热水处理减轻采后黄瓜果实低温贮藏冷害的条件优化

黄瓜原名胡瓜，又名剌瓜、青瓜，是葫芦科一年生草本蔓生攀缘植物。黄瓜营养丰富、经济价值高，其富含蛋白质、糖类、维生素、胡萝卜素、尼克酸及钙、磷、铁、钾等矿物质，长期食用可抗肿瘤、防衰老、防酒精中毒、降血糖、减肥强体。但黄瓜采后不易贮藏，是典型的冷敏易腐型果蔬，在普通冷藏环境或不适宜的低温条件下极易发生冷害[1]。冷敏感型果蔬的冷害机理与控制研究一直是采后生理学研究的热点之一。贮藏在低温逆境下的果蔬，随着冷害发生，表现出各种症状，主要为表皮凹陷、失去颜色、内外果皮有水渍状斑点、果皮发生木质化和褐化、组织有裂缝等[2]。而且，冷害发生的表现与症状表现不同步，恢复到常温条件后的果蔬比正常情况下腐烂得更快，即冷害隐蔽现象。果蔬冷害的发生，会导致膜脂由正常状态下的流动液态镶嵌相转变为晶体固态相，细胞膜收缩，膜上出现龟裂和孔道，膜透性增强[3]，膜内大量可溶性物质及电解质等向膜外渗透，渗出的离子浓度增大，细胞膜组织的电解质渗透率升高[4-5]。而膜渗透率越大说明受到的冷害越重，因此电解质外渗率能够作为评价果蔬受到冷害程度的指标，且比观察冷害症状更为可靠。通过变温处理[6-7]、贮前热处理[8-13]等方法可以减轻冷敏型果蔬的冷害症状。而作为果蔬采后简单物理处理方法之一的热处理技术，对减轻长时间低温冷藏造成的果蔬伤害、改善果蔬品质、延长其贮藏期等具有一定的效果[14-15]。吴光斌等[16]在研究枇杷冷害中发现，将枇杷果实热激处理后贮于2 ℃～5 ℃的环境中能够缓解由低温引起的呼吸速率异常升高症状，推迟冷害症状的出现时间，增强细胞膜的抗冷性，冷害程度明显减轻。乔勇进等[17]也发现，热水处理可以减轻由低温造成的膜伤害，维持膜的稳定性，延缓黄瓜细胞膜渗透率的增加，延缓和抑制冷害的发生。现今热处理对冷敏型果蔬的影响研究已经较为成熟，但关于热激处理中达到最佳效果的具体热激温度及热激时间的研究却并不常见。本研究在实验室前期研究基础上，对热水处理减轻黄瓜冷害的最佳热激温度及热激时间进行了研究。

本研究采用二次正交旋转组合设计的试验方法，能够有效快速地确定多因子系统的最佳条件[18-19]，是一种应用较为广泛的试验优化方法，曾有多位学者将其用于提取工艺或配方的优化[20-22]，但该试验方法用于果蔬冷害防治优化的研究还鲜见报道。本研究采用电解质外渗率作为黄瓜冷害程度指标值进行试验的优化，采用二次正交旋转组合设计，以热激温度、热激时间及贮藏时间作为水平变量，优化黄瓜的最佳热激处理条件，以期为黄瓜冷害的防治提供一定的试验参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为“申青”黄瓜，购于上海市临港新城大棚种植园。果实完全成熟，长度约(30±2) cm，直径约(3.5±0.5) cm，单个果实的质量约为(200±20) g，果实饱满无明显机械损伤。将运回试验室的黄瓜样品进行适当的冲洗，分别于不同温度(30～62 ℃)热水中热激一定时间(0～80 min)后，拭干，装入厚约0.01 mm的聚乙烯薄膜包装袋中，每袋3根，保持间距，在冷库中(4 ℃，85%RH)贮藏0～12 d后用于黄瓜果实在低温条件下电解质外渗率的试验研究。每个处理组黄瓜30根，重复试验。

