辣椒作为常见的辛辣味调味品和着色剂，在全世界被广泛种植。辣椒素类成分是辣椒中主要呈味物质，辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类总量的90%[1]。气候、土壤和种植习惯的差异，使得市场上辣椒品种繁多，辣度存在明显差异。此外，不同人群对辣感的可接受程度差异也较大。为了对目标人群进行精准销售，对辣椒及其制品的辣度进行快速质量监控很有必要。目前报道的对辣椒素类化合物的测定方法主要包括紫外-可见光谱法[2]，高效液相色谱法[3]，高效液相色谱-串联质谱法[4]，荧光光谱法[5]，酶联免疫法[6]，电化学分析法[7]。然而上述方法大都需要复杂的样品前处理，或者需要经过色谱分离，费时费力。
实时直接质谱(direct analysis in real time mass spectrometry, DART-MS)是由美国CODY等[8]发明的一种开放式离子化质谱技术。其基本原理是利用He等气体分子在高压放电条件下转变为激发态，使待测样品分子发生潘宁电离，并将待测物分子离子导入质谱检测器中进行检测[9]。该技术优点在于不需要色谱分离，能够瞬间得到分析数据。此外，样品可以在开放式环境中直接导入质谱，简化了样品前处理步骤，其结构如图1所示。近年来DART-MS应用已逐渐拓展到医药、化工和食品等领域[10-11]。迄今为止，对辣椒及其制品的辣度快速检测尚不多见。因此，本研究拟开发一种基于DART-MS技术的辣度的高通量评价方法。
①-DART离子源；②-自动进样装置；③-质谱检测器
图1 DART-MS检测系统
Fig.1 DART-MS determination system
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜辣椒、泡椒以及郫县豆瓣酱样品,购于成都郫都区某超市。
辣椒素，二氢辣椒素标准品(纯度≥98%)，成都瑞芬思有限公司；乙腈(色谱纯)，天津科密欧化学试剂有限公司；高纯He(≥99.999%)、高纯N2(≥99.999%)，四川梅塞尔气体产品有限公司。
1.2 仪器与设备
DART SVP离子源，美国IonSense公司；AB SCIEX 3500三重四级杆质谱仪，美国AB SCIEX公司；VORYEX 3涡旋混匀器，德国IKA公司；Heto-HSC 500真空冷冻干燥机，上海佰蕾真生物科技有限公司；高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；TD-5M离心机，四川蜀科仪器有限公司；KQ-100DZ数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
将样品辣椒切成小段，冻干，高速粉碎机粉碎，经100目标准筛过筛，称取冻干样品0.500 g于15 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈溶解，涡旋60 s，常温条件下超声提取20 min，在4 000 r/min条件下离心15 min，取上清液经0.22 μm微孔有机滤膜过滤后装入样品瓶中。
1.3.2 标准溶液的制备
(1)辣椒素和二氢辣椒素标准储备液
精确称取1.00 mg辣椒素标准品和二氢辣椒素标准品，加入2 mL乙腈溶解，配制成0.50 mg/mL的标准储备液，保存于-20 ℃条件下备用。
(2)混合标准使用溶液的制备
移取不同体积的辣椒素和二氢辣椒素储备液，用乙腈稀释配制成质量浓度分别为50.0、25.0、12.5、5.0、0.5 μg/mL的辣椒素标准溶液和50.0、25.0、12.5、5.0、0.5 μg/mL二氢辣椒素标准溶液的混合标准溶液。
1.3.3 质谱条件
DART SVP离子源条件：解吸气体温度为450 ℃；工作气体和预备气体分别为He和N2；气体压力为0.5 MPa；栅网电极电压为200 V；DART离子源与质谱仪之间的距离为2.8 cm；样品轨道移动速度为0.6 mm/s；进样装置为12通道自动进样模块(图1)；进样体积为3 μL。质谱条件：正离子扫描模式，多反应检测扫描(MRM)模式；去簇电压为80 V；碰撞能量为17 V。
