枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是自然界中存在较为丰富的一个类群,并适应了自然界的各种环境变化[1]。枯草芽孢杆菌已经形成了许多的适应环境的机制,如外源DNA的摄取、生物膜形成和芽孢形成[2-4]。因此,枯草芽孢杆菌可从许多场所和严酷的环境中分离得到[5-6]。有证据表明,枯草芽孢杆菌可活跃地生长在土壤、植物根系和各种有机体的胃肠道中。特别是对几种无脊椎动物和脊椎动物(包括人类)肠道中枯草芽孢杆菌研究表明,它可以作为动物自然生命周期的一部分在胃肠道定居[5,7-11]。
枯草芽孢杆菌中可以产生多种抗菌物质,具有较好的开发利用价值[12-14]。在枯草芽孢杆菌中产生的翻译后修饰的抗菌物质包括脂肽(lipopeptide)、糖肽(glycopeptide)和羊毛硫细菌素(lantibiotic)等[15-17]。其中枯草芽孢杆菌中可以合成多种羊毛硫细菌素(lantibiotics),羊毛硫细菌素也可称为含羊毛硫氨酸的抗生素(lanthionine-containing antibiotics)[18]。羊毛硫细菌素是在核糖体上合成,并在翻译后修饰的抗菌肽[19-21]。从枯草芽孢杆菌中已经发现多种羊毛硫细菌素,但这些羊毛硫细菌素均来源于不同的菌株。其中枯草菌素(subtilin)就来源于菌株Bacillus subtilis ATCC 6633,可形成4个甲基羊毛硫氨酸[22]。羊毛硫细菌素Ericin S和Ericin A产生菌均为B.subtilis A1/3菌株,但Ericin S的结构与枯草素的结构非常相似[23]。Entianin来自B.subtilis subsp. spizizenii DSM 15029T[24]。目前的研究中,已经采用更多的先进手段来进行羊毛硫细菌素的发掘[25]。
羊毛硫细菌素subtilomycin最初报道来源于B.subtilis strain MMA7,该菌株分离自海绵Haliclona simulans中[26],后在B.subtilis BSn5菌株中也发现有subtilomycin[27]。对B.subtilis strain MMA7中subtilomycin基因簇进行分析表明,其基因簇主要的subtilomycin合成基因包括subA(subtilomycin结构基因)、subB(羊毛硫氨酸脱水酶(lanthionine dehydratase)基因)、subC(羊毛硫氨酸合成酶(lanthionine synthetase)基因)和subP(丝氨酸蛋白酶(serine protease)基因);subT为ABC转运蛋白[26]。而通过对B.subtilis BSn5菌株中subtilomycin基因簇测序分析表明,其基因簇与B.subtilis strain MMA7中subtilomycin基因簇基本相同,但确定了一个穿膜蛋白(transmembrane protein)ApnI对subtilomycin功能是必须的[27]。我们在前期的研究中也分离到1株产subtilomycin的枯草芽孢杆菌菌株,并进行了相关的理化特性和分离纯化研究。
从江西省南昌市分离获得枯草芽孢杆菌SX3411菌株(B.subtilis SX3411),保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌种保藏号CGMCC NO.14396。其他指示菌株包括革兰氏阳性菌:猪链球菌(Streptococcus suis)、枯草芽孢杆菌(非本筛选菌株)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);革兰氏阴性菌:嗜水性单胞杆菌(Aeromonas hydrophila)、沙门氏杆菌(Salmonella enterica subsp.)和大肠杆菌(Escherichia coli.),均保存于本实验室。
革兰氏染色液试剂盒、芽孢染色液试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix,天根生化(北京)科技有限公司;E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit,OMEGA BIO-TEK;SDS-PAGE凝胶配制试剂盒,博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶、胃蛋白酶,上海蓝季生物有限公司;蛋白酶K,MERCK公司;其他生化试剂为生工生物工程股份有限公司产品,化学试剂为天津市永大化学试剂开发中心产品,均为分析纯。
LB培养基为基础培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物5.0, NaCl 5.0,pH 7.2, 加水定容1 L, 121 ℃灭菌20 min,固体培养基每1 L加15.0 g琼脂粉。