1.2 测定方法

1.2.1 电解质渗透率的测定

参考解越等[23]电导率测定方法并作修改。使用切片器从黄瓜样品中间部位切下3片厚度约为0.7 mm的均匀薄片，切取时应保证薄片厚度大小均匀一致并且尽量减少损伤。再使用打孔器从每片黄瓜薄片果肉部分打取面积约为0.25 cm2的5片组织圆片，分别放入已标记的烧杯中，依次加入20 mL去离子水，使样品完全浸没。将装有样品的烧杯置入转速150 r/min、25 ℃的振荡箱内振荡10 min，待去离子水完全浸透样品，用纱布过滤掉烧杯中的水，然后加入20 mL去离子水冲洗，如此反复3次，用滤纸吸干残留在组织圆片表面中的水分，再次放入对应的烧杯中，加入20 mL去离子水，通过电导率测试仪测定样品的初始电导率(R0)。然后将烧杯放入真空干燥器中，连接真空泵与真空表后进行抽气，压力控制在0.06～0.08 MPa，渗透时间30 min。之后将烧杯取出，使用保鲜膜和橡皮筋对烧杯进行封口后，再放入上述条件振荡箱内振荡1 h。待振荡结束，取出烧杯，置于室温条件下(20±2 ℃)静置，测定样品活体组织提取液的电导值(R)。最后用保鲜膜封口，于沸水中煮沸10 min后，再次冷却至室温，测定组织被完全杀死后的提取液的电导值(R′)。用公式(1)计算电解质外渗百分率(Y)。

式中：R，所测样品活体组织提取液的电导值，μS/cm；R′，组织被完全杀死后提取液的电导值，μS/cm；R0，初始电导值，μS/cm。

将黄瓜样品在室温条件下(20±2 ℃)放置2 d后，测定其冷害指数。参考MART width=8,height=17,dpi=110

NEZ-TÉLLEZ M[24]的方法，根据症状将冷害现象分为5个等级：①0级，无冷害现象发生；②1级，冷害面积<1/4；③2级，冷害面积约为1/4～1/2；④3级，冷害面积约为1/2～3/4 ；⑤4级，冷害面积>3/4[25]。用公式(2)计算冷害指数。

1.3 试验设计

对热激温度、热激时间、贮藏时间进行单因素试验，测定电解质外渗率，每个处理组含30根黄瓜样品，取平均值。再以单因素试验确定各因素水平范围，利用三因素二次回归正交旋转组合试验设计，优化得到减轻黄瓜冷害的最佳热激处理条件。如表1所示，以热激温度、热激时间和贮藏时间为试验因素，对试验因素水平编码[27]。以电解质外渗百分率Y作为指标值，进行二次回归正交旋转组合试验设计。将黄瓜按照表1中热激时间及热激温度用热水进行热激处理，随后将热激后的黄瓜置于冷库(4 ℃，RH85%)中贮藏，按时取样，测定黄瓜指标值。

1.4 数据处理

运用SAS 9.1.3处理系统处理试验数据并绘制等高线图和响应面图，采用Excel 2003进行折线图的绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 热激温度单因素试验分析

在前期黄瓜热激的预试验中发现，当热激温度达到70 ℃以上时，黄瓜出现失水、皱缩变黄等现象，因此在热激温度单因素试验中，从30～62 ℃范围内选取了30、38、46、54、62 ℃的热水，然后分别热激30 min，处理后于4 ℃下贮藏5 d(第5天所有处理方式均发生不同程度的冷害现象)，测定黄瓜样品的电解质外渗率。虽然冷害指数能够较为直观地表现出黄瓜果实受低温胁迫伤害程度，但其有一定的滞后性，因此，同时观察在室温下放置2 d后的黄瓜样品的冷害指数，与电解质外渗率指标值的趋势进行比较。

如图1所示，30、38、46、54、62 ℃的热激处理下的黄瓜果实组织的电解质外渗率分别为(22.54±0.19)%，(18.42±0.12)%，(26.34±0.25)%，(28.32±0.17)%，(33.68±0.20)%。结果表明，黄瓜果实低温逆境胁迫下的电解质外渗率的变化与热激温度有显著关系(P<0.05)。电解质外渗率随着温度的升高先迅速降低后快速升高至缓慢增长，即受冷害程度随热激温度先降低后升高。当用38 ℃热激处理时，电解质外渗率最低。表2为不同热激温度对黄瓜冷害指数的影响。结果表明，黄瓜冷害指数变化也呈相似的变化趋势，即随着温度的升高冷害指数先降低后升高，最后趋于平缓。由图1可知，黄瓜样品经38 ℃热激处理后，受低温伤害最小，与电解质外渗率的变化趋势一致。

