稻米是东亚地区人们的重要主食之一，淀粉在其中比例通常为60%～80%。淀粉是由支链淀粉与直链淀粉构成的具有半结晶特性的天然聚合物，在食品领域有着不可替代的地位。淀粉的回生(重结晶)是其独特的基本性质，也是影响淀粉基食品的营养价值、感官特性、消费者满意度和货架期等的关键因素。一方面，淀粉回生会造成米面制品的老化，可食用品质下降，使其货架期缩短，造成巨大浪费。另一方面，回生作用在制备慢消化营养功能淀粉，食品增稠剂和稳定剂等方面有着重要作用[1-2]。
回生与复合脂类均是制备慢消化淀粉和抗性淀粉等功能营养淀粉的重要技术手段。通常，慢消化淀粉和抗性淀粉多是将脂类和淀粉通过回生手段进行制备得到[3]。脂类作为一种常见的淀粉回生抑制剂，相关研究多侧重探究一种或多种脂质对淀粉回生的效用[4-5]。目前，研究普遍认为脂类的疏水基团进入直链淀粉的螺旋空腔，与直链淀粉分子形成复合物，延缓了直链淀粉主导的短期回生，导致支链淀粉重结晶的晶种源浓度降低，进而抑制淀粉的重结晶过程[6]。尽管如此，有关直链淀粉与脂类形成V-型复合物后，作为晶种影响淀粉分子链排列、晶体生长的共性机制尚未明晰。本文通过将硬脂酸与酸解大米淀粉复合构建V-型晶种，将其分散在糊化淀粉乳中以参与回生，通过XRD、DSC表征晶种以及其对淀粉回生过程的影响，以期揭示V-型晶种影响淀粉回生成核模式和晶体生长的共性机制，为脂类在慢消化类、抗消化类营养功能淀粉开发方面的应用提供理论支撑。
大米淀粉，江西金农发展有限公司；硬脂酸，分析纯，上海国药集团。
D8-Advance型X射线衍射仪，德国Bruker公司产品；X-DSC7000型差示扫描量热仪，日本Seiko公司产品。
1.3.1 制备V-型晶种
取73.50 g大米淀粉均匀分散在500 mL 3.16 mol/L H2SO4溶液中，在40 ℃下搅拌水解6 d。将水解产物用去离子水反复离心至pH不变，均质后取部分产物在105 ℃下烘干、称重3次、计算浓度，并将剩余产物配成浓度为50 g/L的水解物悬液。取100 mL上述水解物悬液在100 ℃糊化20 min后，逐滴加入溶有0.25 g硬脂酸的10 mL乙醇溶液，继续糊化10 min， 并在50 ℃下保温2 d，所得反应产物即V-型晶种。将晶种用体积分数为50%(体积分数)的乙醇水溶液离心清洗3次后，取部分晶种悬液在105 ℃下烘干、称重3次、计算浓度，并将剩余晶种配成为50 g/L(质量分数)的晶种悬液。
1.3.2 回生淀粉的制备
分别称取大米淀粉20 g(干基)配成50 g/L(质量分数)的淀粉乳，沸水浴糊化30 min，在40 ℃水浴下搅拌降温到45 ℃，分别加入20 mL去离子水和为50 g/L(质量分数)晶种悬液，45 ℃保温搅拌10 min后，4 ℃下分别回生0、0.5、1、3、5、7、14、21和28 d后，40 ℃热风干燥，研磨，过100目筛，备用。
1.3.3 DSC测定回生淀粉的热特性
分别称取3.0 mg回生不同天数的淀粉样品到坩埚中，以1∶2(g∶mL)加入去离子水，密封，25 ℃平衡12 h。对样品进行热流测定，以空坩埚为参比，以氮气为载气，流量20 mL/min，以10 ℃/min的速度从25 ℃加热到100 ℃。计算淀粉晶体熔化热流变化并计算焓值(ΔH)。
1.3.4 XRD测定晶种及回生淀粉晶体结构
