植物中存在可以预防或治疗各种疾病的活性成分，截至目前，FDA已经批准上市了两个植物药。其中一个是2006年得到批准上市的处方药物Veregen (sinecatechins; polyphenon E 10%)，其主成分为一种以儿茶素混合物为主的绿茶提取物，用于局部(外部)治疗由人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV) 引起的生殖器疣，由于其高清除率和低复发率得到了广泛应用。这是近50年来，FDA根据1962年药品修正条例首个批准上市的植物药。
茶作为最受欢迎的饮品之一，其生物活性和保健功效已被广泛研究[1]。茶根据其制作工艺的不同，可分为绿茶(不发酵)，乌龙茶(半发酵)，红茶(氧化酶完全发酵)和黑茶(微生物后发酵)。与绿茶，乌龙茶和红茶不同，黑茶是一种独特的微生物发酵茶，其仅在中国和日本生产[2]。普洱熟茶作为云南特有名茶，具有降血脂，减肥，抗氧化，抗癌，清除自由基以及抗病毒等药理活性，是最具代表性的黑茶。微生物发酵对普洱熟茶的形成起着至关重要的作用，这是茶叶中化学成分发生复杂转化的结果。而目前对普洱熟茶和其他黑茶化学成分的研究成果甚少。随着普洱熟茶受关注度日益提升，其保健功效成为近年来茶科学领域的热门话题。普洱熟茶因其特有的发酵方式产生了一系列特征成分即A环加成儿茶素类成分。本文对近年来国内外普洱熟茶中化学成分特别是A环加成儿茶素类及其转化过程的研究进行了综述，为普洱熟茶的进一步研究提供基础和依据。
普洱茶为山茶科山茶属植物，是以云南特产的大叶种茶的晒青毛茶为原料经微生物发酵加工而成的，分为普洱生茶(即晒青毛茶)和普洱熟茶两大类。普洱熟茶渥堆发酵是微生物代谢与高温高湿条件下的天然氧化和细胞外酶活性相结合的过程。茶叶中的粗纤维、蛋白质、茶多酚和果胶等在微生物分泌的胞外酶和湿热条件的协调作用下，发生了氧化、聚合、降解、分解等一系列反应，形成了普洱茶陈醇微涩的独特口感[3]。
传统的普洱熟茶通常是根据经验发酵制造的，这极大地影响了茶叶的品质保证和现代发酵技术的应用。冯玲然等[4]发现，普洱熟茶香气的形成主要与蛋白酶产生菌有关，而汤色主要受多酚氧化酶产生菌的影响；蛋白酶产生菌、多酚氧化酶产生菌、果胶酶产生菌和纤维素酶产生菌在不同程度上促进了普洱茶滋味的形成。ZHANG等[5]发现，嗜热真菌在普洱茶渥堆发酵中起重要作用，其中Rasamsonia emersonii、Rhizomucor pusillus、Aspergillus fumigatus和Aspergillus niger为渥堆发酵过程中的优势嗜热菌种。
普洱熟茶因其特殊的发酵工艺，使其具有独特的风味，化学成分也产生了巨大的变化，主要类型总结如下：
2.1.1 简单儿茶素类
大量研究表明，普洱熟茶中简单儿茶素类单体含量远低于在绿茶、乌龙茶和红茶中的含量[6-7]。绿茶和红茶中主要含有没食子儿茶素(gallocatechin, GC, 1)、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG, 2)和表儿茶素-3-O-没食子酸酯(epicatechin gallate, ECg, 3)[8](图1)。
图1 普通儿茶素类化学成分
Fig.1 Chemical components of common catechins.
