三聚氰胺(2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪，C3H6N6)，俗称蛋白精、密胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物[1-3]。现代医学研究表明，三聚氰胺会损害肾功能，导致急性肾功能衰竭，甚至死亡[4-6]。由于三聚氰胺的氮含量高(约66.66%)，不少无良商贩为了降低生产成本，在牛奶中违法添加三聚氰胺来提高牛奶的氮含量。
迄今为止，常规检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、离子色谱法、分光光度法和酶联免疫吸附法(ELISA)等[7-8]。然而，上述方法虽然可以进行准确地定性及定量分析，但是也存在着一些缺点，例如操作条件苛刻(只能在试验室进行检测)、处理步骤繁琐、检测时间长以及耗材成本高等[9]。因此，开发一种便捷、简单、快速、经济地检测牛奶中三聚氰胺的方法具有重要的应用价值与实际意义。
近年来，表面增强拉曼散射技术由于其灵敏度高和检测速度快而备受关注[10-11]，一直被认为是化学和生物传感应用的强大分析技术。目前，已经有许多研究利用SERS技术对三聚氰胺进行快速检测[12]。使用的SERS活性基底主要有银溶胶、金/银纳米粒子、高效金纳米SERS传感芯片、以金纳米微球组成的空穴金片、以银-金合金制备的空心纳米管等[13]。其中，银溶胶的制备方法较为简单，增强活性比金和铜高[14]，是一种常见的基底。有研究表明，含能电离氯离子(Cl-)的水溶液使银溶胶凝聚，碱性溶液可以促使三聚氰胺与银溶胶结合，从而大幅度增强SERS信号[15]。赵蕊池等[16]采用多元醇法合成、流体流动法组装制备的有序纳米银线基底来增强拉曼信号，实现了样品中痕量三聚氰胺的快速灵敏检测，检测限可达0.05 mg /L。但该方法需要将样品进行干燥处理，延长了检测时间；同时在样品溶液蒸发干燥过程中容易出现“咖啡环效应”，导致拉曼信号不稳定。
本文以50 nm的银纳米颗粒为基底，通过研究不同材料的衬底、银溶胶与样品的比例、NaCl浓度、NaOH浓度对SERS信号的影响确定最适的拉曼光谱检测条件。以期实现对牛奶中三聚氰胺的实时、快速检测，提升检测效率的同时避免“咖啡环效应”。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蒙牛纯牛奶、伊利纯牛奶、燕塘纯牛奶，湛江市霞山区沃尔玛超市。
AgNO3、三聚氰胺、三氯乙酸、柠檬酸钠，美国sigma-Aldrich公司；NaCl、NaOH、HCl、H2SO4，廉江市爱廉化试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
超纯水一体机(D24-UV)，上海君翼仪器设备有限公司；万分之一电子天平(JJ124BC)，常熟市双杰测试仪器厂；台式高速冷冻离心机(Sigma3K15)，北京科普顺科技有限公司；透射电子显微镜(JEOL 1400)，日本电子公司；紫外可见分光光度计(U-3900H)，日本日立公司；便携式拉曼光谱仪、拉曼支架(SR-510 Pro)，美国海洋光学亚洲公司。
1.3 方法
1.3.1 银溶胶的制备
根据文献报道的方法[17]：取100 mL质量浓度为0.18 g/L AgNO3溶液于洁净的玻璃容器中，在120 ℃下缓慢搅拌至沸腾，迅速加入2 mL质量浓度为10 g/L柠檬酸钠溶液混匀，继续在沸腾条件下搅拌1 h后反应终止并冷却至室温。过0.22 μm水系膜得到均一相的银溶胶，在4 ℃下避光储存，备用。
1.3.2 三聚氰胺标准溶液的制备
准确称取0.1 g三聚氰胺溶解，定容于100 mL容量瓶中。将其稀释成不同质量浓度(100、10、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.001 mg/L)的三聚氰胺标准溶液，在4 ℃下避光储存，备用。
