蛹虫草玉米肽功能性饮料的研制及其抗氧化活性研究

蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草，属子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、麦角菌科、虫草属，与冬虫夏草同属异种[1]。蛹虫草的营养价值与冬虫夏草相似，含有虫草素、虫草多糖、虫草酸等多种生物活性物质，在抗菌、抗癌、增强人体免疫力等方面有重要作用[2]。目前，以蛹虫草为原料的产品主要包括化妆品、药品和保健食品等[3]，而蛹虫草饮料在市场上却几乎没有。

玉米肽是以玉米蛋白粉为原料，通过蛋白酶水解得到的具有生物活性的小分子肽。玉米肽在很大的pH范围内能彻底溶解于水，对热稳定，安全可靠，无毒副作用，是一种天然的食品蛋白[4]。玉米肽富含多种人体所必需的氨基酸[5]，并且易于人体吸收。特殊的氨基酸组成和连接方式赋予玉米肽多种生物活性，如抗疲劳、促进乙醇代谢、抗氧化、抗癌等[6-8]。

市面上大多数的饮料都是碳酸和果汁类，具有保健功能的饮料较少，正是由于市场上功能饮料的匮乏，并且随着人们越来越注重生活水平和自身身体素质的提高，所以功能饮料拥有广阔的发展前景。贾俊杰等以蛹虫草速溶粉为原料，研究了其对小鼠肠道菌群的影响，发现蛹虫草固体饮料对于抗生素干扰引起的肠道菌群失调具有较好的修复作用，可调节并保持肠道微生态菌群的平衡[9]。朴美子等研究了蛹虫草黄豆粉发酵饮料对小鼠免疫和降血脂功能的影响，发现蛹虫草黄豆粉发酵饮料有较好的提高免疫力和降血脂的功效[10]。蛹虫草作为药食同源的大型真菌，既可满足人们对食品风味的需求，长期食用又可预防高血压、脑血栓等高危疾病。因此，本文以蛹虫草和玉米肽为主要原料，通过正交试验确定最佳配比和体外抗氧化活性，研制具有抗氧化、降血压、提高免疫力、降低血栓倾向等多种功效的功能性饮料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛹虫草、玫瑰花干、蜂蜜，均为市售；玉米肽，购自齐齐哈尔易翔公司；乙基麦芽酚、柠檬酸、柠檬酸钠和VC，均为国产食品级产品；无水乙醇、DPPH、FeSO4、H2O2等均为分析纯试剂，购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平(BSA124S)和酸度计(PB-10)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器，常州荣华仪器制造有限公司；CR21G高速冷冻离心机和Primaide高效液相色谱仪，日立公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；粉碎机，山东金普分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.2 蛹虫草的浸提条件的确定

设定温度分别为30、40、50、60和70 ℃，浸提时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h，通过苯酚硫酸法对浸提液虫草多糖含量进行测定，以虫草多糖含量为指标确定蛹虫草的最佳浸提条件。

1.3.3 蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水的比例确定

在玉米肽添加量为10 g/L、柠檬酸添加量为0.15 g/L、乙基麦芽酚添加量为1 g/L、蜂蜜添加量为80 g/L的条件下，设定蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水(取1 g玫瑰花加入500 mL水在80 ℃下浸提30 min) 的体积比分别为1∶1、2∶1、3∶1，利用感官评定方法，确定蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水的比例。

1.3.4 饮料配方单因素条件优化

设定蛹虫草浸提液与玫瑰花水的比例为2∶1，以饮料的感官评分为指标，分别考察玉米肽(5、10、15、20、25 g/L)、乙基麦芽酚(0.5、1、1.5、2 g/L)、蜂蜜(60、70、80、90 g/L)和柠檬酸(0.1、0.15、0.2、0.25 g/L)添加量对产品感官品质的影响。

1.3.5 最佳配方的确定

选取蛹虫草浸提液与玫瑰花水的比例、玉米肽的添加量、蜂蜜添加量和柠檬酸添加量为因素，进行L9(34)正交试验，确定各参数的最佳配比。因素与水平见表1。

1.3.6 感官评价法

挑选 20 人对饮料进行感官评定，以产品的色泽、口感、气味及组织状态4个因素作为感官评价指标进行打分，总分为100分，其中口感、气味、色泽和组织状态分别占25%、20%、15%和10%。评分标准如表2所示。

