核桃花护色工艺的条件优化

核桃花又称核桃纽、长寿菜、龙须菜，是核桃种植生产的主要副产物之一，每株成熟的核桃树可产4～5 kg核桃花[1-2]。中国是世界上核桃生产大国，核桃的种植面积和产量均居世界上首位。截止2017年底，我国核桃栽培面积已达1亿亩，核桃产量414万t，可产核桃花50万t，其中仅云南种植面积就达4 300万亩，可产核桃花20万t。

核桃花具有较高的开发价值[3],蛋白质高达21%，K、Fe、Mn、Zn、Se及β-胡萝卜素、核黄素、抗坏血酸、维生素E等含量较高，氨基酸组成全面、丰富[3-4]。此外，核桃花还具有较强的生物活性，如核桃花的甲醇提取物具有较强的抗氧化活性、抗菌活性[5-7]以及抗溶血活性[8]；其乙醇提取物可以预防糖尿病大鼠的肝损害、降低其血糖水平[9-10]、抑制肿瘤细胞增殖[11-13]等。我国民间一直有药用和食用核桃花的传统，并将其称为长寿食品。贵州省和云南省少数民族地区将核桃花作为特色蔬菜，其制作的菜肴气味清香，口感鲜嫩清脆。

但目前我国对核桃花的开发利用较少，除少量食用和饲用外，大部分都被丢弃。核桃花中富含生物活性物质，在加工过程中极易发生褐变，导致产品感官品质下降，营养物质损失[14]，严重影响核桃花的商品价值。为提高核桃花的产品质量和经济效益，需要对其进行护色处理[15-16]。本实验旨在筛选出适合核桃花护色的护色剂，并优化护色工艺，为开发利用核桃花资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃花，购于云南楚雄大姚县。乙酸锌(Zn(Ac)2)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、Na2CO3、抗坏血酸(VC)、CaCl2、L-半胱氨酸(L-Cysteine)等，均为食用级。

SC-80型轻便色彩色差计，北京康光仪器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；BSA224S型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-1000紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科技仪器有限公司；XA-3型样品粉碎机，常州市春秋电子仪器有限公司。

1.2 试验方法

将核桃花以清水冲洗2遍，然后在配置好的护色剂溶液中护色一定时间，取出沥干表面水分，在50 ℃下干燥3 h，然后密封于室温下待用。

1.2.2 色差值(ΔE)的测定

准确称取护色后干燥的核桃花1.0 g，剪碎，加入20 mL去离子水，研磨成浆，过滤，收集滤液，采用轻便色彩色差计测量核桃花滤液的L*，a*，b*值。L*代表样品的明度，L*值越大，颜色越白；a*代表样品的红绿值，其中+a*为红，-a*为绿；b*代表样品的黄蓝值，其中+b*为黄，-b*为蓝，由护色前后样品的L*，a*，b*的差值ΔL、Δa、Δb，可计算出样品的总色差值ΔE[17]。ΔE可表示样品的色泽变化程度，ΔE值越大，色泽变化越大，护色效果越差。ΔE的计算见公式(1)[18]：

式中:ΔL、Δa、Δb分别为护色前后样品L*，a*，b*的差值。

1.2.3 褐变强度(BD)的测定

采用消光值法[19-20]。取1.2.2中收集的滤液，采用分光光度计法在410 nm处测量吸光度值A410，结果以A410×10表示褐变程度。

1.2.4 护色剂的确定

分别选用了3 mg/mL Zn(Ac)2、EDTA-2Na、Na2CO3、VC、CaCl2、L-Cysteine，对核桃花进行护色试验，同时以不加护色剂的去离子水为空白对照，测定色差值和褐变强度，选取护色效果较好的几种单护色剂，然后进行复配试验，以确定最佳护色剂组合。

1.2.5 单因素试验

以1.2.4中确定的最佳护色剂组合，分别考察护色剂质量浓度(0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12 mg/mL)、护色时间(1、2、4、6、8、10 h)、护色温度(15、25、40、60、80、100 ℃)对核桃花护色效果的影响。