而普洱熟茶中主要为没食子儿茶素(GC, 1)和表儿茶素(epicatechin, EC, 4)[6-8]，并推测普洱熟茶中GC的含量相对增加，EC、EGCG和ECG的含量相对降低，可能是生茶在后发酵过程中从EGCG到表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC, 5)再到GC的生物转化而形成的[9]。多项研究证实了茶叶中以简单儿茶素为主的黄烷-3-醇类化合物具有较强的抗氧化活性[10-11]，并发现其清除1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH)自由基活性主要来自于其苯环上的邻位酚羟基，酚羟基越多活性越强，此外，儿茶素形成的酯由于能提供更多活泼氢，所以活性更强[12]。ZHAO等[13]在分子水平上解释了简单儿茶素类化合物的减肥、抗糖尿病及抗癌作用，即通过在人体各组织中激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信号通路从而产生相关活性。YI等[14]发现其可通过酮体生成/ SIRT3途径改善高脂饮食诱导的早期肾损伤。
2.1.2 特征儿茶素类
东方等和ZHOU等[15-16]从普洱熟茶中分离鉴定了2种新的8位取代的黄烷-3-醇类儿茶素并命名为普洱茶素A (6)和B (7)，以及2种已知的金鸡纳型多酚，表儿茶素-[8,7-e]-4α-(4-羟基苯)-3,4-二氢-2(3H)-吡喃酮(epicatechin-[7,8-bc]-4R-(4-hydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone)(8)和金鸡纳素Ib (9)。屠鹏飞等[17]从普洱熟茶中分离得到了8种8-N- 乙基-2-吡咯烷酮取代的黄烷-3-醇，普洱茶素I-Ⅷ (10-17)，并验证了普洱茶素I-IV对于由过氧化氢诱导的人类微血管内皮细胞(human micro-vascular endothelial cell, HMEC)损伤具有潜在的保护作用。TIAN等[18]从普洱熟茶正丁醇可溶部分分离鉴定了4种新的黄烷-3-醇衍生物，分别为8-羧甲基-(+)-儿茶素(18)，8-羧甲基-(+)-儿茶素甲酯(19)，6-羧甲基-(+)-儿茶素(20)和6-羧基-(-)-没食子儿茶素(21) (图2)。
图2 特征儿茶素类化学成分
Fig.2 Chemical components of characteristic catechins
2.1.3 茶褐素类
茶褐素(theabrownins，TBs)是普洱熟茶中主要的生物活性物质之一，是一类分子差异极大，结构复杂的高聚合物，由多酚类、茶黄素、茶红素进一步氧化、聚合转化而成[19]。可溶于水，但不溶于乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。TB被认为是形成普洱熟茶独特的色泽和口感的重要成分，也是评价普洱熟茶质量的重要参数。XIE等[20]研究发现普洱熟茶茶叶干重中茶黄素(theaflavins, TFs)，茶红素(thearubigins， TRs)和茶褐素(TBs)的含量分别在0.16%～0.29%，0%～0.99%和8.33%～13.65%。
在普洱熟茶研究初期，认为其所含TB与红茶类似[6]，但CP-Py-GC / MS分析结果显示，普洱熟茶与红茶的化学成分差异较大[21]，随后通过CP-MAS NMR和CP-GC/MS对普洱熟茶TB进行结构分析，发现其是一类性质类似于红茶TR的高聚物，其功能性基团为羟基、羧基、氨基以及甲基等基团，具有酚类物质特性，推断茶褐素酸水解去除其中蛋白质和多糖后的黑色沉淀物部分结构如图3所示[22]，目前普洱熟茶中TB的化学结构及其聚合方式仍不明确。大量药理活性研究表明TB具有抗氧化，减肥[23]，降血糖[24]及抗癌[25]活性，除此之外，岳随娟等[25]发现其具有调整肠道菌群的作用。龚加顺等[26]通过小鼠游泳实验证明TB能显著提高抗疲劳能力(图3)。
图3 不溶性黑色沉淀物的化学组成
Fig.3 Complex candidate compounds from the insoluble black precipitate identified from thetheabrownins pyrolysis products
普洱熟茶中除主要含有儿茶素类与茶褐素类成分外，还含有黄酮及其苷类、简单酚酸类、生物碱、他汀类和酰胺类化合物等。
2.2.1 黄酮及其苷类
从普洱熟茶中分离得到的黄酮及黄酮苷类成分主要为槲皮素(22)、山奈酚(23)、杨梅素(24)[27]、木犀草素(25)、3,4,5-三羟基-7-甲氧基黄酮(26)、3,4,7-三羟基-5-甲氧基黄酮(27)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(28)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(29)、 3,4-二羟基-5-甲氧基黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(30)[15,28-29]等。普洱熟茶中的黄酮主要以糖苷形式存在，其黄酮苷含量远低于普洱生茶，自由基清除活性也明显降低[30](图4)。