模拟胃消化液(stimulated gastric fluid, SGF):取稀HCl(HCl 234 mL,加水稀释至1 000 mL制得)16.4 ml, 加水约800 mL与胃蛋白酶10 g,摇匀后,加水稀释成1 000 mL[28]。
模拟肠消化液(stimulated intestinal fluid, SIF):取KH2PO4 6.8 g,加水500 mL使溶解,用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10 g,加水适量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1 000 mL[28]。
D-37520 Osterode型台式高速离心机,美国Thermo公司;PTC-200型PCR仪,美国MJ-Research公司;ZHWY-103B型、ZHWY-2102型恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;HT-1300-U超净工作台,苏净集团安泰公司;FE20型pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ALO-210.2型电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。
1.4.1 SX3411菌株的分离
从猪场污泥中得到的菌种样品,经过高温处理后,接种到LB固体培养基中,置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。观察菌落形态,挑取芽孢杆菌形态的单克隆菌落,进行后续鉴定。
1.4.2 滤纸片法测定抑菌活性
每个培养皿倾入20~30 mL LB固体培养基,凝固后,超净台上吹干冷凝水;涂布100 μL指示菌悬液, 37 ℃培养10 min。2层滤纸片(直径8 mm)轻轻黏在制备好的抑菌平板上,轻轻按压一下。取25 μL SX3411菌株的发酵液缓慢滴到滤纸片上,按照顺时针方向进行实验。加完样品后,放在4 ℃冰箱4 h以上使发酵液在琼脂糖平板上充分扩散,然后放置在37 ℃恒温培养箱培养12 h左右,定时查看抑菌圈出现的情况,做好记录和测量抑菌圈直径。新鲜LB液体培养基作为阴性对照。
1.4.3 菌体形态鉴定
将活化好的枯草芽孢杆菌SX3411划线接种至固体平板培养基中,37 ℃恒温培养24 h,按照试剂盒说明书进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。使用光学显微镜观察菌体细胞个体形态。
1.4.4 生理生化鉴定
SX3411菌株的生理生化鉴定参照《伯杰氏菌种鉴定手册》进行试验[29]。
1.4.5 16S rDNA序列鉴定
E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit试剂盒抽提SX3411菌株基因组DNA(方法见试剂盒说明书)。用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的上下游通用引物27F和1 492R(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)对枯草芽孢杆菌基因组DNA进行PCR扩增。
1.4.6 枯草芽孢杆菌菌株SX3411中subtilomycin基因簇的分子生物学鉴定
根据NCBI上给出的枯草芽孢杆菌B.subtilis strain MMA7中subtilomycin基因簇(GenBank序列号:JX912247.1)中的结构基因SubA、脱水酶基因SubB与环化酶基因SubC和丝氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列[26],使用Primer 5.0和Oligo 6.0软件分别设计SubA、SubB、SubC、SubP基因的引物(表1);引物送至南京金斯瑞生物科技有限责任公司合成。根据不同的鉴定DNA序列长短,进行相应的PCR扩增,PCR扩增后得到的DNA送南京金斯瑞生物科技公司测序。
1.4.7 菌株SX3411发酵产物的抗菌谱
分别取菌株SX3411在37 ℃培养了24 h的发酵液,10 000 r/min离心15 min,弃菌体取上清液,即得到抗菌物质粗提液。分别用指示菌悬液涂布平板,按滤纸片法测定抑菌活性,测定SX3411的发酵液对不同指示菌的抑菌活性。
表1 检测subtilomycin基因簇的PCR引物
Table 1 Primers used for PCR detection of subtilomycin cluster
扩增片段引物序列(5'端→3'端)片段长度/bpsubAS1ATGGAGAAGAATAATATTS2TTAGTTACAGTTACTGCA171subPPPTGACTACAAATATGAATAPDTAACAATCCTTTGATAAA975subBBPATGAATACAAAATATTTABD1GTTAGGGATTAAAACATT3 111subCCPATGCAGAAATGCAAGAATCD1ACTTATCAGAAATATCTT1 323subP-subBPPATGAATATGACTACTACAAATBD1GTTAGGGATTAAAACATT4 086subB-subCBPATGAATACAAAATATTTACD1ACTTATCAGAAATATCTT4 458subP-subB-subCPPTGACTACAAATATGAATACD1ACTTATCAGAAATATCTT5 433