注：表中数据为各组样品“平均值±标准差”(n=30)；不同字母表示差异性显著(P<0.05)。下同。

2.1.2 热激时间单因素试验分析

在38 ℃热水中分别热激黄瓜样品0、20、40、60、80 min，然后于4 ℃下贮藏5 d，测定其电解质外渗率。并观察计算在室温下放置2 d后的黄瓜样品的冷害指数，与电解质外渗率指标值的变化趋势进行比较。

如图2所示，当在38 ℃环境下热处理0、20、40、60、80 min后，黄瓜果实组织的电解质外渗率分别为(27.31±0.21)%，(19.42±0.23)%，(22.54±0.17)%，(23.65±0.26)%，(29.46±0.12)%。由试验结果可以看出，黄瓜果实低温逆境胁迫下的电解质外渗率变化与热激时间有显著关系(P<0.05)。电解质外渗率随热激时间的增加先迅速降低后缓慢上升，即随热激时间的增加受冷害程度先下降后上升。当热激时间为20 min时，电解质外渗率达到最低。

表3为不同热激时间对黄瓜冷害指数的影响。结果表明，黄瓜冷害指数变化呈相似的变化趋势，即先下降后上升。如图2所示，黄瓜样品在20 min热激处理下，受低温逆境伤害最小，与电解质外渗率的变化趋势一致。

2.1.3 贮藏时间单因素试验分析

在38 ℃热水中热激黄瓜样品30 min后，将样品放置在4 ℃下分别贮藏0、3、6、9、12 d，分别测定其电解质外渗率。并观察在室温下放置2 d后的黄瓜样品的冷害指数，与电解质外渗率指标值的趋势进行比较。

如图3所示，将在38 ℃环境下热激处理20 min后的黄瓜果实组织放置在4℃下，贮藏0、3、6、9、12 d，其电解质外渗率分别为(17.40±0.18)%，(24.29±0.16)%，(27.32±0.12)%，(29.34±0.24)%，(33.91±0.27)%。由试验结果可以看出，黄瓜果实低温逆境胁迫下的电解质外渗率变化与贮藏时间有显著关系(P<0.05)。电解质外渗率随着贮藏时间的增加持续升高，即随贮藏时间的延长受冷害程度呈一直上升的趋势。在整个周期中，电解质外渗率增长了94.89%。表4为不同贮藏时间对黄瓜冷害指数的影响。结果表明，黄瓜冷害指数变化呈相似的变化趋势，即冷害指数随着贮藏时间的延长，呈现上升趋势。这表明随着贮藏时间的增加，黄瓜样品受低温逆境伤害程度逐渐增大，与电解质外渗率的变化趋势一致。这也进一步验证了电解质外渗率作为评价冷害程度指标的可靠性。

2.2 二次回归正交旋转组合设计试验数据分析

根据单因素试验结果，以使电解质外渗率达到最低的处理条件为中心选取一定范围作为二次回归正交旋转组合试验设计的因素水平。根据上述结果选取30～50 ℃的热激湿度，0～60 min的热激时间，选取贮藏时间为0～10 d。采用3因素二次回归正交旋转组合设计方法，以电解质外渗百分率Y为指标值，进行试验设计。贮藏期间，黄瓜果肉组织电解质外渗率的试验结果见表5。

经过SAS 9.1.3数据处理系统[28]，将所得数据采用二次回归正交旋转组合试验统计方法进行拟合。表6～表7为回归方程的方差分析、各项的方差分析和参数估计及显著性分析[24]。

2.3 电解质外渗率数学回归模型

数据处理系统进行拟合后，得到关于电解质外渗率数学回归模型回归方程为：Y=68.949 082-2.228 748×x1-0.535 663×x2-0.341 434×x3+