分别称取5 g不同组的回生21 d淀粉均匀分散在34 mL、3.16 mol/L H2SO4溶液中，40 ℃下水浴搅拌1 d，将水解产物用去离子水反复离心至pH不变，40 ℃ 下烘干至恒重，研磨过100目筛，所得样品为酸水解回生淀粉，以形成尖锐衍射峰便于后续拟合操作。称取2 g空白组回生21 d淀粉与0.2 g在40 ℃下干燥的晶种混合后，所得样品作为对照组以排除添加的晶种对回生淀粉相对结晶率的影响。将以上所制样品采用D8-Advance广角X射线衍射仪对晶种样品进行XRD测定，选用铜靶(λ=0.154 06 nm)，功率1 600 W(40 kV×30 mA)，采用NaI晶体闪烁计数器测量，扫描3～40°，扫描速度为3°/min。淀粉相对结晶度，晶粒尺寸和晶胞参数等均使用MDI Jade 6.0软件计算，其中晶格参数基于布拉格方程和面间距公式，通过软件自动拟合出对称型、钟罩形函数(高斯函数、柯西函数)计算得到[7]。
当X-射线入射到淀粉晶体时，由于晶体内部存在原子有规则排列组成的晶胞，这些原子衍射的X-射 线相互干涉叠加，影响了X-射线的衍射行为，形成不同的衍射图谱。并且衍射角度和强度与原子在晶胞内部的规律排列息息相关。从图1的结果来看，大米原淀粉样品在15.0、17.1、18.2和23.1°有强衍射峰(图1中的a)，属于典型的A-型淀粉衍射峰。考虑到淀粉脂质复合物在强酸环境下的不稳定性及为得到粒径较小的晶种，本实验采用先将淀粉水解成较小颗粒再与硬脂酸复合的方法制备V-型晶种。淀粉经酸解后，原有的A-型淀粉衍射峰位置没有改变，部分衍射峰强度增强，相对结晶度提高(图1中的b)，这说明酸解没有改变晶型，而相对结晶度的增加则主要是与对淀粉无定形区的优先水解有关。由图1中的c可以看出由酸解淀粉和硬脂酸复合得到的晶种为V-型晶体，其主要衍射峰出现在7.5、12.8和19.8°，其中19.8°是淀粉脂类特征衍射峰。此外，制备晶种时所采用的原料为酸解淀粉，因此制备得到的晶种相对结晶率较高。
a-大米原淀粉；b-淀粉水解物；c-V-型晶种
图1 X-射线衍射图谱
Fig.1 X-ray diffraction patterns
大米淀粉晶体随处理方式的不同具有不同的晶型，如天然大米淀粉晶体是A-型晶体，回生大米淀粉是B-型晶体，直链淀粉与脂肪酸、乳化剂、丁醇以及碘等物质复合可以得到V-型晶体。表1中2个样品的拟合指数较小，表明拟合程序较适用于这2个样品。
从晶胞参数来看，淀粉与晶种各轴间夹角均为90°；大米淀粉晶体的a、b晶轴相对V-型晶种较长，但c轴相对较短；晶种的a、b晶轴长相差较大，但淀粉晶胞的a、b晶轴长较接近；晶种的晶胞更偏细长，且体积更小。根据晶体具有的特征对称性，大米淀粉属于单斜晶系，V-型淀粉晶体属于正交晶系。晶系的分类必须按晶体对称性进行分类，而不能简单按晶胞三轴长和轴间夹角来划分，根据IMBERTY等的研究结果[8]，虽然A-型淀粉是单斜晶系，XRD粉末衍射却会得到类正交晶系的结果，与本实验结果一致。
在储藏过程中，糊化的淀粉分子由高能态向低能态转变，相邻的无规则线团状淀粉分子链进行规则排列，形成淀粉重结晶。淀粉回生焓值变化主要与回生淀粉晶体熔融所吸收的热量紧密相关，并且主要与支链淀粉在回生过程中形成的淀粉晶体有关。不同天数回生大米淀粉焓变的代表性曲线如图2所示，随着回生时间的延长，淀粉晶体熔融产生的热流峰逐渐增大，表明回生淀粉中的淀粉晶体含量逐渐增加。与空白组回生淀粉焓变曲线相比，添加晶种后在较高温区出现明显吸热峰，这与添加晶种中的晶体熔融有关。支链淀粉分子重排形成的晶体熔融出峰在45～60 ℃， 晶种晶体熔融出峰在60～65 ℃，两者温度范围较为接近，使两处熔融峰峰形发生改变。因此添加晶种后回生淀粉的焓变值取晶种焓变值与回生淀粉焓变值之和(表2)。
表1 酸解大米淀粉和V-型晶种的晶体结构参数
Table 1 Crystal structure parameters of hydrolyzed rice starch and V-type seed crystal