1.3.7 理化指标检测

血纤维蛋白平板法测定纤溶酶活力[11]；苯酚硫酸法测定饮料中总糖的含量[12]；高效液相色谱法测定饮料中虫草素含量[13]。

1.3.8 抗氧化活性的测定

将蛹虫草饮料成品稀释10倍，进行抗氧化活性测定,以Vc作为对照。

(1)DPPH·清除率的测定

DPPH·清除率的测定参考文献[14] 的方法，清除率的计算公式如式(1)：

式中：Ai，样品吸光度值；Aj，样品与无水乙醇的吸光度值；A0，DPPH无水乙醇的吸光值。

(2)·OH清除率的测定

·OH清除率的测定参考文献[15]的方法，清除率的计算公式如式(2)：

式中:Ai，样品吸光度值；Aj，无水杨酸的吸光度值；A0，空白对照的吸光度值。

(3)还原力的测定

还原力的测定参考文献[16] 的方法。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草浸提条件的确定

2.1.1 温度的优化

在料液比为1∶50(g∶mL)，浸提时间为2 h时，用苯酚硫酸法分别测定在30、40、50、60和70 ℃下的浸提液虫草多糖含量，结果如图1所示。

由图1可知，随着温度的升高，分子热运动加快，多糖含量也随之增加，50 ℃之前，温度较低，多糖含量增加的比较缓慢。温度升高，对细胞的破坏作用加大，有利于多糖的浸出。当浸提温度为60 ℃时，多糖提取量为20 mg/mL，继续温度升高，多糖含量有所下降，故浸提温度60 ℃为宜。

2.1.2 浸提时间的优化

在料液比为1∶50(g∶mL)，温度为60 ℃，用苯酚硫酸法测定30、60、90、120、150、180、210和240 min浸提液蛹虫草多糖含量，结果如图2所示。

由图2可知，浸提时间为30～120 min时，虫草多糖含量呈上升趋势，120 min时虫草多糖含量最高为11.8 mg/mL，120 min后虫草多糖含量随时间的升高略有下降并逐渐趋于平缓，可能是由于提取时间过长，多糖发生了转化，含量降低。故浸提时间120 min为宜。

2.2 饮料配方的确定

2.2.1 蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水的比例的确定

蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水的比例试验结果如图3所示。

由图3可知蛹虫草浸提液与水或玫瑰花水的体积比为2∶1时感官评定均呈现最高值，而玫瑰花水的感官评价明显优于水，真菌子实体在浸提的过程中会有一些特殊的气味，这些气味会影响饮料成品的气味，添加一定量的玫瑰花水后，玫瑰花水的香味可以掩盖这些特殊的气味，使饮料的气味得到改善，若是玫瑰花水添加太多则会导致蛹虫草味道被掩盖，故选取蛹虫草浸提液与玫瑰花水为2∶1的比例。

2.2.2 玉米肽添加量的确定

玉米肽是以玉米蛋白为原料，利用蛋白酶水解玉米蛋白获得的产物，不同的蛋白酶和水解条件获得的玉米肽具有不同的生物活性[17]。玉米肽中富含多种人体必需氨基酸，特殊的氨基酸组成和连接方式赋予玉米肽多种生物活性，如抗疲劳、促进乙醇代谢、抗氧化、降血压等[5-8]，玉米肽添加量试验结果如图4所示。

由图4可知，随着玉米肽添加量的逐渐增加，感官评分出现先增加后降低的趋势。玉米肽是玉米蛋白通过蛋白酶水解获的产物，在水解过程中，玉米蛋白中大量的疏水性氨基酸暴露，导致玉米肽具有一定的苦味，添加到饮料中，会使饮料的口感和气味有所改变。玉米肽添加量在10 g/L时，感官评定的分数最高，若玉米肽添加量大，苦味也就随之增大，若玉米肽添加量过少，则饮料的功能性有所降低。故选取玉米肽为10 g/L的添加量。