1.3.3 样品的预处理及光谱采集
将15 mL牛奶与10 mL质量浓度为200 g/L三氯乙酸充分混合后加入到50 mL离心管中静置30 min，使蛋白质沉淀。随后以8 000 r/min离心5 min，取上清液过滤后备用。
依次取60 μL银溶胶、60 μL NaCl溶液(4 mol/L)、60 μL NaOH溶液(4 mol/L)和120 μL不同品牌的牛奶于1.5 mL离心管中混匀，取90 μL混合液滴于钛板的圆柱形凹槽中，迅速采集拉曼光谱。
1.3.4 SERS检测
使用便携式拉曼光谱仪收集拉曼光谱，激发波长785 nm；光谱扫描200～3 000 cm-1；探头工作距离7.5 mm；光斑直径小于2 mm；积分时间5 s；使用软件自带扣除背景信号功能。同时，采用该公司提供的SERS基片专用支架。SERS的测量均采集7次求平均值。除非另有说明，在测量条件的优化中，三聚氰胺的质量浓度为0.1 mg/L。
2 结果与分析
2.1 银溶胶的表征
本试验所制备的银溶胶呈黄绿色，经超纯水稀释10倍后，用紫外可见分光光度计检测其吸收光谱见图1-a。从图1-a中可知，银溶胶的最大吸收峰位于405 nm，与参考文献相符[15]。此外，其半峰宽较窄，且未出现杂峰，表明本实验所制备得到的银溶胶纳米颗粒分散性良好并且粒径分布均匀[18-19]。
本文使用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)对银溶胶中纳米颗粒的形貌和大小进行了表征，如图1-b所示，大部分银纳米颗粒的直径约50 nm。向银溶胶中加入4 mol/L NaCl溶液混匀，颜色由青灰色逐渐转变为灰色，此时银纳米颗粒开始凝聚，为除去NaCl经15 h的透析处理，取沉淀溶于1 mL超纯水，超声5 min。TEM表征见图1-c，银纳米颗粒大量聚集，可以产生足够增强等离子体共振的“热点”，从而起到很好的放大SERS信号的效果。
a-银溶胶的紫外-可见吸收光谱；b-银溶胶的TEM图片；c-银溶胶聚集后的TEM图片
图1 银溶胶的表征
Fig.1 Characterization of silver colloid
2.2 三聚氰胺粉末的常规拉曼检测
如图2所示，在钛片上获得三聚氰胺粉末的常规拉曼光谱。从图中可知，在374 cm-1、577 cm-1、672 cm-1、777 cm-1、982 cm-1、1 447 cm-1、1 559 cm-1等处出现了三聚氰胺拉曼特征峰。由于三聚氰胺的三嗪环呼吸振动[20]，拉曼峰在672 cm-1时强度最高，本实验以此处的特征峰作为识别三聚氰胺的指纹峰。
图2 三聚氰胺粉末的常规拉曼光谱图
Fig.2 Raman spectra of melamine powder
2.3 SERS衬底材料的选择
迄今为止，已经报道过多种材料作为SERS衬底，如硅片、载玻片、铝片等[21-23]。因此，为了比较几种不同材料的衬底对SERS检测的效果，本实验保持其他参数一致，采用不同材料的衬底，采集了三聚氰胺溶液的SERS光谱。
图3 SERS衬底材料的选择
Fig.3 SERS substrate material selections
由图3可知，载玻片作为衬底时，由于背景信号干扰性较强，三聚氰胺的SERS光谱特征峰最弱；又因疏水角小，液滴易展开，导致液滴高度降低，焦点无法聚集在样品上，SERS的响应也因此下降。硅片在516 cm-1处有一个硅元素的拉曼峰，且在1 500～3 000 cm-1有宽阔的荧光背景，低浓度样品中会掩盖三聚氰胺1 558 cm-1处的特征峰。虽然铝片作为衬底时，得到的SERS光谱特征峰很强，但鉴于NaOH能与铝片反应，不仅会产生气泡，而且另一产物偏铝酸钠是一种速凝剂，也会影响银溶胶的凝聚。金属钛因其化学性质稳定，且SERS信号较强，故选择钛板作为SERS衬底材料。将待测液滴于钛板的圆柱形凹槽中，来维持液滴的高度，从而得到更稳定的SERS信号。
