葡萄酒主要经历2个发酵过程：酒精发酵(alcohol fermentation, AF)和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation, MLF)[1]，其中苹果酸-乳酸发酵是由酒酒球菌主导进行，有降低酸度、改善风味、增加生物稳定性的作用[2-3]。自然苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒由于多种微生物共同作用，可能存在生物胺含量过高、挥发酸含量过高等问题[4-5]。为了避免这些问题，可在生产过程中使用酒酒球菌发酵剂[6-7]。冷冻干燥是制备酒酒球菌发酵剂的常用方法，但菌体容易受到损伤而导致活力下降[8-9]，若在冷冻干燥过程中添加冷冻干燥保护剂则能有效降低菌体损伤，维持活力[10]。目前，我国关于酒酒球菌发酵剂及其冷冻干燥保护剂的研究较少，且过度依赖进口发酵剂，因此研究冷冻干燥保护剂对酒酒球菌发酵剂的发展有重要意义。
许多微生物在生长代谢过程中都能分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)，研究显示，EPS可以提高微生物在逆境中的抗性[11]。某些微生物自身产生的EPS能显著提高其对反复冷冻的抗性[12-14]。KIM等[15]从北极分离得到的细菌Pseudoalteromonas elyakovii所产的EPS能显著提高大肠杆菌的冷冻抗性。酒酒球菌产EPS可以增加葡萄酒香气种类，并能明显提高细菌的逆境抗性[16]，具有成为冷冻干燥保护剂的潜力[17-18]。EPS的形成受到许多因素的影响，包括碳源、氮源、初始pH等[19-20]，不同的碳氮组合显著影响细菌EPS的产量[21]，且不同的乳酸菌产EPS所需条件具有菌株依赖性[22]。
本研究从实验室保藏的优良酿酒菌株中筛选得到1株高产EPS的酒酒球菌，针对该菌株产EPS的培养基条件进行优化，以提高EPS的产量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
酒酒球菌(Oenococcus oeni)28A-1,西北农林科技大学葡萄酒学院微生物实验室保藏。
1.1.2 培养基
ATB培养基的制备参照参考文献[23]。
1.2 方法
1.2.1 酒酒球菌活化
取-80 ℃保藏的菌株接入ATB培养基，在26 ℃培养箱中培养48 h，转接2次，待用。
1.2.2 EPS提取及产量测定
参照DIMOPOULOU等[24]的方法操作，稍有改动。将培养2周的菌液离心(8 000×g，10 min)取上清，加入3倍体积95%的乙醇在4 ℃冰箱中存放过夜，离心(8 000×g，10 min)取沉淀，冷冻干燥获得酒酒球菌EPS。采用重量法测定EPS产量。
1.2.3 培养基条件对酒酒球菌EPS产量的影响
分别改变1.1.2中ATB培养基的pH值(3.8、4.3、4.8、5.3、5.8)，氮源种类(胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨和牛肉膏)及碳源种类(木糖、乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖)，将1.2.1活化后的酒酒球菌以4%接种量接种于不同培养条件的培养基中，按照1.2.2的方法测定酒酒球菌EPS的产量。选取最优氮源和碳源后，研究氮源含量(5、10、15、20、25 g/L)和碳源含量(5、10、15、20、25 g/L)对酒酒球菌EPS产量的影响。
培养基中的初始pH值、葡萄糖含量和蛋白胨含量对酒酒球菌生长代谢有重要影响，只有3者达到最适条件才能使酒酒球菌的活力达到最佳，EPS的产量达到最大。因此，以单因素试验中最优的初始pH、葡萄糖含量和蛋白胨含量进行对EPS产量影响的L9(33)正交试验，按照1.2.2的方法测定酒酒球菌EPS的产量，确定3个因素的最优组合。
1.2.4 冷冻干燥存活率
具体参照ZHAO等[17]的方法操作，稍有改动。取10 mL培养至稳定期的菌液离心(8 000×g，10 min)去上清，用无菌生理盐水洗涤2次。加入冷冻干燥保护剂1 mL混匀，于-80 ℃冰箱过夜后放入真空冷冻干燥机处理24 h，温度为-55 ℃，真空度<0.06 mbar。真空冷冻干燥前后活菌数采用平板计数法检测，如公式(1)。
真空冷冻干燥存活率
(1)
式中：Nf,真空冷冻干燥后菌悬液活菌数,CFU/mL;N0,真空冷冻干燥前菌悬液活菌数,CFU/mL。
1.2.5 冷冻干燥保护剂对酒酒球菌抗冷冻干燥能力的影响
参考张国强[25]的方法操作，确定将质量分数为10%蔗糖、10%甘露糖、10%海藻糖、10%葡萄糖、10%乳糖、5%酵母浸粉、5%甘露醇、5%EPS、2.5%谷氨酸钠和1.1.2中的ATB培养基分别作为冷冻干燥保护剂，加入离心洗涤后的菌泥中，以水作为对照组，按照1.2.4的方法检测酒酒球菌冷冻干燥存活率。