2.2.3 乙基麦芽酚添加量的确定

乙基麦芽酚是一种安全无毒、用途广、效果好、用量少的理想食品添加剂，是烟草、食品、饮料、香精、果酒等良好的香味增效剂，常常添加到饮料中，起到掩蔽剂的作用，对食品的香味改善和增强具有显著效果，且能延长食品储存期。由于玉米肽的添加，引入了一定的苦味，所以通过添加一定量的乙基麦芽酚来掩盖苦味。乙基麦芽酚添加量结果如图5所示。

由图5可知，乙基麦芽酚的添加量在1.5 g/L时感官评定的分数最高，乙基麦芽酚添加量过少不能将玉米肽的苦味适度掩盖；若乙基麦芽酚添加过多，会使饮料中充满乙基麦芽酚的味道，口感不适，故选取乙基麦芽酚为1.5 g/L的添加量。

2.2.4 蜂蜜添加量的确定

蜂蜜除了富含糖类物质外，还含有少量的维生素、氨基酸、蛋白质、有机酸及多种人体必需的微量元素[18]。此外，蜂蜜中还含有多种酶类物质，主要包含葡萄糖氧化酶、淀粉酶及转化酶等，其中转化酶可将蜂蜜中蔗糖转化为具有旋光性的单糖，即α-果糖和α-葡萄糖[19]。蜂蜜作为甜味剂在赋予饮料甜味的同时，还引入了很多的营养物质，使饮料的营养价值进一步提升。蜂蜜添加量试验结果如图6所示。

由图6可知，甜味由淡变甜到过甜，感官评分先升高后降低，因此蜂蜜添加量80 g/L为宜。蜂蜜的甜度较大，其用量会直接影响饮料的口感，用量少则饮料没有甜味或甜味过低，用量多甜味过高，会掩盖饮料的其他风味。

2.2.5 柠檬酸添加量的确定

柠檬酸是一种食品添加剂，常常作为酸味调节剂添加到食品中。柠檬酸添加量结果如图7所示。

由图7可知，随着柠檬酸添加量的增加，感官评价分数呈现先升高后降低的趋势，柠檬酸的添加量在0.15 g/L时为宜，柠檬酸用量会直接影响饮料的风味口感，若用量过少会使饮料失去酸的口感，甜味明显；若用量过多则会导致饮料太酸，酸味突出，有涩口感，易失去复合饮料的特别风味。故选取柠檬酸添加量0.15 g/L为宜。

2.3 饮料配方的正交试验优化

在单因素试验的基础上，选取蛹虫草浸提液和玫瑰花水的比例、玉米肽添加量、蜂蜜添加量、柠檬酸添加量为作为考察因素。蛹虫草玉米肽复合饮料配方优化的正交试验结果与分析见表3。

由表3可知，影响饮料风味的因素主次顺序为玉米肽添加量>蛹虫草浸提液与玫瑰花水的比例>蜂蜜添加量>柠檬酸添加量，即影响最大的是玉米肽添加量，其次是蛹虫草浸提液与玫瑰花水的比例和蜂蜜添加量，柠檬酸添加量对饮料品质影响最小。由于玉米肽存在苦味，对饮料的影响较大，其他因素对饮料的口感影响较小。根据均值k确定最优的组合为A2B1C2D3，即蛹虫草浸提液：玫瑰花水=2∶1(mL∶mL)、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的柠檬酸。按A2B1C2D3条件进行3次平行试验，感官评价的平均值为94.31，高于表3中每一项试验结果，故A2B1C2D3为最佳组合。

2.4 产品质量标准

蛹虫草玉米肽饮料呈浅黄色，无沉淀，溶液澄清透明，具有蛹虫草独特的风味(略带苦味)，酸甜可口，无异味。

纤溶酶活力为2.78 U/mL；虫草素含量为12.43 μg/mL；多糖含量为199 mg/mL。

纤溶酶具有溶解纤维蛋白的能力，而纤维蛋白是血栓的主要成分。在生物化学中，纤维蛋白溶解简称为纤溶。血液中存在着凝血系统和纤维蛋白溶解系统，它们各受一系列酶促反应的调节，正常生理状态下，这两个系统保持动态平衡，既保证血液有潜在可凝固性，又保证血液的流体状态。纤溶的生物学作用之一是去除血管、组织液中过剩的纤维蛋白沉积物，以保持血循环、组织液管道等的通畅。人体随着年龄的增长，或长期饮食习惯不良或饮食结构不当，可使体内纤溶能力逐渐减弱，纤维蛋白就可能积累在血管内，增加血栓倾向[20]。

