冰葡萄酒需要在特定的环境、地域、气候与工艺条件下酿造，我国是世界上最大的冰葡萄酒消费国，具有广阔的冰葡萄酒市场。国内外对冰葡萄酒的研究大多集中在发酵温度与酵母种类[1]、香气成分分析[2-3]、酿造工艺[4]等方面，而对冰葡萄酒色泽的研究未见报道。GB/T 15037—2006《葡萄酒》中提出色泽是评价葡萄酒品质的重要指标。目前，国内改善葡萄酒色泽主要是通过优化浸渍时间、使用护色单宁和浸渍酶等方法[5]，这些研究取得了一定的成果，但使用刺葡萄混酿来改善巨峰冰葡萄酒色泽与品质的研究鲜有报道。
刺葡萄是我国主要野生葡萄品种之一，主要分布在湖南、广西等地。刺葡萄果肉小、皮厚实，作为食用鲜果，其市场受到一定限制，但刺葡萄呈紫黑色、果皮富含花色苷和生物酚，且产量高、成本低，适宜酿造特色的刺葡萄红酒[6]。刺葡萄皮色素——花色苷，是一种安全无毒的天然食用色素，具有强抗氧化性、活血、抗肿瘤、抗过敏等多种保健功能，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域[7]。且花色苷是红葡萄酒中的呈色物质，是决定葡萄酒品质和感官质量的重要指标之一[8]。有研究表明，花色苷可用于葡萄酒及饮料的调色[9]。因而，利用富含花色苷的刺葡萄与巨峰葡萄混酿来改善巨峰冰葡萄酒色泽与品质的研究有重大意义。
在前期实验中，以巨峰葡萄为原料酿造巨峰冰葡萄酒，通过冷冻浓缩至含糖量为350 g/L和400 g/L，用250 mg/L的二甲基二碳酸盐(dimethyl dicarbonate, DMDC)和200 mg/L的亚硫酸盐作前处理杀菌剂。结果表明：350 g/L含糖量的葡萄酿造的巨峰冰葡萄酒有更好的香气和口感；DMDC能更好地抑制微生物生长、提高糖的利用率、提高酒精度、降低挥发酸含量，但DMDC组花色苷含量较低、酒体外观色泽略差。
为了改善巨峰冰葡萄酒的色泽与品质，本文以巨峰葡萄和富含花色苷的刺葡萄为原料，混合发酵酿造巨峰冰葡萄酒，分析比较了不同比例刺葡萄混酿对发酵期间花色苷、总酚、色差、总糖、可溶性固形物、酒精度、pH值、总酸、挥发酸等理化指标及酒体感官品评的影响，以期探讨刺葡萄混酿对巨峰冰葡萄酒色泽与品质的影响，同时也为更好地综合开发利用刺葡萄资源提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巨峰葡萄、刺葡萄，购于本地市场；活性干酵母KD，法国LALLEMAND公司；二甲基二碳酸盐,德国朗盛化学品公司；果胶酶(酶活力50 000 U/g)，宁夏和氏璧生物技术有限公司；福林-酚试剂,北京索莱宝科技有限公司；KCl,天津市风船化学试剂科技有限公司；HCl、结晶乙酸钠、乙酸,天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MJ-WBC2521H型水果榨汁机，广东美的生活电器制造有限公司；FCD-208XHT型电冰柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司；LYT-380型糖度计，上海淋誉公司；PHS-3BW型酸度计，上海般特仪器制造有限公司；ZD-2型自动电位滴定仪，上海康仪仪器有限公司；HP-206型色差仪，瑞戈(上海)实业有限公司；UV-VIS型紫外分光光度计，美国安捷伦科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 原料处理与巨峰冰葡萄酒酿造
共设4个试验组，将巨峰葡萄和刺葡萄按质量比3∶0、1∶2、2∶1、1∶1的比例混合均匀，各组通过浓缩调整糖度至350 g/L,分别添加250 mg/L的DMDC前处理2 h。然后将0.25 g/L活性干酵母kD活化后接种到处理2 h的葡萄浆醪中，同时添加质量浓度2 g/L的果胶酶，置于15 ℃条件下发酵，酒精度达到12%～13% vol时终止发酵，连续11 d每隔48 h取样测定其理化指标。
1.3.2 试剂的配制
斐林试剂参照GB/T 603—2002配制；0.05 mol/L、0.02 mol/L NaOH试剂按GB/T 601—2016配制；
pH 1.0的HCl-KCl缓冲液的配制：V(0.2 mol/L HCl)∶V(0.2 mol/L KCl)=25∶67；
pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液的配制：V(0.2 mol/L 醋酸)∶V(0.2 mol/L 醋酸钠)=1∶1。
1.3.3 理化指标的测定