1.4 计算方法
1.4.1 基质效应的计算[12]
通过公式(1)计算样品对目标离子强度的基质效应。
基质效应
(1)
1.4.2 辣椒素类总量计算[13]
辣椒素类总量以辣椒素和二氢辣椒素含量之和除以0.9计算。
1.4.3 辣度计算及分级标准[13]
本试验以国际通用的斯科维尔指数(scoville heat units, SHU)表示样品的辣度，其计算如公式(2)所示：
SHU=W×0.9×(1.61×103)+W×0.1×(9.3×103)
(2)
式中：W，试样中辣椒素总量,g/kg。
按照湖南老窑地方标准，辣度分级根据斯科维尔指数(SHU)换算，可将辣度分为十级[14]。
1.5 数据处理
试验数据采用SPSS统计软件进行分析，方差分析(ANOVA)用于显著性分析，以P<0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 辣椒素和二氢辣椒素的裂解行为
为了降低辣椒素和二氢辣椒素的检出限，采用多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)进行质谱定量检测。首先分别对它们的质谱裂解行为进行研究，确定合适的定量检测离子对。预试验表明，辣椒素类成分在正离子模式下的信号强度高于负离子模式，因此，本研究均采用质谱正离子模式。辣椒素二级质谱裂解行为如图2-a所示，辣椒素的分子离子峰为m/z 306。m/z 137为最强信号峰，是由辣椒素C7-N8位置断裂，经过芳香环的双键重排导致的。m/z 170是辣椒素脱去芳香环部分后剩余的酰基链部分；m/z 170脱去尾端的铵根离子得到m/z 153。m/z 182是苄基碳键断裂得到的酰基残基分子。二氢辣椒碱的最强信号峰也是m/z 137，其裂解行为与辣椒素相似。本研究结果与辣椒素和二氢辣椒素在大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical iosziaa-lion, APCI)、电喷雾电离源(electrospray ionization, ESI)下的裂解规律非常相似[15-16]，且背景杂峰较少，有利于谱图的定性解析。因此，辣椒素选择离子对m/z 306→m/z 137进行定量检测，而二氢辣椒素选择离子对m/z 308→m/z 137进行多反应监测定量检测。
图2 辣椒素(a)和二氢辣椒素(b)标准品的二级质谱图
Fig.2 DART-MS/MS spectra of capsaicin (a) and dihydrocapsaicin (b) standards solution
2.2 DART-MS条件优化
在DART-MS中，解吸气体的温度是分析物电离的关键因素之一[17]。本研究分别考察了气体解吸温度对辣椒素和二氢辣椒素一级母离子响应强度的影响，结果见图3-a。如图3-a所示，气体温度从200 ℃逐渐升至450 ℃时，辣椒素和二氢辣椒素的响应强度逐渐升高；当温度从450 ℃升至550 ℃时，辣椒素和二氢辣椒素的响应强度有所下降，原因可能是辣椒素和二氢辣椒素在高温下开始发生热降解。综合考虑，选用450 ℃为解吸气体的最优温度。
图3 辣椒素和二氢辣椒素的响应强度随解吸气体(He)温度(a)和栅网电极电压(b)变化的趋势
Fig.3 Effect of gas heater temperature(a) and grid voltage(b) on peak intensity of capsaicin and dihydrocapsaicin
栅网电极电压对分析物的电离过程也具有重要作用，它对消除大气中的反应物离子如NO+以及减少质谱图上的“化学背景”具有显著影响[18]。本试验考察了100～400 V的栅网电极电压对待测组分响应强度的影响，结果见图3-b。如图3-b所示，辣椒素的响应强度在100～400 V范围内先呈上升趋势，到达峰值后逐渐降低。二氢辣椒碱的响应强度在250 V时最大。综合考虑，选择200 V为最优的栅网电极电压。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性方程、相关系数、检出限及定量限