1.4.8 菌株SX3411生长曲线与抑菌活性的关系
接种新鲜的SX3411菌株,37 ℃摇床200 r/min振荡培养,每隔2 h取1次发酵液在紫外分光光度计上测OD600值,记录结果。同时将所取的发酵液10 000 r/min 离心15 min,取上清液用于抑菌活性检测。以金黄色葡萄球菌为指示菌,滤纸片法检测各时间取样的抑菌效果。
1.4.9 菌株SX3411发酵所产抑菌物质热稳定性
取37 ℃发酵培养24 h的SX3411菌株发酵液,分别在40、60、80和100 ℃下水浴处理30 min和1 h,以未处理的发酵液为阳性对照,灭菌新鲜的LB液体培养基为阴性对照,以金黄色葡萄球菌为指示菌株,检测不同温度对SX3411菌株发酵液抑菌活性的影响。
1.4.10 菌株SX3411发酵所产抑菌物质酸碱稳定性
取37 ℃发酵培养24 h的SX3411菌株发酵液,分别用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至2、4、5、7、8、9、10和11,以不做处理的菌株发酵液作阳性对照,新鲜LB液体培养基为阴性对照,室温下处理1 h。以金黄色葡萄球菌为指示菌株,检测不同pH处理下发酵液的抑菌活性。
1.4.11 超滤法粗提subtilomycin及其抑菌活性
将枯草芽孢杆菌SX3411在37 ℃发酵培养24 h,其发酵液10 000 r/min离心15 min,弃菌体取上清液。取500 μL菌株SX3411发酵液于3 kDa超滤管中(美国Millipore公司产品),10 000 r/min离心10 min,收集管中的滤过液进行抑菌活性检测。超滤管内截留液继续加入50 mmo1/L PBS(pH 7.4)缓冲液,10 000 r/min 离心10 min,重复该步骤3次。随后将超滤得到截留液进行抑菌活性检测。同时采用15% SDS-PAGE电泳(凝胶配制见试剂盒说明书,电泳方法略)检测超滤得到的截留液。
1.4.12 硫酸铵沉淀初步纯化菌株SX3411发酵液中subtilomycin
将枯草芽孢杆菌SX3411在37 ℃发酵培养24 h的发酵液10 000 r/min离心20 min取上清液。其中加(NH4)2SO4分别至20%、30%、40%、50%、60%和70%饱和度,置4 ℃下过夜。高速冷冻离心机在10 000 r/min, 4 ℃下离心20 min。每40 mL发酵液所得沉淀用2 mL浓度为50 mmo1/L PBS(pH 7.4)缓冲液悬浮。以金黄色葡萄球菌为指示菌,检测不同饱和度(NH4)2SO4沉淀所得初步纯化subtilomycin的抑菌活性。
1.4.13 初步纯化subtilomycin的温度稳定性
用30%硫酸铵饱和度初步纯化的subtilomycin,分别在40、60、80和100 ℃下各处理30 min和1 h,以未处理的初步纯化subtilomycin作阳性对照,灭菌的PBS为阴性对照,以金黄色葡萄球菌为指示菌株,检测不同温度处理对subtilomycin抑菌活性的影响。
1.4.14 初步纯化subtilomycin对蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液的稳定性
初步纯化的subtilomycin分别用0.5 g/L蛋白酶K、模拟胃液、模拟肠液消化处理,分别处理15和30 min。 用模拟胃液和模拟肠液为阴性对照,以金黄色葡萄球菌为指示菌株,检测不同蛋白酶处理下初步纯化subtilomycin的抑菌活性。
从取得的样品中获得芽孢杆菌菌落形态特征的菌株,用滤纸片扩散法检测获得的发酵液,从中筛选得到具有明显抑菌圈的菌株。经筛选比较,挑选1株抑菌效果较好的菌株(图1),命名为SX3411菌株。
用活化好的SX3411菌种使用接种环划线接种于LB固体培养基,培养1~2 d后观察菌落形态呈现芽孢杆菌特征形态。菌体进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色,1 000×油镜下观察,菌株SX3411菌体革兰氏染色为阳性反应,菌体呈杆状(图2-A)。芽孢染色(图2-B)和荚膜染色(图2-C)均呈阳性。
图1 筛选菌株SX3411的抑菌效果
Fig.1 Bacteriostatic efficacy of screened strain SX3411
注:指示菌为金黄色葡萄球菌。
A-革兰氏染色;B-芽孢染色;C-荚膜染色
图2 菌株SX3411菌体形态
Fig.2 Morphology of strain SX3411
2.3.1 生理生化鉴定