可溶性固形物：采用糖度计直接测定；
总糖：参照GB/T 15038—2006，采用直接滴定法测定；
酒精度：参照GB/T 15038—2006，采用酒精计法；
pH值：采用酸度计直接测定；
总酸：参照GB/T 15038—2006，采用电位滴定法，结果以酒石酸计；
挥发酸:参照GB/T 15038—2006，稍作改动,用浓度为0.02 mol/L的NaOH滴定液进行滴定，结果以乙酸计；
花色苷：采用pH示差法[10]。分别用pH值为1.0的HCl-KCl缓冲液和pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释样品，分别在510 nm和700 nm波长下测吸光度，结果用矢车菊素-3-葡萄糖苷计。按公式(1)计算花色苷的含量。
TA/(mg·L-1)=A×MW×DF×103/ε×1
(1)
式中：TA，花色苷的含量；A=(A520-A700) pH 1.0-(A520-A700) pH 4.5；MW=449.2 g/mol(矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量)；ε=26 900 L/(mol·cm)(矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数)；DF指稀释因子(样品总的稀释倍数)；1指1 cm。
总酚：采用Folin-Ciocalteus法[11]，稍作改进。称取样品匀浆(2.00±0.01) g，用80 mL水洗入100 mL容量瓶中，100 ℃沸水浴30 min,取出冷却，定容，过滤，滤液备用。吸取1.0 mL处理后的样品溶液，分别加入水5.0 mL、FC显色剂1.0 mL和质量浓度75 g/L Na2CO3溶液3.0 mL，显色，放置2 h后，在765 nm测定样品的吸光度，根据标准曲线计算出样品中总多酚的浓度，结果以一水合没食子酸计。测得的标准曲线为Y=0.006 36x+0.012 7(Y表示吸光度值，x表示相应的一水合没食子酸浓度)。
色差：采用自动色差仪直接测定，以ΔE*作为色泽考察指标。按公式(2)计算总色差ΔE*值。
ΔE*= [(L-L0)2+(a-a0)2+(b-b0)2]1/2
(2)
式中：L、a、b表示发酵液样品色差值；L0、a0、b0为前处理前实验样品的色差值。
1.4 感官评定方法
每组取一定量的供试巨峰冰葡萄酒样品，其评分标准如表1所示。由10人品评小组分别从色泽和外观、香气和滋味3个方面对实验酒样进行品评，并对每个评定指标求平均值后统计总分。
表1 巨峰冰葡萄酒的品评标准
Table 1 Rating criteria for kyoho ice wine
指标分值/分评分标准色泽和外观(40分)27～40呈宝石色,酒体澄清、透明13～26呈紫黑色,酒体较透明0～12呈桃红色,酒体稍浑浊香气(30分)20～30具有纯正、优雅、和谐的果香和酒香10～19具有一定的果香和酒香,无异味0～9果香和酒香无或较少,有明显异味滋味(30分)20～30酒体丰满,醇厚协调,回味绵延10～19酒体较柔顺,柔和爽口,酸甜较适宜0～9酒体口感略显粗糙,酸甜不适宜
1.5 数据处理
所有试验均重复3次，数据结果采用统计软件SPSS 17.0进行方差分析,并用Microcal Origin 8.0软件制图，显著性水平取0.05，数值以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒发酵过程中花色苷和总酚含量的影响
颜色是红葡萄酒感官品质的重要指标，而花色苷是红葡萄酒呈色的主要化合物，对葡萄酒的颜色起着决定作用[12-13]。同时，众多研究指出花色苷具有很强的抗氧化作用，表现出很好的生理活性[14,15]。由图1-A可知，不同比例刺葡萄混酿组花色苷含量显著高于巨峰葡萄组(P<0.05)，刺葡萄所占比例越高，花色苷含量越高。巨峰葡萄组在发酵过程中花色苷含量最多为41.92 mg/L，而混酿1∶1组和混酿1∶2组在发酵过程中花色苷含量分别达到208.50和262.29 mg/L，这是由于刺葡萄本身花色苷含量高；或是在新酿制的葡萄酒中，花色苷主要以游离的单体形式存在，极少数花色苷发生聚合反应[16]，故混酿组花色苷含量高。在整个发酵过程中，各组花色苷含量呈现先增加后减少的趋势，这可能是由于发酵前期葡萄果皮中的大部分花色苷转移到巨峰冰葡萄酒中，导致花色苷含量增加，至发酵后期，少数花色苷和丙酮酸、乙醛、蛋白质、多糖等分子发生聚合反应，使花色苷含量减少[8]。