含纤溶因子的功能性食物具有增加人体纤溶系统活性的功能[21-22]。有计划地食用含纤溶因子的功能食品，可使体内纤溶系统活性缓慢适量增强，逐渐恢复其正常生理状态，降低血栓倾向[23-26]。以蛹虫草子实体为原料研制的饮料具有较好的降低血栓倾向的功效。

虫草素(cordycepin)是蛹虫草的一种特殊的腺苷类似物活性物质，具有调节人体免疫、抑制肿瘤生长、抗菌抗病毒、治疗白血病和消炎等多种功能[27-30]。

虫草多糖是蛹虫草中所含活性物质中最丰富、最重要的物质，具有很高的营养价值和药效功能，特别是其在抗氧化和提高机体免疫力的功能方面有明显的效果，除此之外，虫草多糖还具有降血压、降血脂、抗肿瘤和保护肝脏等功能[31-34]。

2.5 抗氧化活性

2.5.1 蛹虫草饮料DPPH·清除能力试验

DPPH·是一种很稳定的自由基，当样品中存在清除剂时，其与DPPH中电子配对，使DPPH溶液被吸收而逐渐消失，DPPH溶液褪色程度与配对电子数成化学计量关系，因而可以通过分光光度法进行测定。由于饮料的颜色会对清除率的测定造成影响，故采用不同浓度的Vc溶液做对照。

蛹虫草饮料与Vc抗氧化活性分析如表4所示，蛹虫草饮料具有较强的清除DPPH自由基能力，在体积分数为10%时对DPPH·清除率就达到93.6%，与之相比Vc在20 μg/mL时清除率约为95.3%，因此对于DPPH·清除能力，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有20 μg的Vc。

2.5.2 蛹虫草饮料羟自由基(·OH)清除试验

·OH清除是利用H2O2与Fe2+产生·OH，·OH与水杨酸反应生成2,3-二羟基苯甲酸，若在反应体系中加入具有清除·OH的物质就会减少生成的·OH，通过测定吸光度计算可以得到·OH清除率。

随着饮料浓度的增加，·OH清除能力逐渐增强，由于饮料浓度的增加，其与羟自由基作用的机会增大，使羟自由基与水杨酸作用的机会降低，从而使2,3-二羟基苯甲酸的生成量降低，清除率上升。蛹虫草饮料在体积分数为10%时，·OH清除率为39.9%左右，同比Vc清除率在40 μg/mL时达到44.5% 左右。因此对于羟自由基清除能力，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有40 μg的Vc。

2.5.3 蛹虫草饮料还原力试验

饮料中存在的抗氧化剂能使铁氰化钾的Fe3+还原成Fe2+，用三氯乙酸与反应后剩余的铁氰化钾反应生成沉淀通过离心除去，排除对吸光度数值的影响，Fe2+进一步和FeCl3反应生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝，因此测定700 nm处的吸光度的高低可以间接反映抗氧化剂的还原能力大小，吸光度越大还原能力越强。

随着蛹虫草饮料和Vc浓度的增加，吸光值逐渐升高，还原能力逐渐变强，即抗氧化能力越好。蛹虫草饮料在蛹虫草浸提液体积分数为10%，还原力为0.774左右，同比Vc清除率在20 μg/mL时达到0.782左右。因此对于还原力，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有20 μg的Vc。

3 结论

本文以蛹虫草子实体浸提液为原料，通过正交试验确定蛹虫草饮料的最佳配比为蛹虫草浸提液：玫瑰花水(mL∶mL)=2∶1、10 g/L的玉米肽、80 g/L的蜂蜜、0.15 g/L的柠檬酸。此配方条件下，饮料的色泽、口感、气味等为最佳，感官评价的平均值为94.31；纤溶酶活力为2.78 U/mL；虫草素含量为12.43 μg/mL；多糖含量为199 mg/mL。对于DPPH·能力，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有20 μg的Vc；对于OH·清除能力，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有40 μg的Vc；在Fe3+还原力测定中，每毫升蛹虫草饮料中约相当于含有20 μg的Vc，具有良好的抗氧化活性。

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