥发油损失增加。麻味物质含量和挥发油含量均在相对湿度40%时达到最大含量，色差△E在相对湿度40%时达到最小值。
图3 相对湿度对热泵干制青花椒品质的影响
Fig.3 Effect of relative humidity on quality ofZanthoxylum L.
2.1.3 铺放量对热泵干制青花椒品质的影响
铺放量对热泵干制青花椒品质的影响见图4。铺放量单因素试验时，固定相对湿度40%，温度55 ℃。由图4可知，青花椒色差△E随着铺放量的增加呈先降低后升高的趋势，青花椒麻味物质和挥发油含量随着铺放量的增加呈先升高后降低的趋势。当青花椒铺放量为750 g时，色差△E值最小，麻味物质含量和挥发油含量最大。
图4 铺放量对热泵干制青花椒品质的影响
Fig.4 Effect of weight on quality ofZanthoxylum L.
采用Box-Behnken设计试验，以干制温度、铺放量、相对湿度为响应变量，以色差△E、挥发油含量、麻味物质含量为响应值进行响应面优化。试验结果以及回归模型方差分析见表3和表4。
利用Design-Expert软件对实验数据进行二次多项回归拟合，得到色差△E的回归方程：Y1=8.08-0.17A+0.056B-0.1C-0.057AB+0.15AC+0.19BC+0.35A2+0.67B2+0.53C2；麻味物质的回归方程：Y2=2.42-0.013A-0.042B+0.075C-0.043AB+0.043AC-0.073BC-0.25A2-0.14B2-0.16C2；挥发油的回归方程：Y3=0.079-0.002 587A-0.001 437B-0.001 125C+0.000 975 0AB+0.000 55AC+0.000 35BC-0.005 938A2-0.004 788B2-0.003 862C2。
表3 响应面试验方案及结果
Table 3 Response surface test plan and results
试验号A(温度)B(铺放量)C(相对湿度)△E麻味物质含量/[g·(100 g)-1]挥发油含量/[mL·(100 g)-1]101-19.202.017.0720-118.972.107.0931018.811.806.594-10-19.402.317.38510-18.651.956.8260008.112.387.8671-108.911.956.6781109.061.856.429-1018.981.996.9310-1-109.022.137.4511-1109.402.206.81120119.312.096.89130008.0192.468.01140007.912.478.03150008.202.437.66160-1-19.622.317.13170008.152.387.99
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for the regression model
方差来源F值P值色差麻味物质挥发油色差麻味物质挥发油模型25.8718.3318.400.000 10.000 50.000 4A12.0132.2820.720.010 50.000 70.002 6B1.303.206.390.292 40.116 80.039 3C4.109.963.920.082 70.016 00.088 3AB0.681.601.470.437 70.246 50.264 6AC4.311.600.470.076 60.246 50.515 9BC7.394.650.190.029 80.067 90.676 4A226.7659.7657.410.001 30.000 10.000 1B296.0117.8237.33<0.000 10.003 90.000 5C260.5223.3424.300.000 10.001 90.001 7失拟项2.124.431.190.240 50.092 40.420 7R20.970 80.959 30.959 4R2adj0.933 30.906 90.907 3
按此回归方程建立响应值的方差分析见表4。由表4可知，3个模型回归均为极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05)。色差△E模型R2= 0.970 8，
3；麻味物质模型R2=0.959
9；挥发油模型R2= 0.959
3。表明3个响应值模型的拟合度较好，能很好地分析和预测色差△E、麻味物质含量和挥发油含量随热泵干制条件的变化情况。同时较低的离散系数(色差△E CV=1.59%，麻味物质CV =3.10%，挥发油CV =2.234%)也说明整个试验具有良好的精确度和可靠性。
从各因素影响程度分析，各因素F值可以反映出各因素对试验指标的重要性，F值越大表明对试验指标影响越大，结合表4得出色差△E值和麻味物质含量影响程度大小顺序均为：干制温度>相对湿度>铺放量；挥发油含量影响程度大小顺序为：干制温度>铺放量>相对湿度。
色差△E、麻味物质含量和挥发油含量的响应面见图5，由图5可以看出，色差△E响应值随着相对湿度及干制温度的变化幅度较大，而铺放量对色差△E响应值的影响较小，相对湿度和铺放量的两两交互作用显著，干制温度和相对湿度、干制温度和铺放量之间相互作用不显著。
a-色差△E响应值；b-麻味物质响应值；c-挥发油含量响应值
图5 各因素交互作用对色差△E、麻味物质含量和挥发油含量的影响
Fig.5 Effects of interaction between two factors on viscosity of chromatism △E and numb-taste components
麻味物质响应值随着干制温度的变化幅度较大，而铺放量和相对湿度及对麻味物质响应值的影响较小，干制温度和相对湿度、干制温度和铺放量、相对湿度与铺放量之间的两两交互作用均不显著，相互作用不显著。挥发油响应值随着各因素的变化幅度较大，干制温度、铺放量和相对湿度之间的两两交互作用均不显著。
利用Design-Expert软件，通过对回归方程求解，得到色差△E取最小值分别为8.11，麻味物质含量、挥发油含量最大值分别为2.45 g/100 g、7.95 mL/100 g，此时的工艺条件为干制温度59.34 ℃、铺放量为734.61 g、相对湿度为39.65%。为进一步验证回归方程的准确性和有效性，选择在最佳干制温度59.30 ℃、铺放量为735 g、相对湿度为40%条件下热泵干制青花椒，并进行相关指标测定，测定结果色差△E为8.10、 麻味物质含量为2.40 g/100 g、挥发油含量7.90 mL/100 g，验证结果与优化结果之间的误差分别为色差1.2%、麻味物质含量2.00%、挥发油含量0.62%，与模型预测值相近，可见回归模型能很好地预测热泵干制青花椒品质，优化结果可靠。
选取干制温度、铺放量和相对湿度为影响因素，以色差、麻味物质含量和挥发油含量为响应值，建立响应面分析模型。各因素对色差△E值和麻味物质含量影响为干制温度的影响最大，其次是相对湿度，最后是铺放量。干制温度对挥发油含量的影响也是最大，其次是铺放量和相对湿度。结果表明，最佳优化工艺条件为：干制温度59.30℃、铺放量为735 g、相对湿度为40%。在此工艺条件下干制青花椒，其色差△E为8.10、麻味物质含量为2.40 g/100g、挥发油含量7.90 mL/100g，验证结果与优化结果之间的误差均小于2.00%，与预测值相近，模型预测效果良好。并且经过响应面优化后的工艺条件可提高干制青花椒的色差△E值以及麻味物质含量。本研究将对延缓青花椒干制后叶绿素降解等方面提供理论支持。此外，关于绿色植物产品护色方面，如何选择天然优良的护色剂，以及改善绿色植物产品的干制先进技术仍需进一步深入探索，以降低传统干制的污染耗能以及产品品质不佳的情况，提高产品的经济价值。
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