1.2.6 Box-Benhnken中心组合实验设计

在单因素试验的基础上，建立3因素3水平的Box-Benhnken中心组合试验[21]，以色差值、褐变强度为响应值，各因素的3个水平采用-1、0、1进行编码，如表1。

1.3 数据处理

每组参数均设置3组重复，试验数据均以平均值±标准差的形式表示，采用SPSS Statistics 19软件进行差异显著性分析，运用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计，并由Origin 7.5软件绘制试验结果图。

2 结果与分析

2.1 护色剂的确定

2.1.1 单一护色剂的护色效果

各护色剂对核桃花的护色效果见表2。相同浓度下，各处理组ΔE大小顺序为：CaCl2

2L-Cysteine<对照2CO3。褐变强度大小顺序为：CaCl2

2<L-Cysteine<对照2CO3，其结果与ΔE试验结果基本一致。由表2可知，Vc、Zn(Ac)2、EDTA-2Na、CaCl2组的ΔE显著小于对照(P<0.05)，表明其护色效果较好。而Na2CO3组的ΔE显著大于对照(P<0.05)，L-Cysteine组的ΔE与对照无显著性差异(P>0.05)，这表明Na2CO3和L-Cysteine不适合作为核桃花的护色剂。CaCl2组提高核桃花护色效果的原因可能是由于Ca2+的存在，与核桃花细胞壁上的果胶酸作用形成了果胶酸钙，增大组织的硬度，阻止液泡中的组织外渗，抑制与酶类的接触，从而降低了褐变程度[22]；EDTA-2Na在食品加工中能减慢原料固有色素的褪色速度，保持其稳定性[23]；Zn(Ac)2的Zn2+具有络合能力，它同多酚底物结合后产生的新型物质不受多酚氧化酶的催化，抑制了核桃花的褐变[15]；Vc不仅可以改变体系的pH值，同时还是一种强还原剂[24]，其抑制褐变的主要原因是Vc将核桃花中的邻二醌还原成邻二酸[25-26]。综合ΔE与褐变强度试验结果，Vc、Zn(Ac)2、EDTA-2Na、CaCl2组的护色效果均优于其他2种护色剂，因此选用这4种护色剂进行下一步复配试验。

2.1.2 复合护色剂的护色效果

复合护色剂对核桃花的护色效果见表3。相同浓度下，两两复配的复合护色剂护色效果普遍优于三三复配的复合护色剂。两两配对的复合护色剂ΔE的大小依次是：EDTA-2Na+CaCl22+Vc2+Vc22+CaCl2

2复合护色剂护色效果最佳，可能是由于EDTA-2Na能减慢核桃花固有色素的褪色速度，而Ca2+与核桃花细胞壁上的果胶酸反应生成不溶性物质来抑制非酶褐变。2者抑制褐变的机理不同，对护色效果具有相互增加的作用[27]。综合其色差值ΔE及褐变度试验结果，选择EDTA-2Na与CaCl2复合护色剂为最优护色剂，进行下一步的单因素和响应面优化试验。

注：复合护色剂的比例均为质量比；同一列不同小写字母上标表示差异显著性(P<0.05)。

2.2 单因素试验

2.2.1 护色剂浓度对核桃花护色效果的影响

复合护色剂浓度对核桃花的护色效果见图1。

由图1可知，随着护色剂浓度的增加，护色效果呈先下降后增加的趋势。当护色剂质量浓度小于3 mg/mL时，色差值和褐变强度逐渐降低；质量浓度在3～8 mg/mL时，色差值和褐变强度基本呈直线状，趋于稳定；当护色剂质量浓度达到5 mg/mL时，色差值和褐变度均达到最小值，此时护色效果最佳；质量浓度在8～12 mg/mL时，色差值和褐变强度又有所上升。原因可能是随着Ca2+和EDTA-2Na质量浓度增加，其抑制褐变能力增强；但当护色剂浓度过大时，产生的果胶酸钙过多导致护色效果变弱。因此选取5 mg/mL为最佳护色质量浓度。