以峰面积为纵坐标，辣椒素和二氢辣椒素含量为横坐标进行线性回归分析，得到标准曲线(图4)和相关系数R2(表1)。辣椒素和二氢辣椒素均在0.5～50 μg/mL范围内，相关系数均>0.96，表明线性关系良好。检出限均为0.1 μg/g，定量限均为0.5 μg/g。与LC-MS/MS方法测得的检出限与定量限分别为0.075～0.15 mg/kg、0.25～0.5 mg/kg差异不明显[19]。这表明本方法能有效地对辣椒素和二氢辣椒素进行检测，具有良好的灵敏度。
2.3.2 基质效应
基质效应是指除样品中被分析物以外的组分和目标组分共同进入离子源，在电离过程中对目标物电离产生离子增强或者抑制效应[20]。基质效应在定量分析中可能会严重影响结果的精密度、准确性，在定性分析中发生基质抑制效应可降低其检出限，影响方法的灵敏度，因此需要研究DART-MS方法的基质效应。
图4 辣椒素(a)和二氢辣椒素(b)标准曲线
Fig.4 The standard curve of capsaicin (a) and dihydro-capsaicin (b) determined by DART-MS
由于缺少商业化的空白基质(不含辣椒素或二氢辣椒素的辣椒)，本研究采用近似的空白基质。即采用样品提取溶液直接溶解辣椒素或二氢辣椒素标准品，然后使用样品提取溶液对其进行连续稀释。最终泡椒中辣椒素和二氢辣椒素加标质量浓度范围为5.30～53.0 μg/mL，郫县豆瓣中辣椒素和二氢辣椒素加标质量浓度范围为0.5～12.5 μg/mL。
根据研究，当|基质效应|≤20时，可以认为几乎没有基质效应[21]。由表1可知，郫县豆瓣中辣椒素和二氢辣椒素的基质效应分别为-6.72%和-11.83%，泡椒中辣椒素和二氢辣椒素的基质效应分别为-11.06%和-13.63%，表明泡椒和郫县豆瓣酱中的基质对辣椒素和二氢辣椒素含量有轻微抑制作用，但是影响不显著，可以直接采用辣椒素和二氢辣椒素的标准曲线进行定量分析。
表1 方法的线性参数、基质效应、检出限及定量限
Table 1 Linear parameters, matrix effect, detection limit and quantification limit of the method
分析物基质校准曲线R2基质效应/%LOD/(μg·g-1)LOQ/(μg·g-1)乙腈y=51492x+16622100.9634-0.10.5辣椒素泡椒y=44474x+40205500.9883-11.06--郫县豆瓣y=48034x+2635750.9982-6.72--乙腈y=56344x+22849100.9765-0.10.5二氢辣椒素泡椒y=63353x+31653800.9847-13.63--郫县豆瓣y=63027x+1250080.9977-11.83--
2.3.3 回收率与精密度
在上述优化好的试验条件下，在样品中添加高、中、低3个浓度的目标分析物(表2)，每个浓度平行测定6次，测定加标回收率和精密度。
表2 方法的加标回收率和精密度测定结果(n=6)
Table 2 Results of standard recovery rate and precision of the method
目标物泡椒郫县豆瓣4号加标量/(μg·g-1)平均回收率/%RSD/%加标量/(μg·g-1)平均回收率/%RSD/%辣椒素50.079.742.8012.581.494.9625.091.355.025.090.235.695.097.748.890.594.650.80二氢辣椒素50.098.712.6912.598.563.4710.092.619.545.090.286.645.095.603.140.585.605.21
精密度用相对标准偏差表示。结果如表2所示，整体上辣椒素的平均回收率在79.74%～97.74%，RSD在0.80%～8.89%，二氢辣椒素的平均回收率在85.60%～98.71%，RSD在2.69%～9.54%。与LC-MS/MS方法测得的回收率与精密度分别为96.8%～104.0%、1.5%～4.5%相比，DART-MS方法的准确性和稳定性稍差[19]。但根据SANTE/11945/2015欧盟指南[22]，回收率在70%～120%，RSD≤20%表明具有较好的回收率和精密度。因此，DART-MS方法的准确性和稳定性较好，可用于快速检测样品中辣椒素和二氢辣椒素的含量。