菌株SX3411在5 ℃下基本不生长,20 ℃下生长较缓慢,30~50 ℃下菌株生长良好,50 ℃下生长8 h即可看到菌落产生,表明为耐高温生长菌株。不同酸碱度检测表明,该菌株在pH 6~9时菌株生长较好;最适生长pH值在6~9。在NaCl质量分数为2%~5%的培养基中生长较好;丙二酸利用实验结果显示阴性;柠檬酸盐利用实验呈阳性;接触酶实验表现阳性;蔗糖发酵实验可产酸,呈阳性;葡萄糖氧化发酵实验表明菌株SX3411发酵产酸但不产气;淀粉水解实验呈阳性;MR反应呈阴性;V-P反应阳性;SX3411菌株穿刺接种,可导致明胶液化;菌株SX3411不能利用乙醇,乙醇氧化呈阴性;菌株可以利用乙酸产生碳酸,在平板中生成CaCO3,乙酸氧化呈阳性。根据《伯杰氏菌株鉴定手册》可以初步确定菌株SX3411为枯草芽孢杆菌[29]。
2.3.2 菌株SX3411的16S rDNA序列鉴定
提取菌株SX3411基因组DNA,以细菌特异的16S rDNA引物进行PCR扩增,可得到大小为1 500 bp左右DNA(图3-A),测序后得到GenBank序列号为KY848340.1。通过NCBI数据库中已知菌株的16S rDNA序列进行比对分析,构建系统发育进化树(图3-B),菌株SX3411与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)具有较高的同源性,达到99%,可以确定菌株SX3411为枯草芽孢杆菌。
A-PCR扩增;B-系统发育进化树
图3 菌株SX3411 16S rDNA的PCR扩增和
系统发育进化树
Fig.3 PCR analysis and phylogenetic tree of strain SX3411 16S rDNA
根据subtilomycin基因簇(GenBank序列号JX912247.1)的相关基因序列设计引物,分别以枯草芽孢杆菌SX3411中的基因组DNA为模版进行PCR扩增。结果获得了subA(图4-A)、subB(图4-B)、subC(图4-C)、subP(图4-C)、subP-subB(图4-D)、subP-subB-subC(图4-E)和subB-subC(图4-E)的PCR扩增产物。扩增产物分别送DNA测序公司测序,测序结果在NCBI上进行比对,其序列与subtilomycin基因簇序列完全相同[26]。由此表明,在枯草芽孢杆菌SX3411中存在可以合成subtilomycin的基因簇。
A-subA基因的PCR扩增;B-subB基因的
PCR扩增;C-subC和subP基因的PCR扩增;D-subP-subB基因的PCR扩增;E-subP-subB-subC和subB-subC基因的PCR扩增
图4 Subtilomycin基因簇相关基因的PCR扩增
Fig.4 PCR amplification of subtilomycin cluster related genes
SX3411菌株的发酵液对革兰氏阳性菌具有强抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌和猪链球菌的抑菌效果最明显,对枯草芽孢杆菌(非筛选菌株)也具有抑菌作用,但对于SX3411菌株本身不具有抑菌效果,这可能跟SX3411菌株本身会产生免疫蛋白有关。在检测的革兰氏阴性细菌中,只对嗜水气单胞杆菌有抑菌活性,对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌活性(表2)。
表2 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液对供试菌种的抑制作用
Table 2 Antimicrobial spectrum of bacteriostatic substances produced byB.subtilis SX3411
菌种类型供试菌种 抑菌圈直径/mm抑菌圈清晰度革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(B. subtilis)13.5±0.2++金黄色葡萄球菌(S. aureus)16.0±0.3+++猪链球菌(S. suis)16.5±0.3+++革兰氏阴性菌嗜水气单胞杆菌(A. hydrophi-la)14.5±0.2++沙门氏杆菌(S. enterica subsp)--大肠杆菌(E. coli)--
注:“+++”,抑菌圈完全透明;“++”,抑菌圈清晰;“+”,抑菌圈可见;“-”,无抑菌圈。
将培养好枯草芽孢杆菌SX3411的种子液(OD600约为1),按2%的接种量接种至发酵培养基,每隔2 h测定菌液OD600值,以未接种的发酵培养基为空白对照,检测SX3411菌株的生长情况(图5-A)。结果表明,0~2 h为生长停滞期,菌体数量较少,2~20 h为对数期,菌体生长迅速,呈指数增长,20~34 h为稳定期,菌体数量比较稳定,34 h后为衰退期,菌体因为营养条件和代谢物的影响,活性开始衰减(图5-A)。根据菌株的生长曲线可以掌握枯草芽孢杆菌SX3411的生长代谢规律,从而调控其生长条件,为后续的实验奠定基础。
枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液具有抑菌作用,发酵产物分为初级代谢产物和次级代谢产物,发酵时间对枯草芽孢杆菌SX3411抑菌物质的分泌具有关联(图5-B)。抑菌物质随着菌株的生长而分泌,并随着发酵时间而慢慢积累,到8 h达到一定的抑菌效果,在20~38 h抑菌活性比较稳定,40 h后其抗菌活性出现了下降(图5-B)。可以推测枯草芽孢杆菌SX3411所产的抑菌物质,尤其是subtilomycin尽管是翻译后的修饰,但也是枯草芽孢杆菌SX3411的初级代谢产物,抑菌物质的产生与其生长相关。
A-生长曲线;B-抑菌活性
图5 枯草芽孢杆菌SX3411生长曲线及其
抑菌物质抑菌活性随时间的变化
Fig.5 Growth curve ofB.subtilis SX3411 and changes of antimicrobial activity of its antimicrobial substances with time
菌株SX3411发酵液的抑菌活性随着温度的升高而降低,且在100 ℃时,发酵液失去抑菌活性;发酵液在40~60 ℃处理下对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在12~15 mm,与未处理的原始发酵液相差不大,此期间的发酵液抑菌活性相对稳定;发酵液在80 ℃处理下,仍然具有抑菌活性(图6)。由此可知,SX3411菌株发酵液中抑菌物质具有较好的热稳定性。这与确认的发酵液中主要的抑菌物质为羊毛硫细菌素subtilomycin有关,因subtilomycin是热稳定的环肽类物质。
图6 枯草芽孢杆菌SX3411发酵产物中抑菌物质的热稳定性
Fig.6 Thermal stability of bacteriostatic substances in fermentation products ofB.subtilis SX3411
菌株SX3411发酵液抑菌活性成分在pH 5~9比较稳定,发酵液在pH 5~9处理后对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在12.0~13.0 mm,与未处理的发酵液相差不大;且此菌株发酵液在pH值为2和11处理下,对金黄色葡萄球菌仍有抑制作用,而pH值为12时,活性降低或失去抑菌活性(图7)。由此可见,SX3411菌株发酵液的抑菌活性在中性及弱碱性条件下较稳定,对酸的耐受性高于对强碱的耐受性。
图7 枯草芽孢杆菌SX3411发酵产物中抑菌物质的酸碱稳定性
Fig.7 pH stability of bacteriostatic substances in fermentation products ofB.subtilis SX3411
与发酵液相比较(图8-Aa),使用3 kDa超滤管进行超滤后,截留液保存了较好的抑菌活性,可以看到明显的抑菌圈(图8-Ab),而滤过液基本没有抑菌活性,无抑菌圈产生(图8-Ac)。由此表明,枯草芽孢杆菌SX3411发酵液的抑菌活性主要体现在多肽类物质上,小分子物质基本没有抑菌活性。截留液经过SDS-PAGE电泳以后,可以看到在4 kDa左右有条带(图8-B2),初步认为是subtilomycin。发酵液原液(图8-B1)和滤过液(图8-B3)经过SDS-PAGE电泳未见明显条带。综合分析,在枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液中,抗菌物质主要是subtilomycin。因此,在后续研究中可以以抑菌能力的大小来判断枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液中产subtilomycin的量。
A-抑菌活性;B-SDS-PAGE分析
图8 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液超滤后的抑菌活性和SDS-PAGE分析
Fig.8 Antimicrobial activity and SDS-PAGE analysis ofB.subtilis SX3411 fermentation liquor after ultrafiltration
注:Aa为发酵液原液的抑菌活性,Ab为截留液的抑菌活性,Ac为滤过液的抑菌活性。
枯草芽孢杆菌SX3411经过(NH4)2SO4沉淀后,其中20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀物有较好的抑菌效果,以30%的沉淀物抑菌效果最好,而50%、60%和70%的硫酸铵沉淀物抑菌效果不好(图9-A和9-B)。这样的结果与所报道的20%(NH4)2SO4沉淀得到subtilomycin接近一致[16]。