1.2.6 场发射扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察
通过场发射扫面电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)观察冷冻干燥前后酒酒球菌细胞表面的变化。冷冻干燥前的样品需离心(8 000×g，10 min)以收集稳定期前期的酒酒球菌，用无菌水洗涤3次，悬浮在体积分数为2.5%的戊二醛中,4 ℃隔夜固定后用2 mL 0.1 mol/L的PBS(pH 6.8)缓冲液浸洗4次，每次10 min。浸洗完成进行细胞脱水，用体积分数为10%、30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液各浸1次，每次15～20 min，最后用100%的乙醇浸3次，每次30 min。接着干燥细胞4 h，喷金后使用扫描电子显微镜(Nova Nano SEM-450 美国)进行观察。冷冻干燥后的样品可直接喷金进行观察，无需前处理。
通过透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察冷冻干燥前后酒酒球菌细胞内部的变化。所有样品在脱水之前(包括脱水)的操作与TEM一致，脱水后将细菌悬浮在白胶∶乙醇(1∶1)中过夜后悬浮在白胶中处理2次，分别为3和6 h。在60 ℃条件下固定48 h，进行切片，染色，最后使用透射电子显微镜(TECNAI G2 SPIRIT BIO美国)进行观察。
1.3 数据处理
试验结果采用SPSS 20.0 分析软件(上海卡贝信息技术有限公司)进行分析。
2 结果与分析
2.1 培养基条件对酒酒球菌EPS产量的影响
培养基初始pH值、碳源、氮源对微生物生长及产物代谢均有重要的影响，对其进行优化可以显著提高目标代谢产物产量。
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 初始pH
酒酒球菌是一种耐受低酸环境的细菌，能够在葡萄酒酒精发酵后的低酸环境中进行MLF[15]。因此，将初始pH值控制在3.8～5.8。由图1可知，酒酒球菌EPS产量随着初始pH值的升高先升高后降低，且当初始pH值为4.3时，EPS产量最高(96.3 mg/100 mL)。说明优化初始pH值能明显提高酒酒球菌EPS的产量。在其他乳酸菌产EPS的研究中，干酪乳杆菌在初始pH值为6.5时产生的EPS量比其他试验组有明显提高[26]，同样德氏乳杆菌在不同的初始pH值下所产生EPS的量也有明显差异[27]。
图1 初始pH值对酒酒球菌EPS产量的影响
Fig.1 Effects of initial pH value on EPS production of Oenococcus oeni
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.1.1.2 氮源种类及氮源含量
氮元素作为构成蛋白质和核酸的主要元素之一，是微生物生长的必需因素。胰蛋白、大豆蛋白、蛋白胨和牛肉膏作为酒酒球菌生长所需氮源对EPS产量的影响见图2-a。
当ATB培养基中的氮源是蛋白胨时，酒酒球菌EPS的产量明显高于其他氮源，可以达到97 mg/100 mL。培养基的氮源种类不同，酒酒球菌EPS的产量有明显差异，可能是由于蛋白胨中的氨基酸、短肽或其他因素更适合酒酒球菌，对酒酒球菌生成EPS有明显的影响，但是蛋白胨的含量是否对酒酒球菌EPS的产量有影响还需要研究。
根据酒酒球菌常用培养基中的氮源含量，设定了5～25 g/L的梯度进行试验，由图2-b可知，酒酒球菌EPS产量随着蛋白胨含量升高先升高后降低，说明蛋白胨含量过高或过低都会减少酒酒球菌EPS的产量，且当蛋白胨含量为20 g/L时，EPS产量最高(109.7 mg/100 mL)。说明ATB培养基中选择合适的蛋白胨含量能明显提高酒酒球菌EPS的产量。该结果与KANMANI等[28]研究乳酸链球菌EPS的产量时最优氮源含量的结果一致。
图2 氮源种类(a)及氮源含量(b)对酒酒球菌EPS产量的影响
Fig.2 Effects of nitrogen source (a) and peptone (b) on EPS production of Oenococcus oeni
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.1.1.3 碳源种类及碳源含量
碳源作为营养成分的一种，是影响菌体EPS产量的重要因素之一[29]。本研究选取培养基中常用的碳源以相同的含量进行试验，结果由图3-a可知，当ATB培养基中的碳源是葡萄糖时，酒酒球菌EPS的产量明显高于其他碳源，达到95.6 mg/100 mL。培养基中的碳源种类不同，酒酒球菌EPS的产量有明显差异，说明碳源种类对酒酒球菌生成EPS有明显的影响，但是碳源的含量是否对酒酒球菌EPS的产量有影响还需要试验。故选取葡萄糖作为碳源，研究其含量对酒酒球菌EPS产量的影响。