此外，与三聚氰胺粉末的常规拉曼光谱相比，SERS光谱中三嗪环呼吸振动峰由672 cm-1红移到699 cm-1，发生了27 cm-1的频移，C-N-C弯曲振动峰由982 cm-1红移到1 069 cm-1，发生了87 cm-1的频移，其他的拉曼峰也发生了不同程度的频移。这种频移现象可能是由碱性银胶的SERS增强效应引起的。
2.4 检测条件的优化
银溶胶是一种液态的SERS基底，通常会受到多因素的干扰。因此，在保持三聚氰胺SERS混合液滴高度不变的前提下，依次探究了银溶胶与样品的体积比、NaCl浓度及NaOH浓度对三聚氰胺SERS强度的影响。从图4-a可知，当样品用量不足时，三聚氰胺所占的比例降低，致使检测结果不准确；当样品用量过多时，碱性银胶不足以提供丰富的热点，三聚氰胺的SERS信号无法得到充分增强；当银溶胶与样品的比例为1∶2时，三聚氰胺SERS光谱上699 cm-1处的SERS信号得到最大增强。图4-b显示出三聚氰胺的SERS特征峰强度随着NaCl浓度的增大而增大，当NaCl浓度超过4 mol/L后，不再有明显的变化。因此使用NaCl溶液的浓度为4 mol/L。图4-c表明，拉曼特征峰强度随着NaOH浓度的增大而增大，但当NaOH浓度超过4 mol/L后，特征峰的强度下降。因此NaOH溶液的最适浓度为4 mol/L。
图4 银溶胶与样品的体积比(a)、NaCl浓度(b)、NaOH 浓度(c)对三聚氰胺SERS光谱强度的影响
Fig.4 The effects of the volume ratio of silver colloid to sample(a) the NaCl concentration (b) and the NaOH concentration (c) on SERS spectra intensity of melamine
2.5 水中灵敏度的评估及SERS增强因子的计算
根据上述优化后的条件，确定了各成分的最佳参数。依次取60 μL银溶胶、60 μL 4 mol/L NaCl溶液、60 μL 4 mol/L NaOH溶液和120 μL不同浓度三聚氰胺溶液于1.5 mL离心管中混匀，取90 μL混合液滴于钛板的圆柱形凹槽中，迅速采集拉曼光谱(图5-a)。从图中可知，水溶液中三聚氰胺的质量浓度低至0.001 mg/L时，仍可以在SERS光谱上观察到明显的特征峰。在0.01～0.5 mg/L，SERS强度随着三聚氰胺浓度的增大呈对数增强(图5-b)，得到拟合线性方程y=130 417.384+55 207.529x，线性相关系数R2=0.982。
a-水溶液中不同浓度的三聚氰胺SERS光谱；b-水溶液中三聚氰胺溶液的标准曲线
图5 三聚氰胺的拉曼线性报告
Fig.5 Raman linear report of melamine concentrations in aqueous solution
为了计算银溶胶的SERS增强因子(enhancement factor, EF)，本文分别测量了质量浓度103 mg/L三聚氰胺溶液的常规拉曼光谱和0.1 mg/L的三聚氰胺溶液的SERS光谱，其积分强度分别为3 895.511 counts和876 614.919 counts，如图6所示。SERS增强因子的计算如公式(1)所示。
(1)
式中，ISERS、CSERS是SERS光谱中三聚氰胺特征峰的积分强度和相对应的三聚氰胺的浓度；INR、CNR分别是常规拉曼光谱上三聚氰胺特征峰的积分强度和相对应的三聚氰胺的浓度。EF值越大，表明SERS信号增强作用越明显。由公式(1)计算出银溶胶的增强因子为2.25×106。
图6 103 mg/L三聚氰胺溶液常规拉曼光谱和0.1 mg/L三聚氰胺溶液SERS光谱