样品晶胞参数a/Åb/Å倗c/Åα/°β/°γ/°晶胞体积/nm3晶粒尺寸/Å晶系拟合指数大米原淀粉----------酸解淀粉13.6613.8223.709090904.4787单斜17.39%V-型晶种6.0811.1239.359090902.6671正交16.62%
注：大米原淀粉无定型区比例较高导致晶胞结构参数拟合困难。
在聚合物结晶研究中，Avrami模型常用来描述结晶过程的动力学特征。经过研究验证，当回生淀粉回生度随回生时间的增长而增长时，Avrami模型同样可以用来描述淀粉的等温回生动力学特征[9]。Avrami模型可以表达为式(1)：
(1)
式中：ΔH∞为淀粉的极限回生焓变值，此处取28 d时的回生焓变值；ΔHt是储藏t天的回生焓变值，具体焓变值(ΔHt)如表2所示。
图2 不同回生时间大米淀粉(a)和添加V-型晶种
大米淀粉(b)的焓变曲线
Fig.2 Thermal curves of retrograded rice starches
(a) and retrograded rice starches added with V-type seed (b) stored for different days
表2 V-型晶种干预大米淀粉的回生焓变与重结晶动力学参数
Table 2 Effects of V-type seed crystal on retrogradation enthalpy change and recrystallization kinetic parameters of rice starch
组别回生淀粉焓变值/(J·g-1)Avrami动力学参数0 d0.5 d1 d3 d5 d7 d14 d21 d28 dk/d-1nR2对照组0.05±0.010.12±0.020.21±0.010.26±0.020.30±0.010.33±0.020.45±0.030.54±0.020.61±0.030.210.720.964 3添加晶种0.30±0.040.38±0.020.45±0.030.52±0.010.59±0.030.65±0.020.72±0.030.79±0.040.86±0.020.270.680.986 4
在Avrami模型参数中，淀粉重结晶结晶速率常数k同晶核密度及晶体成核机制有关，k值越大表明重结晶速率越大。从k值的差异可以看出，添加V-型 晶种显著促进了淀粉分子链的重排，提高了淀粉晶体生长的速率。n值是Avrami指数，其取值与淀粉重结晶晶体成核方式有关。各试验组的n值均小于1，说明重结晶晶体成核方式均以瞬间成核为主。添加V-型晶种试验组的n值减小，说明部分添加的晶种可能起到了晶核的作用，使成核模式发生改变。可能是V-型晶种的表面自由能更低，更容易诱导淀粉分子链段规则排列，加快了淀粉分子链段规则排列速率，形成晶体。在BULKIN等[10]研究结果表明，将淀粉回生重结晶划分为4个阶段：(Ⅰ)单纯淀粉链构象变化；(II)晶核诱导形成阶段；(Ⅲ)晶体增长过程；(Ⅳ)完美晶体形成阶段。加入V-型晶种后显著促进了晶体的生长，即晶种使得淀粉回生过程的第Ⅰ步和第II步快速完成。
淀粉在回生过程中，晶体含量逐渐增加，晶体结构逐渐完善。而晶体衍射峰的强度和宽度取决于其含量与结构，回生程度越高，晶体含量越高，结构越完善，其衍射峰越高窄。图3显示，回生淀粉晶体的主要衍射峰出在12.8、17.1和19.7°左右(图3中的a)，属于典型的B-型晶体特征衍射峰。添加V-型晶种后，除了在17.1°的衍射峰消失之外，其余衍射峰峰形都更加明显(图3中的b)，表明其晶型并未发生改变，而在17.1°的衍射峰的消失说明V-型晶种影响了回生淀粉晶体分子链段的排列，使其晶体结构发生改变。