2.4 辣椒及其制品中辣度的测定
采用上述建立的DART-MS/MS快检方法对4种辣椒以及5种辣椒制品中的辣椒素和二氢辣椒素含量进行测定(表3)。结果表明，4种鲜辣椒样品均具有显著差异(P<0.05)，辣度分级在6～8级。其中，红色二荆条辣椒的辣度最高，辣度最低的是美人椒。辣度最高的样品是辣度最低样品的3.74倍。人们普遍认为小米椒辣度最高，有研究通过高效液相法测定小米椒、二荆条辣椒中辣椒素总含量分别为3.8～6.58 mg/g、0.45 mg/g，小米椒比二荆条辣椒辣度高14倍以上[23]。而本试验结果表明，小米椒的辣度不及红色二荆条辣椒。有研究采用高效液相色谱法测定不同种源地、椒形的辣椒中的辣椒素含量，发现种植在炎热、潮湿地域的辣椒品种的辣度(7～10级)极显著高于干燥、日温差较大地域(5～6级)；小型椒(米椒、泡椒和朝天椒)辣度(9级)大于线椒(8级)[24]。由此可知辣椒辣度受多方面因素的影响，在评价辣度时需综合考虑。在辣椒制品中，泡椒是由野山椒泡制发酵而成，其辣度达到7级。郫县豆瓣4的辣度是郫县豆瓣1的2倍以上。目前郫县豆瓣标签中尚无辣度标准，豆瓣酱的辣味主要来源于原料中的辣椒，不同厂家的原料来源、配比、制作工艺和发酵时间等因素都会影响辣椒素含量。因此，需要综合考虑多种因素对辣椒制品中辣度的影响。
表3 辣椒及其制品中辣椒素和二氢辣椒素的含量
Table 3 Contents of capsaicin and dihydrocapsaicin of capsicum and products
品种辣椒素/(g·kg-1)二氢辣椒素/(g·kg-1)辣椒素总含量/(g·kg-1)辣度(SHU)辣度分级辣椒二荆条(青)0.8303±0.0407c0.3874±0.0366c1.3530±0.0859c20864±1325c7级二荆条(红)1.7682±0.0322a1.1342±0.0040a3.2250±0.0326a49729±503a8级美人椒0.5166±0.0253d0.2592±0.0145e0.8620±0.0430e13292±662e6级小米椒1.1207±0.0121b0.6352±0.0159b1.9510±0.0046b30084±71b8级辣椒制品泡椒0.7896±0.0137c0.3209±0.0121d1.2339±0.0282d19027±434d7级郫县豆瓣10.0440±0.0008e0.02178±0.0012f0.0731±0.0023f1128±35f3级郫县豆瓣20.0791±0.0022e0.0502±0.0021f0.1457±0.0024f2247±38f4级郫县豆瓣30.0632±0.0005e0.0419±0.0010f0.1174±0.0006f1809±9f4级郫县豆瓣40.0887±0.0002e0.0641±0.0011f0.1699±0.0009f2620±14f5级
注：同列肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
3 结论
首次采用DART-MS/MS技术，建立了快速、简便、稳定性较好地检测辣椒及其制品中的辣椒素类物质的方法，并进行了方法学验证。结果表明，DART-MS方法可以用于快速检测辣椒及其制品的辣度。由于辣椒素与二氢辣椒素属于同系物，其理化性质相近，传统高效液相色谱检测需要较长的色谱分离过程才能将其分开，单次进样分析一般需要10～40 min[4,25]。而DART-MS方法无前期分离过程，直接进样，单次样品测定时间小于30 s，可以大幅缩短分析周期。此外，DART-MS方法与传统的色谱方法相比，具有操作简单、环保(无需有机溶剂作为流动相)、谱图简洁等优点。研究结果对辣椒原料及其加工制品的过程监控、工艺优化及质量标准提升等具有重要意义。
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