对这6个浓度的(NH4)2SO4沉淀物进行SDS-PAGE分析(图10),结果表明,在20%、30%和40%的硫酸铵沉淀中,可以见到4 kDa左右的电泳带,其中以30%的量最多且杂质较少(图10-A)。而在50%、60%和70%的(NH4)2SO4沉淀中可以见到较多的杂电泳带。将20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀进一步超滤以后再进行电泳,结果30%和20%的沉淀物电泳以后仍可见到较好的4 kDa电泳带,且含杂质也较少。由于subtilomycin是由硫醚键形成带有4个环的环肽,且含碱性氨基酸比例较高,为阳离子肽[16],因此电泳条带并不像普通蛋白质电泳带那样规整。
A-抑菌圈直径;B-抑菌效果
图9 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液
(NH4)2SO4沉淀物的抑菌效果
Fig.9 Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitates fromB.subtilis SX3411 fermentation broth
注:指示菌为金黄色葡萄球菌。
A-硫酸铵沉淀;B-超滤后SDS-PAGE图
图10 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液硫酸铵沉淀及其超滤后的SDS-PAGE分析
Fig.10 SDS-PAGE analysis of ammonium sulfate precipitation and retaining solution of ultrafiltration after ammonium sulfate precipitation forB.subtilis SX3411 fermentation broth
将30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin 分别在不同温度下处理不同时间,以未处理的30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin作阳性对照,灭菌的PBS溶液作阴性对照,检测抑菌效果的变化(图11)。结果表明,与未处理初步纯化的subtilomycin相比,初步纯化的subtilomycin在40~ 80 ℃处理后抑菌活性改变不大;100 ℃处理30 min, 活性下降较少,处理1 h后,抑菌活性才有一定下降,说明枯草芽孢杆菌SX3411分泌的subtilomycin具有较好的温度耐受性(图11)。
图11 枯草芽孢杆菌SX3411粗提subtilomycin的温度稳定性
Fig.11 Temperature stability of subtilomycin extracted fromB.subtilis SX3411
以未处理的30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin为阳性对照,蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液为阴性对照,将30%硫酸铵沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin样品用蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液分别处理15及30 min,对其检测抑菌活性的变化。实验结果表明,蛋白酶K、模拟肠液处理后的初步纯化的subtilomycin失去抑菌活性;模拟胃液处理15和30 min后的初步纯化的subtilomycin仍然具有抑菌活性,与未处理的初步纯化的subtilomycin相比变化不大(图12)。
图12 枯草芽孢杆菌SX3411的 subtilomycin对蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液的稳定性
Fig.12 Stability of subtilomycin fromB.subtilis SX3411 to protease K, simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid
注:0-未处理的subtilomycin,1-模拟胃液,2-模拟胃液处理subtilomycin 15 min,3-模拟胃液处理subtilomycin 30 min,4-模拟肠液,5-模拟肠液处理subtilomycin 15 min,6-模拟肠液处理subtilomycin 30 min,7-蛋白酶K,8-蛋白酶K处理subtilomycin 15 min,9-蛋白酶K处理subtilomycin 30 min。
从江西省南昌市分离获得了1株细菌SX3411,经过形态鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定,确定该菌株为枯草芽孢杆菌。根据NCBI中羊毛硫细菌素subtilomycin的基因簇序列(GenBank序列号:JX912247.1)中的结构基因SubA、脱水酶基因SubB与环化酶基因SubC和丝氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列,设计引物对枯草芽孢杆菌SX3411中合成subtilomycin的结构基因和修饰酶基因进行了PCR的扩增和测序分析,结果证明了枯草芽孢杆菌中存在subtilomycin的基因簇,表明该菌株可以合成羊毛硫细菌素subtilomycin。