葡萄酒中酚类物质包括花青素、花色苷、酚酸、白藜芦醇及其衍生物、黄酮醇、黄烷醇及黄酮类化合物，不仅影响葡萄酒的感官特征，还影响葡萄酒的生物活性，是葡萄酒中的重要组成成分[17]。由图1-B可知，在整个发酵过程中，不同比例刺葡萄混酿组的总酚含量均高于巨峰葡萄组，但各混酿组间总酚含量无显著性差异(P≥0.05)。同时，各组发酵醪中总酚含量在发酵前期出现大幅度降低，且在整个过程中出现波动，这可能是由于发酵浆醪中花色苷、花青素、酚酸等各类物质的聚合，或是酚类物质的酶促或非酶促反应的发生[18]，具体变化机理有待进一步研究。
图1 不同比例混酿期间花色苷(A)、总酚(B)含量的变化
Fig.1 Changes of anthocyanin (A) and total phenol (B) content during mixing of different proportions
注：同一时间点字母不同，表示显著性性差异(P<0.05)。下同。
2.2 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒发酵过程中色泽的影响
色泽和色度是评价葡萄酒的重要指标。由图2-A可知，各实验组L值在整个发酵期间相对于原醪均大幅度降低，且第3天后不同比例刺葡萄混酿组L值显著低于巨峰葡萄组(P<0.05)，说明不同比例刺葡萄混酿组较巨峰葡萄组酒体亮度降低，因而酒体颜色加深。
图2 不同比例混酿期间L值(A)、a值(B)、色差值(C)含量的变化
Fig.2 Changes in L value (A), a value (B) and chromatic aberration value (C) content during mixing of different proportions
由图2-B可知，各组a值在整个发酵期间相对于原醪均大幅度降低，说明进入发酵周期后各组红色色调相对原醪减少。在前3 d，混酿1∶2组a值显著高于1∶1组(P<0.05)，第5天至发酵结束，混酿1∶2组a值显著低于1∶1组(P<0.05)，这可能是由于混酿1∶2组中高含量的花色苷在前3 d与酚酸、黄烷醇、黄酮醇等酚类物质生成辅色复合物，但辅色复合物的稳定性较差，易分解[19]，这导致在发酵结束时，混酿1∶1组a值最大(P<0.05)，红色色调最高，颜色最红。
由图2-C可知，混酿2∶1、混酿1∶1组色差值均高于混酿1∶2组和巨峰葡萄组(P<0.05)，且混酿1∶1组色差值最大，高达17.16，这是由于在发酵过程中酒体亮度和色调的综合变化结果所致。
2.3 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒发酵过程中总糖和可溶性固形物含量的影响
由图3可知，随着发酵时间的延长，各组发酵浆醪中的总糖和可溶性固形物含量逐渐降低，刺葡萄比例越高，残糖含量越高，糖消耗速率越低，这可能是由于在刺葡萄混酿组中酵母繁殖速度缓慢，故糖的消耗量少，残糖含量高。在整个发酵过程中，除第5天外，不同比例刺葡萄混酿组和巨峰葡萄组的总糖含量无显著性差异(P≥0.05)，且不同比例刺葡萄混酿组间可溶性固形物含量无显著性差异(P≥0.05)。巨峰冰葡萄酒混酿过程中总糖的变化规律符合已知的冰葡萄酒酿制过程的总糖变化规律[4,20]，说明添加不同比例的刺葡萄与巨峰葡萄混合发酵几乎不影响巨峰冰葡萄酒发酵浆醪中的总糖含量，证实这是一种可行的冰葡萄酒酿造方法。
图3 不同比例混酿期间总糖(A)、可溶性固形物(B)含量的变化
Fig.3 Changes in total sugar (A) and soluble solids (B) during mixing in different proportions
2.4 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒发酵过程中酒精度的影响
由图4可知，发酵3 d后酵母消耗糖开始产生酒精，随着发酵时间的延长，各组酒精度逐渐增加。发酵结束时，酒精度含量由高到低依次为巨峰葡萄组、混酿2∶1组、混酿1∶1组、混酿1∶2组，分别为13.95%、12.85%、12.45%、11.45% vol，即刺葡萄比例越高，酒精度越低。由上文可知，刺葡萄比例越高，酵母消耗的糖越少，故转化为酒精的糖含量也相应减少，进而导致酒精度降低。在整个发酵过程中，混酿2∶1组、混酿1∶1组酒精度和巨峰葡萄组无显著性差异(P≥0.05)，说明添加刺葡萄混酿几乎不影响巨峰冰葡萄酒酒精度。巨峰冰葡萄酒混酿过程中酒精的生成规律符合已知的冰葡萄酒酿造过程的酒精度生成规律[4,20]。