2.2.2 简单酚酸类
普洱熟茶中含有大量的酚酸类成分，如没食子酸(31)，2,5-二羟基苯甲酸(32)[27]，2-羟基苯甲酸(33)，4-羟基苯甲酸(34)，3,4-二羟基苯甲酸(35)，1,3-苯二酚(36)，4-甲基-1,2-苯二酚(37)，1,2,4-苯三醇(38)[15]和甲氧基酚类(39-43)等[7,31-33]。其中没食子酸是普洱熟茶中最重要的酚酸类之一，具有显著的生物活性，是诱导凋亡细胞死亡的促氧化剂。甲氧基酚类化合物作为普洱熟茶中的一个重要成分，也是普洱熟茶特殊香气形成的关键化合物之一[34]，研究发现该类成分由没食子酸经微生物酶[35-36]和/或热降解[7,33]而产生。值得注意的是，这些化合物可以在微生物影响下进一步发生化学转化，形成新的化合物(图4)。
2.2.3 生物碱
与其他茶相似，普洱熟茶中的主要生物碱是咖啡因(44)，可可碱(45)和茶碱(46)。2007年折改梅等[37]从普洱熟茶中分离出了8-氧化咖啡因(47)和嘧啶生物碱，如脱氧胸苷(48)，胸腺嘧啶(49)和尿嘧啶(50)，二者均被认为是普洱熟茶的新特征成分。2014年，TIAN等[18]在普洱熟茶中发现了咖啡因的前体7-甲基黄嘌呤(51)，其在不同生产工艺的茶中普遍存在[38](图4)。
2.2.4 奎宁酸衍生物
TIAN等[18]在普洱熟茶中发现了3-O-聚酰基奎宁酸(52)和3-O-咖啡酰奎宁酸(53) 两种奎宁酸衍生物。这类化合物主要有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗血小板聚集及保肝等活性(图4)。
2.2.5 他汀类
HWANG等[39]首次在普洱熟茶中发现洛伐他汀(54)，该成分是普洱熟茶中唯一的他汀，可以防治动脉粥样硬化和冠心病(图4)。
2.2.6 氨基酸
普洱熟茶中氨基酸含量低于白茶和绿茶，其氨基酸类成分主要以茶氨酸(55)、丝氨酸(56)和脯氨酸(57)为主，其中茶氨酸含量最高[40]。自然陈化的普洱茶比微生物发酵的茶氨酸含量高[41](图4)。
2.2.7 酰胺类化合物及其他
普洱熟茶中还含有2,2′,6,6′-四羟基联苯(58)[16]，异柠檬烯醇(59)[12]，叶绿素，类胡萝卜素[32]以及新型酰胺化合物N-(3,4-二羟基苯甲酰基)-3,4-二氢苯甲酰胺(60)[28]等(图4)。
图4 其他化学成分
Fig.4 Other chemical components.
普洱茶在其后发酵过程中，微生物产生的细胞外酶如鞣酸酶在化学催化反应中发挥重要作用，促进关键化学成分的转化。其中，普洱熟茶中儿茶素含量比晒青茶低，使其茶汤的苦、涩程度大幅降低。这是由于在后发酵过程中儿茶素经一系列氧化、缩合、降解的化学过程，形成了TF、TR、TB等一系列化合物。没食子酸(31)、咖啡因(39)的含量升高，二者含量的变化不仅与微生物的生长和繁殖有关，也受茶叶化学组成影响[42]，如没食子酸(31)含量的增加一方面可能来源于其在高温高湿条件下由儿茶素没食子酸酯转化而成[9,43]，另一方面可能由于微生物的参与单宁类成分被水解而得来。此外，普洱熟茶中杨梅素(24)，槲皮素(22)和山奈酚(23)含量较晒青茶大幅降低。总黄酮苷的含量也明显降低[44]，而类黄酮含量大大增加[45]。研究发现，利用杆菌状链霉菌(Streptomyces bacillaris)或变灰链霉菌(Streptomyces cinereus)短时间发酵茶叶能够增加他汀类(47)的含量[46]，这是在晒青茶中很难检测到的物质。上述主要化学成分的变化促成了从晒青茶浓重的苦味到普洱熟茶陈香醇厚口感的转变(图4)。
从普洱熟茶茶叶香气成分来看，其醇类，醛类和酯类物质含量显著增加，推测其可能是由某些微生物分解糖和蛋白质产生[47]。这种转变促使普洱熟茶产生香气品质的变化，形成特有的陈香。图5为发酵后化学成分可能的转化途径。
图5 化学成分在后发酵过程中的转化
Fig.5 Transformation of chemical constituents during the post-fermentation process
普洱熟茶具有降血脂，减肥，抗衰老，抗肿瘤以及抗病毒等功效，由于其成分复杂，结构多变，活性成分尚不明确，通过了解其化学成分，理解其促健康作用才是最为合理、科学的。到目前为止，仅发现普洱熟茶水提物具有抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的作用[48]，普洱熟茶中含有与EGCG相同减肥作用的成分[28,45]，以及一些多酚、没食子酸组分表现出比EGCG更好的抗氧化活性[49]。然而，这些组分均为混合物，其功能性成分尚不明确。因此，对普洱熟茶化学成分的进一步研究至关重要，只有明确其关键的活性成分，才能为普洱熟茶更好的开发和利用提供理论依据。
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