对枯草芽孢杆菌SX3411发酵液中的抑菌物质进行了生理生化和生物活性方面的研究。枯草芽孢杆菌SX3411发酵液对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草芽孢杆菌具有明显抑菌作用,而对革兰氏阴性菌的抑菌作用相对较弱,检测菌种中对嗜水气单胞杆菌有一定抑菌效果,对其他菌无效果。研究表明,枯草芽孢杆菌SX3411发酵液产抑菌物质与其菌体生长有密切关系,且该类抑菌活性物质具有很好的耐高温和耐酸碱的能力,其中在80 ℃处理仍保持有较好的抑菌活性,在pH 2~11有抑菌活性,在pH 5~9抑菌活性比较稳定。
采用超滤和硫酸铵沉淀的方法对枯草芽孢杆菌SX3411中的subtilomycin进行了初步纯化。在用3 kDa超滤管超滤时,经过SDS-PAGE电泳可以见到数量较多的4 kDa左右的subtilomycin存在。采用硫酸铵分步沉淀的方法,20%、30%和40%饱和度的硫酸铵沉淀可以将subtilomycin沉淀下来,其中以30%硫酸铵沉淀效果较好,获得的subtilomycin也比较纯。30%硫酸铵沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin有非常好的抵抗高温的作用,对模拟胃液有较好的抵抗作用,但对蛋白酶K和模拟肠液的抵抗能力较弱。这些结果表明,羊毛硫细菌素subtilomycin比较适合工业化生产,且可以用于调节胃部的有害菌群。枯草芽孢杆菌SX3411也可以做为益生菌进行开发利用。
[1] ZHANG Nan, YANG Dongqing, KENDALL J R A, et al. Comparative genomic analysis ofBacillus amyloliquefaciens andBacillus subtilis reveals evolutional traits for adaptation to plant-associated habitats[J]. Frontiers in Microbiology, 2016, 7:2 039.
[2] VLAMAKIS H, CHAI Y, BEAUREGARD P, et al. Sticking together: Building a biofilm theBacillus subtilis way[J]. Nat Rev Microbiol,2013,11(3):157-168.
[3] RAO C V, GLEKAS G D, ORDAL G W. The three adaptation systems ofBacillus subtilis chemotaxis[J]. Trends Microbiol, 2008,16(10):480-487.
[4] CAIRNS L S, HOBLEY L, STANLEY-WALL N R. Biofilm formation byBacillus subtilis: New insights into regulatory strategies and assembly mechanisms[J]. Molecular Microbiology, 2014, 93(4):587-598.
[5] HONG H A, TO E, FAKHRY S, et al. Defining the natural habitat ofBacillus spore-formers[J]. Res Microbiol, 2009, 160(6):375-379.
[6] EARL A M, LOSICK R, KOLTER R. Ecology and genomics ofBacillus subtilis[J]. Trends Microbiol,2008, 16(6):269-275.
[7] CHEN Y, CAO S, CHAI Y, et al. ABacillus subtilis sensor kinase involved in triggering biofilm formation onthe roots of tomato plants[J]. Mol Microbiol,2012, 85(3):418-430.
[8] CHEN Y, YAN F, CHAI Y, et al. Biocontrol of tomato wilt disease byBacillus subtilis isolates from naturalenvironments depends on conserved genes mediating biofilm formation[J]. Environ Microbiol,2013, 15(3):848-864.