图4 不同比例混酿期间酒精度的变化
Fig.4 Changes in alcohol content during mixing at different ratios
2.5 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒发酵过程中总酸、pH值和挥发酸含量的影响
葡萄中的有机酸主要包括酒石酸、苹果酸和柠檬酸，还有少量的乙酸、抗坏血酸、乳酸等，其中，酒石酸是葡萄和葡萄酒中最主要的成分，也是葡萄酒中酸味的主要来源，对葡萄酒的稳定性有着重要的作用。由图5-A可知，整个发酵过程中，各组总酸含量维持在5.84～8.15 g/L，且不同比例刺葡萄混酿组和巨峰葡萄组总酸含量无显著差异(P≥0.05)，这可能是由于酒石酸在葡萄酒中易形成酒石酸盐沉淀，其难溶于酒精，且在低温下溶解度大幅度降低[21]，导致各组发酵浆醪中的总酸含量较低。由图5-B可知，刺葡萄的添加对巨峰冰葡萄酒的pH值有一定影响，刺葡萄比例越高，pH值越低。一般而言，刺葡萄酿造的葡萄酒含酸量较高、口感不协调。而本研究结果说明添加刺葡萄和巨峰葡萄混合发酵几乎不影响巨峰冰葡萄酒中的有机酸含量。
挥发酸含量的高低是衡量葡萄酒品质优劣、酿造工艺是否合理的重要指标，过高的挥发酸含量会使葡萄酒出现腐败味，降低葡萄酒的品质[20,22]。GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》规定冰葡萄酒挥发酸含量低于2.1 g/L。由图5-C可知，在整个发酵过程中，各组挥发酸含量逐渐升高，但含量均远低于2.1 g/L，符合标准要求。不同比例刺葡萄混酿组和巨峰葡萄组挥发酸含量无显著性差异(P≥0.05)，说明添加刺葡萄混酿不会增加巨峰冰葡萄酒中挥发酸的含量，不会影响酒体品质。
图5 不同比例混酿期间总酸(A)、pH值(B)、挥发酸(C)含量的变化
Fig.5 Changes of total acid (A), pH (B)and volatile acid (C) during mixing in different proportions
2.6 不同比例混酿对巨峰冰葡萄酒感官品评的影响
由表2可知，混酿1∶1组感官品评分最高，总分达到78分，显著高于其他混酿组(P<0.05)，呈典型的宝石红色，酒体澄清、透明，口感醇厚协调、回味绵延，且具有优雅的果香和酒香；其次是混酿2∶1组、混酿1∶2组、混酿3∶0组(巨峰葡萄组)，感官品评分分别为64分、49分、42分；混酿1∶2组和巨峰葡萄组感官品评分较低，分别表现为口感略显粗糙、有一定的酸感和酒体色泽较差。综合而言，混酿1∶1组不仅能改善巨峰冰葡萄酒的色泽，还能改善其口感。
表2 不同比例刺葡萄混酿巨峰冰葡萄酒的感官品评得分
Table 2 Sensory evaluation scores of different proportions of Vitis davidii Foex mixed kyoho ice wine
处理组感官品评分/分色泽和外观香气滋味总分/分3∶0组10±1.19c17±1.47b15±2.04b42±1.56c1∶2组18±1.05b23±2.25a8±1.41c49±1.09c2∶1组30±1.03a18±2.16b16±1.47b64±2.15b1∶1组32±2.73a24±1.87a22±2.09a78±2.79a
注：同列字母不同表示显著性差异(P<0.05)。
3 结论
研究不同比例刺葡萄混酿对巨峰冰葡萄酒的色泽和品质的影响，发现不同比例刺葡萄混酿组花色苷含量、总酚含量、色差值显著高于巨峰葡萄组(P<0.05)，且巨峰葡萄与刺葡萄按1∶1混酿时色差值和感官品评分值达到最大，但不同刺葡萄比例混酿组总糖、总酸、挥发酸含量与巨峰葡萄组无显著性差异(P≥0.05)，说明添加刺葡萄混酿能显著提高发酵浆醪中的花色苷含量、总酚含量与色差值(P<0.05)，以达到改善色泽和口感的目的；同时，不同比例刺葡萄混酿组间的总糖、可溶性固形物、总酸、挥发酸、总酚含量无显著性差异(P≥0.05)。
综上，确定巨峰葡萄与刺葡萄按1∶1的比例混酿能更好地改善巨峰冰葡萄酒的色泽和口感，且不影响巨峰冰葡萄酒的理化品质。同时，说明刺葡萄是可以替代部分巨峰葡萄进行巨峰冰葡萄酒酿造，以达到改善巨峰冰葡萄酒色泽的目的，也为刺葡萄及普通红葡萄资源的利用提供了一条潜在且有效的途径。
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