Fig.6 Normal Raman spectra of 103 mg/L melamine and SERS spectra of 0.1 mg/L melamine
2.6 牛奶中三聚氰胺LOD值评估及实际应用
依次取60 μL银溶胶、60 μL 4 mol/L NaCl溶液、60 μL 4 mol/L NaOH溶液和120 μL不同浓度三聚氰胺加标牛奶于1.5 mL离心管中混匀，取90 μL混合液滴于钛板的圆柱形凹槽中，迅速采集拉曼光谱(图7-a)。由图可知，在699 cm-1处的拉曼峰值随着加入三聚氰胺浓度的增大而增大。由此，计算出在质量浓度0.2～10 mg/L牛奶中三聚氰胺的浓度与拉曼强度之间呈线性关系(图7-b)，即y=173.06x+570.8，R2=0.998。依据公式LOD = 3SD / k计算出利用表面增强拉曼技术能够检测到牛奶中三聚氰胺含量的最低浓度为0.08 mg/L,其中SD和k分别是可检测到最低样品浓度的标准偏差和校准曲线的斜率。
a-牛奶中不同浓度的三聚氰胺SERS光谱；b-牛奶中三聚氰胺溶液的标准曲线；c-实际样品的检测
图7 牛奶中三聚氰胺的SERS检测
Fig.7 SERS detection of melamine in milk
本文检测了3种常见市售纯牛奶的三聚氰胺含量，其SERS光谱如图7-c所示。3种市售纯牛奶的SERS光谱除了在609、699、865、903、1 426 cm-1等处出现明显的拉曼峰，在701 cm-1处同样有较低的拉曼峰，这些拉曼峰来源于牛奶中的其他成分[24]。在1 mg/L三聚氰胺加标牛奶的SERS光谱中，699 cm-1处的拉曼特征峰的强度比未加标的3种纯牛奶高。依据《公告》规定[25]，婴儿配方食品中三聚氰胺含量不得超过1 mg/L，其他食品中不得超过2.5 mg/L。且根据线性方程计算得出3种市售牛奶三聚氰胺含量均未超标。
2.7 重复性与稳定性的研究
信号不稳定在拉曼检测中是一种常见的现象，这是由于制作SERS基底过程中纳米颗粒分布不均匀造成的。而重现性又影响到体系检测的效率，为研究本方法的重现性，将1 mg/L加标牛奶平行测量20次，统计拉曼光谱如图8-a所示。在699 cm-1处的拉曼峰值相对标准偏差(RSD)为4.34%，表明在该基底下牛奶中三聚氰胺的拉曼信号具有良好的重现性。将银溶胶放置在4 ℃下保存11个月后进行超声处理，对同一批次的加标牛奶测量20次拉曼强度(图8-b)，计算出RSD=6.28%。由此证明该方法具有良好的重现性和稳定性。
a-1mg/L加标牛奶的SERS光谱；b-放置11个月基底测量1mg/L加标牛奶的SERS光谱
图8 SERS光谱的重复性与稳定性
Fig.8 The repeatability and stability of melamine SERS spectra
3 结论
本研究所制备的银溶胶中大部分银纳米颗粒的直径约50 nm，颗粒分散性好，在聚集后产生的“热点”可使SERS增强因子达到2.25×106。通过测量方案的优化，确定了实验条件中各成分的最佳参数。在0.01～0.5 mg/L，测试了不同浓度三聚氰胺水溶液在699 cm-1处的SERS光谱，其拟合线性方程y=130 417.384+55 207.529x，R2=0.982。在0.2～10 mg/L，SERS强度随着牛奶中三聚氰胺浓度的增大而增强，拟合线性方程y=173.06x+570.8，线性相关系数R2=0.998。此外，计算出该方法的检测限为0.08 mg/L。与1 mg/L三聚氰胺加标牛奶相比，燕塘、伊利以及蒙牛纯牛奶中三聚氰胺含量均未超标，此法可以用于牛奶中三聚氰胺含量的快速检测。在重复测量20次1 mg/L加标牛奶后得出相对标准偏差为4.34%，证明了该方法具有良好的稳定性。
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