[9] BARBOSA T M, SERRA C R, LA-RAGIONE R M, et al. Screening forBacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract[J]. Appl Environ Microbiol,2005, 71(2):968-978.
[10] HUYNH H, KHANEJA R, BARNES I, et al.Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract[J]. Res Microbiol, 2009, 160(2):134-143.
[11] FACUNDO A, CARLOS B, SEBASTIAN C, et al. Microbial flora, probiotics,Bacillus subtilis and the search for a long and healthy human longevity[J]. Microbial Cell, 2017, 4(4):133-136.
[12] 赵朋超,王建华,权春善,等. 枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2010,30(10):108-113.
[13] SUMI C D, YANG B W, YEO I C, et al. Antimicrobial peptides of the genusBacillus: A new era for antibiotics[J]. Can J Microbiol, 2015, 61(2):93-103.
[14] 白杰, 贠建民,祝发明,等. 枯草芽孢杆菌菌株B-3抗菌肽的分离纯化与鉴定[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(8):82-89.
[15] TAREQ F S, LEE M A, LEE H S, et al. Gageotetrins A-C, noncytotoxic antimicrobial linear lipopeptides from a marine bacteriumBacillus subtilis[J]. Org Lett, 2014,16(3):928-931.
[16] GONZALO C V G D, ZHU L, OMAN T J, et al. NMR structure of the S-linked glycopeptide sublancin 168[J]. ACS Chemical Biology, 2014, 9(3):796-801.
[17] ZHAO X, KUIPERS O P. Identification and classification of known and putative antimicrobial compounds produced by a wide variety of Bacillales species[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1):882.
[18] SZEKAT C, JACK R W, SKUTLAREK D, et al. Construction of an expression system for site-directed mutagenesis of the lantibiotic mersacidin[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(7):3 777-3 783.
[19] SCHNELL N, ENTIAN K D, SCHNEIDER U, et al. Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulphide-rings[J]. Nature, 1988, 333(6 170):276-278.
[20] AMISON P G, BIBB M J, BIERBAUM G, et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: Overview and recommendations for a universal nomenclature[J]. Natural Product Reports, 2013, 30:108-160.
[21] MATHUR H, FIELD D, REA M C, et al. Fighting biofilms with lantibiotics and other groups of bacteriocins[J]. NPJ Biofilms and Microbiomes, 2018, 4(1):9.
[22] LIU W, HANSEN J N. The antimicrobial effect of a structural variant of subtilin against outgrowingBacillus cereus T spores and vegetative cells occurs by different mechanisms[J]. Appl Environ Microbiol,1993, 59(2):648-651.
[23] STEIN T, BORCHERT S, CONRAD B, et al. Two different lantibiotic-like peptides originate from the ericin gene cluster ofBacillus subtilis A1/3[J]. J Bacteriol, 2002,184(6):1 703-1 711.
[24] FUCHS S W, JASKOLLA T W, BOCHMANN S, et al. Entianin, a novel subtilin-like lantibiotic fromBacillus subtilis subsp. spizizenii DSM 15029T with high antimicrobial activity[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(5):1 698-1 707.
[25] SANDIFORD S K. Genome database mining for the discovery of novel lantibiotics[J]. Expert Opinion on Drug Discovery, 2017, 12(5):489-495.
[26] PHELAN R W, BARRET M, COTTER P D, et al. Subtilomycin: A new lantibiotic fromBacillus subtilis strain MMA7 isolated from the marine spongeHaliclona simulans[J]. Mar Drugs, 2013, 11(6): 1 878-1 898.
[27] DENG Y, LI C Z, ZHU Y G, et al. ApnI, a transmembrane protein responsible for subtilomycin immunity, unveils a novel model for lantibiotic immunity[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(20): 6 303-6 315.
[28] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:二部[M]. 北京:北京工业出版社, 2005: 771-792.
[29] R.E.布坎南,N.E.吉本斯,著. 中国科学院微生物所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组,译.(第八版)[M]. 北京:科学出版社, 1984: 362-366.