荔枝草是一种来自民间的传统小型中草药，属于唇形科植物[1]。广泛分布于亚洲和大洋洲，尤其是在中国和印度的湿地中[2]。药理学研究表明，荔枝草具有抗炎活性、抗病毒、保肝等活性作用，其粉末具有很强的抗氧化活性[3-6]，这和荔枝草中含有的茶多酚、氨基酸、茶色素、茶多糖有密切的关系。荔枝草一直以来被用于治疗咳嗽、肝炎和腹泻等炎症疾病[7]，从荔枝草中可以分离出很多天然产品，包括黄酮类、木脂素类、二萜类化合物、倍半萜类化合物等,它们都具有广泛的生物活性[8]。
冠突散囊菌是茯砖茶生产过程中产生的优势菌种，具有降脂、抗氧化和抗肿瘤等生理活性[9-10]。在发酵过程中产生多种酶类，可以分解利用茶叶中的大分子物质，使活性成分发生复杂的变化，通过“发花”这道独特的工序改善茯砖茶原有品质[11-12]。茶叶香气作为评价茶叶好坏的一个重要指标，直接影响着茶叶的品质以及消费者的认可程度，在发酵过程中，冠突散囊菌产生特有的香气物质，能有效地改善荔枝草发酵茶的感官品质[13]，研究中使用电子鼻和电子舌进行发酵前后荔枝草发酵茶的风味变化差异分析。本实验采用冠突散囊菌固态发酵荔枝草的方法，对荔枝草发酵过程中主要活性成分及风味的变化进行研究，为进一步探讨荔枝草茶品质形成机理并改善其品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
荔枝草原叶采购于市场；冠突散囊菌分离于大红袍茶，经多代单菌落纯化培养并测序鉴定，保藏在4 ℃冰箱待用。
Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4、草酸、葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、醋酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、茚三酮、氯化亚锡、谷氨酸、蒽酮，天津市福晨化学试剂有限公司；福林酚，没食子酸，北京索莱宝科技有限公司；浓H2SO4，天津市科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。
改良查氏液体培养基[14]：NaNO3 3 g/L，K2HPO4 1 g/L, MgSO4 0.5 g/L, NaCl 50 g/L,蔗糖40 g/L，用蒸馏水充分搅拌使各成分溶解，加水定容至1 L，121 ℃高温灭菌20 min，待用。以上各试剂均为分析纯，购自天津市风船化学科技试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
THZ-D型台式恒温振荡器，太仓市实验设备厂；LRH-150型生化培养箱、DHG-9055A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD型紫外洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZF-50KB型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；AR124CN型电子天平，沈阳杰龙仪器有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；TDL-5-A型低速台式大型离心机，上海安亭科学仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；PEN3型便携式电子鼻，德国Airsense公司；SA402B型电子舌，日本INSENT公司。
1.3 方法
1.3.1 冠突散囊菌孢子悬液的制备
将实验室保藏的冠突散囊菌菌种复苏，复壮，用接种环将菌刮下，在灭菌后的250 mL液体培养基中振荡培养7 d，制备成浓度为1.0×107 CFU/mL孢子悬液。
1.3.2 发酵茶的制备工艺
将处理好的荔枝草茶叶15 g置于250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min[15]，放置20 min晾至室温。加入一定量的冠突散囊菌孢子悬液，使茶叶充分湿润，并在28 ℃的环境中进行固态发酵，发酵7 d后取出，在80 ℃烘箱内干燥2 h，制得成茶。具体技术流程如下：
鲜叶采摘→蒸煮杀青→揉捻→烘干→复水→灭菌→接种发酵→烘干→成茶
1.3.3 主要成分的测定
茶多酚的测定：参考GB/T 8313—2008茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法；氨基酸的测定：参考GB/T 8314—2013茶游离氨基酸总量的测定；茶色素的测定：系统分析法[16]；可溶性糖的测定：蒽酮-硫酸法[17]。