根据表6所列方差分析，对回归方程进行失拟项检验：F1<F0.05(4，9)=3.63显著，失拟性分析表明，该回归方程不存在失拟因素。其中，一次项与二次项的F值均大于0.01水平上的F值，说明这2个因素都对冷害的发生都具有极其显著的影响，交互项的F值小于0.05水平上的F值，表明2个因素之间的交互作用对冷害的发生无显著影响。二次回归模型的F2=17.25>F0.01(9，13)=4.19极显著，P <0.001，说明回归模型与实测值能较好的拟和，模型成立。

在σ=0.10显著水平剔除不显著项，得到的回归方程为：

Y=68.949 082-2.228 748×x1-0.535 663×x2-0.341 434×x3+0.028

根据回归方程绘制贮藏时间5 d，热激温度x1、热激时间x2和贮藏时间x3对电解质外渗率Y影响的等高线图和响应面曲线图(图4)。

从图4可以看出，经热激处理后，在冷害易发生的温度下贮藏5 d，随着热激温度和热激时间的增加，电解质外渗率呈现先下降后上升的趋势，适宜的热处理能够将电解质外渗率控制在最小值23.92%。这可能是由于适当的热激处理使CAT、SOD、APX 和GR等活性提高，抑制了超氧物阴离子自由基

的生成速率和MDA的积累[29]，维持了活性氧的代谢平衡，避免了过多自由基的产生，对膜的破坏和伤害作用减小，保护了膜的完整性，使其具有正常的生理功能，从而减缓了电解质外渗率的升高。而不适宜的高温或热激时间容易引起热伤害，加速果蔬衰老腐败[30]。

通过拟合分析，以电解质外渗率Y表征的黄瓜冷害指标，在热激温度由30 ～50 ℃，热激时间0～60 min时达到最小值23.92%，优化处理结果为热激温度37.5 ℃、热激时间24 min。按照最佳热激处理条件对优化结果进行验证，选取30根黄瓜样品进行热激处理，在第5天时测定电解质外渗率实测值为Y=25.13%，与理论值Y=23.92%较为接近，进一步验证了数学回归模型。而根据单因素试验2.1.1的结果，38 ℃热水处理30 min，于4 ℃冷库中贮藏5 d再于室温放置2 d后的冷害指数最低为0.03，验证试验于第5天时再置于室温2 d后的冷害指数也为0.03，与实际试验值一致，此实验优化得到了减轻采后黄瓜冷害较佳的热水处理组合。

3 结论与讨论

热激温度、热激时间及贮藏时间的单因素试验表明，在热激温度30～62 ℃范围内热激30 min并于4 ℃下贮藏5 d，电解质外渗率随温度的升高先降低后升高；在38 ℃热水中热激0～80 min并于4 ℃下贮藏5 d，电解质外渗率随热激时间的增加先降低后上升；在38 ℃热水中热激30 min并于4 ℃下贮藏0～12 d，指标值电解质外渗率随着贮藏时间的增加持续升高。即在30～62 ℃热激温度和0～80 min热激时间范围内，在其他条件不变的情况下，随着热激温度或热激时间的增加，黄瓜受害程度先降低后升高；随贮藏时间的增加，黄瓜受害程度持续升高。这一现象与前人[17,31-33]对热激黄瓜的研究结果相吻合。

根据三因素二次正交旋转组合设计试验结果表明通过最佳的热水处理后，黄瓜在第5天的电解质外渗率计算值为23.92%，实测值为25.13%，在4 ℃冷库中贮藏5 d，再于室温下放置2 d后的冷害指数为0.03，这一结果远远低于MAO等[34]和NASEF等[35]所测黄瓜的冷害指数和电解质外渗率。从而验证了该模型试验结果较好，能够改善黄瓜的贮藏品质与冷害现象。

适宜的热激处理能对低温贮藏下的供试黄瓜的贮藏品质起到改善作用，并对冷害防治起到较好效果。但是热激处理对冷害防治的机理研究尚不明确，仍应从DNA、RNA以及蛋白质代谢、采后果蔬衰老机制及激素平衡等多方面进行深入系统的研究。

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