2.2.2 护色时间对核桃花护色效果的影响

护色时间对核桃花的护色效果见图2。由图2可知，随着护色时间的延长，核桃花的褐变度没有显著变化(P>0.05)，但色差值呈逐渐增大的趋势。这可能是由于在护色开始时护色剂对核桃花中各种酶类以及维生素等起到了抑制作用，但随着护色时间的延长，核桃花中的酶类发生酶促褐变，多酚、维生素等与氧气接触发生了非酶褐变，导致后期颜色的逐渐变化。因此选择2 h为最佳护色时间。

2.2.3 护色温度对核桃花护色效果的影响

由图3可知，随着护色温度的升高，护色效果总体呈先下降后上升的趋势。当护色温度为25 ℃时其色差值和褐变度均达到最小值，这可能是由于高温会破坏核桃花中的叶绿素，导致其颜色变深。因此选择25 ℃为最佳护色温度。

2.3 Box-Benhnken中心组合试验结果及数据分析

2.3.1 Box-Benhnken中心组合试验设计方案及结果

根据单因素试验结果，以核桃花色差值、褐变度为响应值，以护色剂浓度(A)、护色时间(B)、护色温度(C)为自变量，采用Design-Expert 8.0.6软件建立3因素3水平中心组合试验，其试验方案和结果如表4所示。

2.3.2 回归方程拟合及方差分析

通过Design Expert 8.0.6软件对表4中试验结果进行响应面回归分析，得到该实验的回归模型方程Y1=11.90+0.33A-5.90B-0.08C-0.12AB-2.37AC+0.05BC-0.02A2+1.23B2+5.47E-4C2、Y2=2.61-0.26A-0.50B-0.06C+0.03AB-4.48E-3AC+3.79E-3BC+0.03A2+0.06B2+1.42E-3C2。响应值Y1、Y2模型系数显著性结果和方差分析结果见表5。

回归模型方程Y1的

回归模型方程Y2的

由方差分析可知两个回归方程模型均显著(P<0.05)，表明该模型与实际拟合良好，试验方法可靠，失拟项均不显著(P>0.05)，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，可用此模型对核桃花护色效果进行分析和预测。结果显示，各因素对响应值Y1显著性排序为C>A>B；对响应值Y2显著性排序为A>B>C。

2.3.3 响应面图分析

根据响应值的3D曲面图，分析各因素对核桃花护色效果的影响及各因素的交互作用。图4中所示为因素的交互作用及对核桃花护色效果的影响。其中图4-c和图4-e曲面相对陡峭说明因素之间的交互作用较明显，与方差分析结果相符。

采用Design Expert软件同时对2个方程求导可知，当护色剂浓度为5.23 mg/mL、护色时间为2.3 h、护色温度为25.5 ℃时，其理论色差值和褐变度均最低，分别为4.86和0.54，护色效果最佳。对该优化条件进行验证试验，平行3次，在该条件下色差值为4.84、褐变度为0.49，接近理论值，证明该模型可行。

3 结论

考察了实际生产中常用的几种护色剂对核桃花的护色效果，发现EDTA-2Na与CaCl2按1∶1复配后的护色效果最佳。

采用Design Expert软件对核桃花护色工艺进行优化，得到了核桃花护色的最佳工艺：复合护色剂浓度为5.23 mg/mL、护色时间为2.3 h、护色温度为25.5 ℃。此条件下的核桃花护色效果最佳，其色差值和褐变度最低，分别为5.26和0.49。本研究为抑制核桃花的褐变现象提供了一定的参考价值，对其加工利用有一定帮助。

核桃花富含丰富的营养物质和活性组分，但其在护色过程中各营养物质和活性组分是否发生变化尚不可知，下一步将在护色工艺对核桃花的营养和功能活性等影响做深入研究。

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