此外，添加晶种后，回生淀粉的相对结晶率上升，且比回生结束后添加晶种相对结晶率更高，峰形也更加明显(图3中的c)，这说明外加晶种促进了淀粉的重结晶过程，这与上述DSC的结果一致。酸解回生淀粉后，其强衍射峰可以与酸解前回生淀粉衍射峰良好对应(图3中的d)，说明酸水解作用对淀粉晶体结构影响较小。添加V-型晶种后，17.1°的衍射峰消失，其他衍射峰峰形更加尖锐，位置略微左移(图3中的e)，结合DSC中n值的降低，说明晶种在淀粉回生过程中起到了晶核的作用，一定程度上改变了结晶分子链段的排列，并使得晶胞堆砌更加紧密，结晶更加完善。与回生淀粉自发形成的晶核相比，V-型晶种属于不同的晶系，晶体结构差异大，晶种生长面上的诱导作用不同，导致诱导形成晶体的结构发生改变，与自发状态下形成的晶体结构不同。
a-回生大米淀粉; b-晶种诱导的回生大米淀粉; c-回生大米淀粉-干燥晶种物理混合物; d-酸解回
生大米淀粉; e-酸解的晶种诱导回生大米淀粉
图3 回生21天大米淀粉的X-射线衍射图谱
Fig.3 X-ray diffraction patterns of 21 days-retrograded rice starches
表3 回生大米淀粉和V-型晶种诱导回生大米淀粉的晶体结构参数
Table 3 Crystal structure parameters of native rice starch and V-type seed crystal
组别晶胞参数a/Åb/Åc/Åα/°β/°γ/°晶胞体积/nm3晶粒尺寸/Å晶系拟合指数对照组12.1312.1312.9690901201.6542六方15.41%添加晶种4.4810.4824.369090901.1446正交13.13%
晶体的结构具有独特的周期性与对称性，因此可以利用点阵和结构基元来描述晶体结构。回生淀粉晶体的结构单元都是淀粉双螺旋分子链段，因此，一定程度上晶体结构的改变可以用点阵参数的变化来体现。与未添加晶种的回生淀粉晶体相比，添加V-型晶种后，淀粉晶体的a、b晶轴变短，c轴增长，晶胞体积减小，晶粒增大，淀粉晶体晶系转变为正交。这表明晶种的添加使得所形成的晶胞更趋于晶种的晶胞形态，淀粉分子链排列得更加紧密，晶体颗粒尺寸增加。已知淀粉-脂类复合物的抗酶解能力高于原淀粉，这可能与上述的晶体结构变化有关。而这些变化可能与晶种干预晶体生长的机制有关。在淀粉分子链段热运动被抑制形成晶核后，分子链陆续向晶核扩散并进行有规排列使晶粒逐步生长。无规线团状分子链不能直接有规排列，相互缠结的分子链进入晶区前需要先解缠结(或局部解缠结)，克服黏性进行运动，才能有规排列。很多情况下，分子链往往来不及充分打开缠结，只是对邻近的该分子链或其他分子链的链段进行必要的简单调整就进行折叠排列，进入晶格，使晶体生长[11]。因此，晶核生长面的分子链段排列会影响向其靠近的分子链段的有规排列，从而影响最终生成的晶体结构。V-型晶种晶胞的a、b晶轴较短，c轴较长的分子链段排列诱导了晶体结构的改变，使诱导形成的淀粉晶体晶胞a、b晶轴变短，c轴变长。
通过复合硬脂酸与酸解大米淀粉构建出V-型晶种，晶种的正交晶胞具有c轴明显长于a、b晶轴的特点。添加的晶种能在淀粉体系中起到晶核的作用，使得4 ℃下体系的主要成核模式改变，加快淀粉重结晶进程。V-型晶种生长面上的分子链段排列会诱导向其靠近分子链段的排列，从而使诱导形成的淀粉晶胞更趋于V-型晶种晶胞，导致淀粉分子链的排列更加紧密，晶体生长更快，形成的晶粒尺寸上升。本研究提出了脂类影响淀粉重结晶以及淀粉-脂类复合物的抗酶解机制，为拓展脂类在慢消化淀粉和抗性淀粉等功能营养淀粉创制方面的应用提供了重要科学依据。
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