图3 碳源种类(a)及碳源含量(b)对酒酒球菌EPS产量的影响
Fig.3 Effects of carbon source (a) and glucose (b) on EPS production of Oenococcus oeni
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。
由图3-b可知，酒酒球菌EPS产量随着葡萄糖含量升高先升高后降低，说明葡萄糖含量过高或过低都会减少酒酒球菌EPS的产量，且当葡萄糖含量为15 g/L时EPS产量最高(103.1 mg/ 100 mL)。说明ATB培养基中合适的葡萄糖含量能明显提高酒酒球菌EPS的产量。
2.1.2 正交试验对酒酒球菌EPS产量的影响
选取单因素产量最高的初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量进行L9(33)正交试验，测定各因素对结果的影响大小，并选取最优培养基条件。由表1可知，酒酒球菌EPS产量影响因素的主次顺序为B>A>C，即蛋白胨含量>初始pH>葡萄糖含量。由K值可以确定生产条件的最佳组合为A3B2C2，即初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L，此时酒酒球菌能够生产119.7 mg/100 mL EPS，高于其他试验组。本试验结果明显高于DIMOPOULOU等[24]研究中酒酒球菌在未优化培养基中EPS的产量，对其他乳酸菌EPS产量的研究中发现正交试验能够显著提高EPS的产量[30]。说明正交试验优化对酒酒球菌EPS的产量有明显的提升作用。
用SPSS 20.0统计软件对正交试验结果进行方差分析见表2，因素A和B在P<0.05的水平上有显著性差异。
表1 正交试验对酒酒球菌EPS产量的影响
Table 1 Effect of orthogonal experiment on EPS production of Oenococcus oeni
实验组因素结果(A)初始pH(B)蛋白胨含量/(g·L-1)(C)葡萄糖含量/(g·L-1)产量/(mg·100mL-1)11(3.8)1(15)3(20)86.46±0.70212(20)1(10)104.2±0.95313(25)2(15)109.37±0.4542(4.3)1293.23±0.605223102.67±2.56231114.20±0.6673(4.8)11103.13±0.918322119.70±0.409333114.67±0.97K1300.03282.83321.53K2310.10326.57322.30K3337.50303.80303.80k1100.0194.28107.18k2103.37108.86107.43k3112.50101.27101.27R12.4914.586.17主次因素B>A>C最优组合A3B2C2
表2 正交试验方差分析结果
Table 2 Analysis of variance for the orthohonal array design
来源III型平方和自由度均方F值显著性A(初始pH)250.5792125.2921.507∗B(蛋白胨含量)568.8492284.42548.825∗C(葡萄糖含量)72.941236.4716.261误差11.65125.825
注：*差异显著(P<0.05)。
2.2 EPS抗冷冻干燥
2.2.1 冷冻干燥存活率试验
由图4可知，对照组(水)冷冻干燥酒酒球菌存活率为5.2%，添加保护剂试验组的酒酒球菌冷冻干燥存活率显著高于对照组，且不同保护剂的保护效果有明显差异。保护效果最好的4种保护剂是:10%蔗糖、10%海藻糖，、5%EPS、2.5%谷氨酸钠，存活率分别为49.62%、54.89%、70.97%和68.50%，此结果与张国强[25]的经2.5%谷氨酸钠、10%海藻糖、10%蔗糖及其他冷冻干燥保护剂冻干酒酒球菌后的存活率相近。
图4 不同冷冻干燥保护剂对酒酒球菌冷冻干燥存活率的影响
Fig.4 Effects of different freeze-drying protectant on survival rate of Oenococcus oeni after freeze drying
为了进一步研究4种保护效果最好的保护剂添加量对冷冻干燥存活率的影响，分别添加质量分数为5%、10%、15%、20%和25%的蔗糖和海藻糖；质量分数为0.5%、2.5%、5%、7.5%和10%的EPS和谷氨酸钠进行单一保护剂添加量的试验。
通过表3可以看出，保护剂的添加量对酒酒球菌冷冻干燥存活率影响明显，且各试验组的存活率均随着保护剂添加量的增加先升高后下降，当蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠和EPS的质量分数分别为15%、10%、2.5%和5%时酒酒球菌存活率最高，分别达77.46%、56.72%、67.17%和73.31%。其中蔗糖在浓度优化后，其保护效果明显高于优化前，其余各保护剂的最优浓度与单因素试验结果相近。