1.3.4 荔枝草茶发酵前后气味的电子鼻检测
荔枝草茶样品前处理方法：准确称取5.0 g(精确到0.01g)茶叶样品于150 mL锥形瓶中，倒入100 mL事先煮沸的蒸馏水进行冲泡，使用封口膜将瓶口密封浸泡10 min后，取漏斗快速过滤得到澄清茶液，取10 mL澄清茶液于20 mL顶空瓶中，加入3.0 g NaCl，水浴锅中70℃预热25 min，每个茶样做5个平行[18]。
电子鼻分析条件：测定时间为120 s，清洗时间110 s，样品间隔1 s，传感器室流量350 mL/min，测量样品流量350 mL/min。PEN3型便捷式电子鼻传感器性能描述见表1[19]。
1.3.5 荔枝草茶发酵前后气味的电子舌检测
荔枝草茶样品前处理方法：准确称取5.0 g(精确到0.01 g)茶叶样品于250 mL锥形瓶中，倒入250 mL事先煮沸的蒸馏水进行冲泡，使用封口膜将瓶口密封浸泡10 min，8层纱布过滤，滤液装瓶密封，冷却至室温待测用[20]。电子舌分析条件：清洗时间5.5 min，传感器自检时间30 s，样品测试时间30 s，测量回味30 s。SA402B型便捷式电子舌传感器性能描述见表2。
表1 PEN3型便捷式电子鼻传感器性能描述
Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose
传感器性能描述备注R(1)对芳香成分灵敏C7H8(10 mL/m3)R(2)灵敏度大,对氮氧化合物很灵敏NO2(1 mL/m3)R(3)氨水,对芳香成分灵敏C6H6(10 mL/m3)R(4)主要对氢气有选择性H2(100 mL/m3)R(5)烷烃,芳香成分C3H8(1 mL/m3)R(6)对甲烷灵敏CH4(100 mL/m3)R(7)对无机硫化合物灵敏H2S(1 mL/m3)R(8)对乙醇灵敏CO(100 mL/m3)R(9)芳香成分,对有机硫化合物灵敏H2S(1 mL/m3)R(10)对烷烃灵敏CH4(10 mL/m3)
表2 SA402B型便捷式电子舌传感器性能描述
Table 2 Properties of sensor on SA402B electronic tongue
传感器响应特性CA0 (S11)对酸味灵敏C00(S12)对苦味灵敏AEI(S13)对涩味灵敏AAE(S14)对鲜味灵敏CT0(S15)对咸味灵敏
1.4 数据处理
通过软件SPSS19.0进行相关数据处理,每组试验进行3次重复取平均值，数据以平均值±标准差表示，作图利用OriginPro8.6与Excel2010进行处理，电子鼻的数据分析采用主成分分析和Loading分析。
2 结果与分析
2.1 不同发酵阶段茶多酚含量的变化
由图1可以看出，发酵前和发酵第2天茶多酚含量变化不显著，随后茶多酚含量呈下降趋势且变化显著，在发酵过程中，茶多酚含量由发酵前32.69%下降至22.27%，降幅为31.88%。有研究表明，茶叶的加工方式对茶叶中茶多酚含量有较大的影响，含量大小依次为：未发酵茶>微发酵茶>半发酵茶>全发酵茶[21]，因此荔枝草发酵茶中由于冠突散囊菌代谢旺盛，使得发酵后的荔枝草茶茶多酚含量明显降低，此外，在发酵过程中冠突散囊菌产生多种胞外酶，在多酚氧化酶的作用下，茶叶中的多酚类物质被氧化成醌类[22]，使茶多酚含量下降，由此减少了荔枝草发酵茶的苦涩味。
图1 不同发酵时间荔枝草茶中茶多酚含量变化
Fig.1 Variations of tea polyphenols in Salvia plebeia tea during the different fermentation time
2.2 不同发酵阶段氨基酸含量的变化
由图2可以看出，氨基酸含量呈显著下降趋势，发酵前期下降趋势不明显，随时发酵时间的增长，氨基酸含量逐渐降低，由发酵前的4.79%下降至3.05%，降幅为36.3%。
图2 不同发酵时间荔枝草茶中氨基酸含量变化
Fig.2 Variations of amino acid in Salvia plebeia tea during the different fermentation time
发酵过程中，氨基酸含量持续下降可能是因为在发酵过程中，氨基酸为微生物提供生长所需的碳源或氮源被部分消耗，并且随着荔枝草茶的发酵，氨基酸进一步发生脱羧和氧化脱氨生成醛类物质以及水解、缩合等反应，形成荔枝草发酵茶的香气物质[23]，由此证明冠突散囊菌发酵荔枝草茶可以改善荔枝草茶本身的涩味，进一步提高其感官品质。
2.3 不同发酵阶段茶色素含量的变化