表3 冷冻干燥保护剂添加量对酒酒球菌冷冻干燥存活率能力的影响
Table 3 Effect of the amount of freeze-dried protectant on viability of Oenococcus oeni after freeze drying
保护剂质量分数/%存活率平均值/%530.77±5.301050.40±6.43蔗糖1577.46±4.012052.69±6.782539.30±6.48529.84±3.001056.72±7.38海藻糖1548.20±5.202041.64±3.452528.52±4.920.543.73±4.142.567.17±5.19谷氨酸钠5.046.12±1.327.534.34±1.8910.032.46±2.870.522.56±3.452.551.00±6.62EPS5.073.31±2.847.548.50±4.8010.031.58±2.71
2.2.2 SEM和TEM观察结果
本试验通过SEM和TEM观察酒酒球菌不同处理下细胞内部和表面的变化，以期得到EPS冷冻干燥保护的机制。选择同为糖类且冷冻干燥存活率与EPS相当的蔗糖以及水作为对照，与EPS进行比较。
比较图5第1列发现，添加EPS试验组冷冻干燥后样品(图5-A1)呈一定厚度的片状物，表面无细胞暴露，这与蔗糖试验组(图5-B1)的结果相一致；添加水冷冻干燥后的样品(图5-C1)也呈片状但表面有大量暴露在外且被压缩成薄片的细胞，还有呈石榴状的细胞团[35]，可能是这些“石榴”及“薄片”中心的细胞由于周围细胞的保护得以幸存，而位于“石榴”和“薄片”周围的细胞大量死亡，这也解释了冷冻干燥存活率试验中添加水的试验组存活率低的原因。
比较图5第2列发现添加EPS试验组(图5-A2)中拍摄到EPS的断裂层，细胞被EPS包裹如同镶嵌在EPS中，细胞表面光滑无褶皱，EPS断层表面有许多凹洞，每1个凹洞形状规则表面光滑，可能是片状物断裂后细胞掉落形成的。蔗糖实验组(图5-B2)与EPS试验组相似，但是有部分细胞有破裂现象，可能是由于蔗糖在结晶过程中会不断长大[36]导致部分细胞受到蔗糖晶体的机械损伤而破裂。在添加水的对照组(图5-C2)中可以发现“薄片”中有大量堆积在一起被压缩的细胞，图片中央的“石榴”表面的细胞有破损，且左下角有不规则的细胞，可能是破裂后的细胞。
比较图5第3、4列可以发现添加EPS试验组(图5-A3、图5-A4)中的细胞被EPS包裹，所有的细胞形态完整，未发生细胞壁破损的现象。蔗糖试验组(图5-B3、图5-B4)结果与EPS类似，但包裹细胞的保护层更薄。添加水的对照组(图5-C3、图5-C4)中的细胞有明显破裂，大量细胞内容物外泄，能看到许多细胞碎片细胞外围有少许物质包裹，推测可能是细胞产生的EPS，但产量过低，不能完全包裹细胞。
A-添加EPS的试验组；B-添加蔗糖的试验组；C-添加水的对照组；1、2列-SEM图像；3、4列-TEM图像
图5 不同处理下冷冻干燥后SEM和TEM的图像
Fig.5 The image of SEM and TEM under different processing after freeze-drying
3 结论
本试验通过酒酒球菌产EPS培养基条件的优化的研究发现，优化后的培养基能够显著提高酒酒球菌EPS的产量，并且含EPS的冷冻干燥保护剂对酒酒球菌冷冻干燥存活率有明显的提升作用，说明该保护剂能够作为高效酒酒球菌冷冻干燥保护剂。
试验结果显示，酒酒球菌EPS生产的最适碳源是葡萄糖，最适氮源是蛋白胨，且酒酒球菌EPS的产量随着初始pH、蛋白胨含量和葡萄糖含量的增加先升高后降低，在初始pH值为4.3时EPS产量最高(96.3 mg/100 mL)，葡萄糖含量为15 g/L时EPS的产量最高(103.1 mg/100 mL)，蛋白胨含量为20 g/L时EPS产量最高(109.7 mg/100 mL)。通过正交试验优化可得在初始pH值4.8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L的条件下，能够生产119.7 mg/100 mL酒酒球菌EPS。酒酒球菌冷冻干燥存活率的研究结果表明，保护效果最好的4种保护剂是15%蔗糖、10%海藻糖、5%EPS、2.5%谷氨酸钠，存活率分别为77.46%、56.72%、73.31%和67.17%。SEM和TEM的结果表明酒酒球菌EPS有冷冻干燥保护作用，能使细胞内部和外表面的形态保持完整。后续研究中，可继续深入探究EPS冷冻干燥保护的机理，以及EPS的组成和分子结构，帮助研究者了解EPS。
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