由图3-a和图3-b可以看出，在发酵过程中茶黄素和茶红素有着较为接近的变化趋势，即在发酵第6天前，色素累计含量逐渐升高且增长越来越迅速，在发酵结束时，增长趋势开始减缓，这是因为在发酵过程中，冠突散囊菌发酵产生的多酚氧化酶将茶多酚主要物质儿茶素氧化为醌类，再进一步缩聚形成茶黄素和茶红素，因此发酵前期这2种色素增长较快[24]。由图3-c可以看出，茶褐素的变化随着发酵时间的增长不断增加，且有加快的趋势，这是因为发酵过程中茶黄素和茶红素发生氧化聚合反应生成茶褐素，使得茶褐素的含量不断增多，与此同时茶黄素和茶红素的增长速度减缓[25]。在整个发酵过程中，3种茶色素含量有不同程度的提高，茶黄素增长3.02倍，茶红素增长1.73倍，茶褐素增长1.29倍，这种变化也有效地改善了荔枝草发酵茶茶汤的感官品质。
a-茶黄素含量；b-茶红素含量；c-茶褐素含量
图3 不同发酵时间荔枝草茶中茶色素含量变化
Fig.3 Variations of tea pigments contents in Salvia plebeia tea during the different fermentation time
2.4 不同发酵阶段可溶性糖含量的变化
由图4可以看出，在发酵过程中可溶性糖含量呈减少的趋势，尤其在发酵前2 d，降幅最为明显，此后下降趋势减缓，发酵结束时，茶叶中可溶性糖含量由1.47%下降至1.1%，降幅达到25.17%。在发酵过程中冠突散囊菌产生多种胞外酶，包括纤维素酶和果胶酶，这些胞外酶将茶叶中的多糖分解为单糖，促进可溶性糖的溶出，为微生物的生长提供所需碳源[26]。
图4 不同发酵时间荔枝草茶中可溶性糖含量变化
Fig.4 Variations of soluble sugar in Salvia plebeia tea during the different fermentation time
2.5 电子鼻分析荔枝草茶发酵前后风味的差异
图5为未发酵、冠突散囊菌发酵荔枝草茶的主成分分析，对同一样品进行多次取样判断检测稳定性。其主成分1(PC1，90.64%)和主成分2(PC2，5.95%)的总贡献率为96.59%，>90%，说明PC1和PC2包含很大的信息量，能够反应所有性状指标所提供的信息。从图5可以看出，未发酵和发酵的荔枝草茶分布于不同的区域，说明电子鼻能良好地区分2种样品。
图5 荔枝草茶发酵前后的PCA分析
Fig.5 PCA analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation
图6为电子鼻10个传感器分别对样品的PCA主成分分析的贡献率。R(2)传感器对第1主成分区分贡献率最大，是第1主成分的特征信号；R(9)传感器对第2主成分区分贡献率最大。根据各传感器对不同物质的特异敏感度，说明氮氧化合物在荔枝草发酵茶中的贡献率最大，而有机硫化物在茶叶香气成分第2主成分中贡献率最大。
图6 荔枝草茶发酵前后Loading分析
Fig.6 Loading analysis of Salvia plebeia tea before and after fermentation
2.6 电子舌分析荔枝草茶发酵前后风味的差异
本实验使用的电子舌设备含有5个检测探头，分别为酸味(CAO)、苦味(COO)、涩味(AEI)、鲜味(AAE)、咸味(CTO)，通过检测后得到酸味、苦味、涩味、鲜味、咸味、苦味回味、涩味回味、丰富度8组滋味指标[37]。由图7可以看出，5个滋味传感器对发酵前后2种茶叶均有响应，但敏感度略有差异，苦味、涩味、咸味传感器响应值较为明显，鲜味和酸味传感器响应值较低。发酵后代表茶叶感官的苦味和涩味响应值降低，这表明通过冠突散囊菌的发酵改善了荔枝草发酵茶的感官品质。
图7 荔枝草茶发酵前后茶汤滋味雷达图
Fig.7 Radar plot of Salvia plebeia tea flavor before and after fermentation
3 结论
对冠突散囊菌发酵的荔枝草发酵茶不同阶段的主要成分及风味变化进行研究，结果表明，在荔枝草发酵过程中，茶多酚、氨基酸和可溶性糖含量变化规律相似，呈现随发酵时间的增长逐渐降低的趋势；茶黄素和茶红素的变化规律相似，增长速率先增加后减缓，而茶褐素含量随发酵时间的增长逐渐升高；在风味检测中，发现发酵后苦味、涩味明显降低，本实验表明冠突散囊菌的生长使得茶叶中主要理化成分及风味物质发生了显著地变化，有效地改善了荔枝草发酵茶的品质，为今后荔枝草发酵茶的进一步生产提供了理论依据。
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